Effekten af ​​inkorporering af kobber og zink nanopartikler i tandklæbemidler (1170575)

Generelt mål At evaluere indflydelsen af ​​inkorporering af kobber eller zink nanopartikler i en dental klæbemiddel på dets antimikrobielle virkning og deres indflydelse på dentin matrix metalloproteaser aktivitet. At analysere klæbemiddels mekaniske egenskaber og biokompatibilitet Specifikke mål

1. At udvikle og strukturelt karakterisere en dental klæbemiddel doteret med kobber eller zink nanopartikler.

   1.1. Fremstilling af klæbende nanokompositter; 1.2. Strukturel karakterisering af klæbende nanokompositter.

2. At vurdere mekaniske, biokemiske og funktionelle virkninger af klæbende nanokompositter in vitro. Analyser vil blive behandlet, der sammenligner tilsætning af kontrolklæbemiddel eller klæbemidlet doteret med enten kobber eller zink på friske nyligt ekstraherede tænder.(f. vivo fase) 2.1. For at teste den antimikrobielle aktivitet af klæbemiddel; 2. 2. At studere indflydelsen af ​​adhæsive nanokompositter på matrix metalloproteaser niveauer og/eller aktivitet;2.3. For at vurdere limens mekaniske egenskaber;2.4. At vurdere biokompatibilitet. Levedygtighedsassays i primær dyrket gingival fibroblast vil blive behandlet.
3. For at evaluere in vivo model (klinisk fase) antimikrobielle egenskaber, matrix metalloproteaser og cathepsin B niveauer og/eller aktivitet, biokompatibilitet af adhæsive nanokompositter in vivo og mekaniske egenskaber. Præmolarer, der er indiceret til ekstraktion, vil blive restaureret ved hjælp af enten traditionel klæbemiddel eller den klæbende nanokomposit. Efter en måned vil præmolarer blive ekstraheret og analyseret som beskrevet.

3.1. For at bestemme overfladeantimikrobielle egenskaber af klæbende nanokompositter; 3.2. At vurdere matrixmetalloproteaser og cathepsin B-niveauer og/eller aktivitet i udblødt dentinvæv;3.3 For at bestemme biokompatibilitet. Tandpulp vil blive opnået fra ekstraherede præmolarer, og molekylære markører for cellelevedygtighed eller celleskade vil blive behandlet af adhæsive nanokompositter;3.4 For at evaluere limens mekaniske egenskaber.

METODER

1. At udvikle en dental klæbemiddel doteret med kobber eller zink nanopartikler. 1.1. Forberedelse af klæbende nanokompositter (1): CuNP/adhæsive nanokompositter vil blive fremstillet ved hjælp af en-flaske klæbemiddelsystemet Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Dette acetonebaserede klæbemiddel indeholder en blanding af urethan-dimethacrylat og sur monomer dipentaerythritolpentaacrylatemonophosphat. For at forberede de klæbende nanokompositter vil passende mængder af nanopartikelpulver (CuNp og ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chile) vejes og tilsættes direkte til klæbemiddelflasken under konstant magnetisk omrøring. Suspensionen vil derefter blive yderligere dispergeret i et ultralydsbad ved 37°C i 10 minutter. Klæbende nanokompositter vil blive fremstillet med CuNP-indhold i intervallet 0,015 til 0,045 vægt% ifølge tidligere data fra vores laboratorier. De fem koncentrationer af Cu- og Zn-doterede klæbemidler vil være 0,0150%, 0,0075% og 0,00038% (koncentrationer med antibakterielle aktive egenskaber baseret på vores tidligere data (Cu 1-2-3 og Zn 1-2-3).

   1.2. Strukturel karakterisering af klæbende nanokompositter (1): Morfologi og sammensætning af de klæbende nanokompositmaterialer vil blive karakteriseret ved SEM-EDX i tilbagespredt elektrontilstand for at producere fasekontrast og AFM-mikroskopi. Den kemiske struktur af polymermatrixen og resterende monomerindhold vil blive analyseret ved svækket totalreflektion Fourier transform infrarød og Raman spektroskopier. Den resterende monomer vil blive analyseret under hensyntagen til carbon-til-carbon dobbeltbindingsvibrationen af ​​acrylmonomeren i området 1684 - 1636 cm-1.

2. At vurdere antibakterielle, mekaniske, biokemiske og funktionelle virkninger af klæbende nanokompositter in vitro og ex vivo. Analyser vil blive behandlet med sammenligning af tilsætning af almindeligt klæbemiddel eller klæbemidlet doteret med enten kobber eller zink.

   2.1. Analyse af antimikrobielle egenskaber af klæbende nanokomposit (2) 2.1.1 Antibakteriel aktivitet: Kort fortalt vil 10 mm skiver med en tykkelse på 2 mm blive fremstillet ved hjælp af harpikskomposit (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) og enten efterladt ubelagt (kontrol) eller belagt med klæbemidlet Prime&Bond 2.1 og tilsvarende eksperimentel aktivitet. klæbemiddelblandinger af tolv grupper og polymeriseret i henhold til fabrikantens anbefalinger i 10 sekunder ved hjælp af en LED-lyshærdningsenhed (Radii Cal, SDI, AU) ved en effekttæthed på 1000 mW/cm2. Amalgamskiver (Contour; Kerr, Orange, CA) vil blive fremstillet som tidligere beskrevet og brugt som en yderligere positiv kontrol. I alt fjorten undersøgelsesgrupper med otte prøver pr. gruppe vil blive evalueret i denne del af eksperimentet: (1) kontrol; (2) amalgam (metallisk materiale brugt som positiv kontrol) og 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 og 8) Zn3. For at sikre fjernelse af upolymeriseret monomer nedsænkes skiverne i 10 mL sterilt deioniseret vand og omrøres i 2 timer ved 200 rpm og 37,8°C, hvorefter skiverne efterlades til tørre ved stuetemperatur i mindst 24 timer. Skiverne steriliseres ved inkubation i 70 % ethanol i 10 minutter og tørres derefter aseptisk i minimum 48 timer. Overfladen af ​​hver disk vil blive inokuleret med 100 ml af en defineret levedygtig koncentration på 1 108 celler/ml anaerobt dyrkede Streptococcus mutans, ATCC1 25175 i hjernehjerteinfusion (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) broth. . For at bestemme den levedygtige cellekoncentration for hver behandlingsgruppe i kolonidannende enheder pr. ml (CFU/ml), vil de podede skiver være anaerobt, hvorefter det samlede antal genvundne CFU'er vil blive bestemt.

   2.2. In vitro og ex vivo evaluering af MMP'ers aktivitet (1-2) 2.2.1 MMP aktivitetsinhiberingsassay (in vitro): Kvantitativ MMP-2, MMP-8 og MMP-9 aktivitet in vitro vil blive bestemt ved kommerciel MMP fluorometrisk assay kits (SensoLyte assay kits; AnaSpec, San Jose, CA, USA) til screening af anti-MMP aktiviteten. Cu- og ZnNP-doterede klæbemidler i forskellige koncentrationer og kontroller uden Cu- eller ZnNP-klæbemidler vil blive tilsat til reaktionsbufferen, og analysen vil blive udført i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Efter spaltning i 2 separate fragmenter med MMP, vil fluorescensen af ​​5-FAM blive overvåget af en fluorescerende mikropladelæser (Sinergy TM).

   2.2.2 Bestemmelse af MMP-aktivitet og -niveauer (ex vivo dentinprøver med prøver opnået fra restaurerede tænder med dopede klæbemidler og kontrol): Femogtyve (n=5) ekstraherede cariesfrie humane tredje kindtænder vil blive indsamlet efter indhentning af patienternes informerede samtykke. Tænderne desinficeres i 0,5 % kloramin, opbevares i destilleret vand og bruges inden for seks måneder efter ekstraktion. Et lille okklusalt præparat med standardiserede dimensioner på 3x3x5 mm vil blive lavet af en kalibreret operatør i midten af ​​tanden ved hjælp af en cylinderdiamantbor (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) og en højhastigheds håndstykke, mens du giver luft-vand-spray. Efter færdiggørelse af hulrumsforberedelsen vil den blive fyldt med harpikskomposit (Filtek Supreme; 3M ESPE). De eksperimentelle klæbemidler, der er doteret med Cu og Zn, vil blive brugt i henhold til producentens anvisninger, og det ikke-doterede klæbemiddel vil blive brugt som kontrol på en homolog øvre præmolar. Harpikskompositten (Filtek Supreme; 3M ESPE) vil blive påført ved hjælp af den trinvise teknik. Emaljen fjernes fuldstændigt med en langsom hastighed diamantsav (Remet, Bologna, Italien) under saltvandsvanding, og tænderne vil blive sektioneret for at opnå 1 mm tykke koronale dentinwafers, som efterfølgende vil blive pulveriseret til pulver med en stål hammer. Dentinpulver vil derefter blive delt ligeligt og demineraliseret (ved 4°C i 24 timer under omrøring) i en af ​​følgende vandopløsninger: (1) 0,87 M eddikesyre, pH = 2,3; (2) 0,26 M citronsyre, pH = 2,3; eller (3) 0,5 M EDTA, pH = 6,4; eller (4) 0,5 M EGTA, pH = 6,4. Enzymekstraktion af det demineraliserede dentinpulver vil blive suspenderet i ekstraktionsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, indeholdende 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2, 0,02 % NaN3) og EDTA-fri proteaseinhibitorcocktail (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Prøverne vil derefter blive behandlet med ultralyd ved 40 W output i 3 bursts af hver 10 sekunder ved 4°C (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA). Hætteglassene vil blive centrifugeret ved 18.000 rpm i 30 minutter ved 4°C, og supernatanterne vil blive opsamlet. Alle proteiner, der er til stede i supernatanterne, vil blive udfældet ved 4°C ved tilsætning af pulveriseret ammoniumsulfat (vægt/volumen) for at opnå en slutkoncentration på 85% og pH 7,0. Bundfaldet vil blive opsamlet ved centrifugering ved 24.000 rpm i 30 minutter ved 4°C, genopløst i en 10-folds fortynding i ekstraktionsbuffer, dialyseret gennem en 30 kDa membran mod ekstraktionsbuffer natten over og opbevaret ved 4°C indtil analysering. Herefter vil dentinpulveret blive analyseret for at vurdere MMP-2, MMP-9 og cathepsin B aktivitetsniveauer målt ved gelatine zymografi og for at vurdere MMP-8 ved kollagen zymografi, som tidligere beskrevet.56 Densitometri vil blive udtrykt som du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA). Kort fortalt vil dentinpulverprøver blive udsat for elektroforese under ikke-reducerende denaturerende betingelser i SDS/PAGE-geler indeholdende 1 mg/ml gelatine eller 0,1 mg/ml kollagen som substrater. De vil derefter blive gennemblødt to gange i 2,5 % Triton X-100 og inkuberet i 17 timer i udviklingsbuffer (20 mM Tris pH 7,4 og 5 mM CaCl2), farvet med Coomassie Brilliant Blue R-250 og affarvet med 10 % eddikesyre og 20% methanolopløsning. Niveauer af MMP-2, MMP-8, MMP-9, cathepsin B og ICTP (som en markør for dentinkollagenhydrolyse) vil blive bestemt enten ved et kommercielt ELISA-kit eller multiplex immunoassays (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, for Luminex-teknologi) i henhold til producentens anbefalinger.

   2.3. Test af mekaniske egenskaber af adhæsive nanokompositter (1-2) Bindingsstyrke 2.3.1 Tandvalg og -forberedelse: Halvfjerds ekstraherede cariesfrie mennesketredje kindtænder vil blive indsamlet efter indhentning af patienters informerede samtykke fra tandklinikken ved Chiles universitet (≈2000 tredjedel) molære ekstraktioner om året, hvilket sikrer tilgængeligheden af ​​disse tænder, der normalt kasseres). Tænderne desinficeres i 0,5 % kloramin, opbevares i destilleret vand og bruges inden for seks måneder efter ekstraktion. En flad dentinoverflade vil blive blotlagt efter vådslibning af den okklusale emalje med et #180 SiC-papir. De eksponerede dentinoverflader vil blive poleret yderligere med et vådt #600 SiC-papir i 60 sekunder for at standardisere udstrygningslaget.

   2.3.2 Eksperimentelt design: Tænderne vil blive tilfældigt fordelt i tolv grupper af fem (6 grupper pr. klæbemiddel), som hver vil blive behandlet med en forskellig koncentration af doteret klæbemiddel. Som kontrol uden NP'er af systemet Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE) vil blive brugt.

   2.3.3. Restaureringsprocedure og præparatforberedelse: Klæbemiddelsystemerne påføres strengt i overensstemmelse med den respektive producents instruktioner.

   2.3.4 Efter bindingsprocedurer: Alle tænder vil modtage en mikrohybrid-komposit-restaurering i to trin på 2 mm. Hvert trin vil blive lyspolymeriseret i 40 sekunder ved hjælp af en LED-lyshærdende enhed ved indstillingen 1200 mW/cm2 (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australien). Restaurerede tænder vil blive opbevaret i destilleret vand ved 37°C i 24 timer og derefter sektioneret på langs i mesio-distale og buccal-linguale retninger på tværs af den bundne grænseflade ved hjælp af en langsom hastighed diamantsav (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) for at opnå 15 til 20 harpiks-dentinstifter, hver med et tværsnitsareal på ca. 0,8 mm2 målt med en digital skydelære (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokyo, Japan). Hver prøve fra hver tand vil blive evalueret for mikrotrækbinding styrke (mTBS) bortset fra seks tilfældigt udvalgte harpiks-dentin-bundne prøver, som vil blive opdelt til måling af in situ grad af konvertering (DC) og nanolækage (NL).

   2.3.5. Mikrotrækbindingsstyrketest: Resin-dentin-bundne pinde vil blive fastgjort til en Geraldeli's jig ved hjælp af cyanoacrylat-klæbemiddel og testet under spænding (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brasilien) ved 0,5 mm/min indtil fejl. mTBS-værdierne vil blive beregnet ved at dividere belastningen ved svigt med tværsnitsbindingsarealet. Prøvernes svigttilstand vil blive klassificeret som kohæsiv (fejl udelukkende i dentinet eller harpikskompositten), klæbemiddel (svigt ved harpiks/dentin-grænsefladen) eller blandet (svigt ved harpiks/dentin-grænsefladen inklusive kohæsivt svigt af de tilstødende substrater ). Klassificering vil blive udført under et stereomikroskop (SZ40; Olympus, Tokyo, Japan) ved 100x forstørrelse. Prøver med præmature fejl (PF'er) vil blive inkluderet i gennemsnittet.

   2.3.6. Omdannelsesgrad in situ: Tre harpiks-dentin-bundne pinde fra hver tand vil blive vådpoleret med #1500, #2000 og #2500 SiC-papir. De vil derefter blive renset med ultralyd i 20 minutter og opbevaret i vand ved 37,8°C i 24 timer før måling af DC. Mikro-Raman spektroskopianalyse vil blive udført ved brug af Sentera udstyr (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Wu¨rttemberg, Tyskland). Kalibrering af mikro-Raman-spektrometeret udføres ved at nulstille det til nul og derefter måle koefficienten for en siliciumprøve. Prøver vil blive analyseret ved hjælp af følgende mikro-Raman-parametre: 20 mW neonlaser ved 532 nm, rumlig opløsning ved 3 mm, spektral opløsning ved 5 cm-1, akkumuleringstid ved 30 sekunder med 6 co-additioner og forstørrelse ved 110x ( Olympus UK, London, UK) til en strålediameter på 1 mm. Spektra vil blive taget ved dentin-adhæsive-grænsefladen på tre forskellige steder i den intertubulære dentin for hver harpiks-dentin-bundet stick. Spektre af upolymeriserede klæbemidler vil blive brugt som referencer. Efterbehandling af spektre vil blive udført ved hjælp af den dedikerede Opus Spectroscopy Software version 6.5. Forholdet mellem dobbeltbindingsindhold af monomer og polymer i klæbemidlet vil blive beregnet: hvor ''R'' er forholdet mellem alifatiske og aromatiske toparealer ved 1639 cm-1 og 1609 cm-1 i polymeriserede og upolymeriserede klæbemidler. In situ DC af alle harpiks-dentin-bundne pinde fra den samme tand vil blive beregnet som gennemsnit til statistiske formål.

   2.3.7. Evaluering af nanolækage: Tre harpiksbundne pinde fra hver tand vil blive anbragt i ammoniaksølvnitrat fremstillet i henhold til protokollen beskrevet af Tay et al.57 og opbevaret i mørke i 24 timer. De vil derefter blive skyllet grundigt i destilleret vand og nedsænket i fotofremkalderopløsning i 8 timer under et fluorescerende lys for at reducere sølvioner til metalliske sølvkorn i hulrummene langs den bundne grænseflade. Prøver vil blive vådpoleret med #600, #1000, #1200, #1500, #2000 og #2500 SiC-papir og med 1- og 0,25 mm diamantpasta (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) ved hjælp af en pudseklud. De vil blive renset med ultralyd, lufttørret, monteret på stubbe og belagt med kulguld (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). Harpiks-dentin-grænseflader vil blive analyseret i et felt-emission scanningselektronmikroskop, der drives i tilbagespredt tilstand (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, UK). Der vil blive taget tre billeder af hver harpiks-dentin-bundet pind. Den relative procentdel af NL i de klæbende og hybride lag i hver prøve vil blive målt i alle billeder ved hjælp af Image J-software58 af en blindet forsker. Værdier fra den samme prøve beregnes som gennemsnit, og gennemsnittet af NL for alle pinde fra den samme tand vil være gennemsnittet.

   2.4 Vurder biokompatibilitet, levedygtighedsassays i primært dyrket gingival fibroblast 2.4.1 Cellekulturer: Primære kulturer af humane fibroblaster vil blive opnået ved eksplantationsmetoden fra det retromolære væv fra tredje molarer fra tre voksne mandlige individer.

   Saos-2 human osteosarkomcellelinje, der almindeligvis anvendes til at vurdere biokompatibilitet mellem osteoblast og biomaterialer, vil blive dyrket som beskrevet af Alcaide et al.60.

   Celler vil blive podet i en 96-brønds plade med en tæthed på 3000 celler pr. brønd. Efter 24 timer vil kontrolkulturmediet blive erstattet af 100 µl forskellige fortyndinger af det korrekte klæbemiddel (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). Pladerne inkuberes i 24 timer, 48 timer og 72 timer i en 37 timer. °C inkubator (5 % CO2) forud for levedygtigheds- eller celledødsassays.

   2.4.2 Cellelevedygtighed og cellecyklusanalyse: Primære kulturer af humane fibroblaster vil blive opnået ved eksplantationsmetoden fra det retromolære væv fra tredje molarer fra tre voksne mandlige individer.

   Saos-2 human osteosarkomcellelinje, der almindeligvis anvendes til at vurdere biokompatibilitet mellem osteoblast og biomaterialer, vil blive dyrket som beskrevet af Alcaide et al.60.

   Celler vil blive podet i en 96-brønds plade med en tæthed på 3000 celler pr. brønd. Efter 24 timer vil kontrolkulturmediet blive erstattet af 100 µl forskellige fortyndinger af det korrekte klæbemiddel (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). Pladerne inkuberes i 24 timer, 48 timer og 72 timer i en 37 timer. °C inkubator (5 % CO2) forud for levedygtigheds- eller celledødsassays.

   2.4.3 Kvantificering af levedygtige, tidlige apoptotiske, sen apoptotiske og nekrotiske celler ved fluorescensmikroskopi: Protokol beskrevet af Kasibhatla et al. vil blive brugt 61. Celler vil blive farvet med en Acridine Orange/Ethidium Bromide-opløsning (AO/EB) og vil blive undersøgt ved fluorescensmikroskopi. AO vil farve både levende og døde celler. EB vil kun farve celler, der har mistet membranintegritet. Levende celler vil fremstå ensartet grønne. Tidlige apoptotiske celler vil farve grønne og indeholde lyse grønne prikker i kernerne som en konsekvens af kromatinkondensering og nuklear fragmentering. Sene apoptotiske celler vil også inkorporere ethidiumbromid og farves derfor orange, men i modsætning til nekrotiske celler vil de sene apoptotiske celler vise kondenserede og ofte fragmenterede kerner. Nekrotiske celler farver orange, men har en nuklear morfologi, der ligner levedygtige cellers, uden kondenseret kromatin61.

   2.4.4 Påvisning af apoptose ved phosphatidylserin-eksponering, DNA-laddering og apoptotisk mRNA og proteinkvantificering: Eksponeringen af ​​phosphatidylserin på ydersiden af ​​plasmamembranen vil blive analyseret som et tidligt signal om apoptose ved farvning med annexin V (A5)-in allophycocyan), som beskrevet i Alcaide et al.60. Fluorescens af probe APC vil blive analyseret ved flowcytometri.

   Den apoptotiske DNA-stige-analyse vil blive udført ved hjælp af et DNA-stigesæt (Roche, Tyskland).

   mRNA- og proteinniveauer for tumorsuppressor (p53), pro-apoptotiske (bax, caspase 3) og anti-apoptotiske (bcl-2) mediatorer vil blive behandlet ved hjælp af kvantitativ PCR og immunoblot.

   2.4.5 Evaluering af autofagi: For at teste formodede virkninger af metal-NP'er på celleautofagi vil forskellige autofagi-markører blive behandlet. Autofagisk flux og p62-niveau vil blive detekteret ved western blot, og autophagosomer vil blive visualiseret ved fluorescensmikroskopi ved at tælle LC3 positive puncta63.

3. Evaluering af metalloproteaseniveauer og/eller aktivitet og biokompatibilitet af adhæsive nanokompositter in vivo.

   Præmolarer, der er indiceret til ekstraktion, vil blive restaureret ved hjælp af enten traditionel klæbemiddel eller den klæbende nanokomposit. Efter en måned (tilbagekaldelse ved telefonisk kontakt og efter klinikundersøgelsen), vil patienterne blive undersøgt, og præmolarer vil blive ekstraheret og analyseret af blinde-evaluatorer (kodificeret med tal) på alle stadier som beskrevet. Udtrækninger af præmolarer vil blive udført af tandlægelærere, enhver effekt efter proceduren vil blive antaget og løst af forskerholdet, procedurer for patienter er gratis, og alt vil blive nøje overholdt anbefalingerne fra fakultetets etiske udvalg tandlæge ved universitetet i Chile.

   3.1 In vivo-evaluering af adhæsive nanokompositter: Halvfjerds frivillige, som kræver ekstraktion af den øverste højre og venstre første præmolar (n = 35 pr. gruppe) af ortodontiske årsager, vil blive udvalgt fra Ortodontic Specialization Program i klinikken ved University of Chile (der vil være en rekrutteringsperiode på 3 måneder med en co-investigator ansvarlig for monitorering (CB)). Inklusionskriterier vil være (1) behandlingsplaner, der indikerer præmolære ekstraktioner af ortodontiske årsager, (2) tilstedeværelse af sunde, intakte, ikke-karierede, ikke-genoprettede og fuldt udbrudte behandlingstænder og (3) patienter med velkontrollerede helbredstilstande som gør det muligt at udføre alle procedurer i forskningen med minimal risiko. Eksklusionskriterier vil være (1) patienter, der ikke accepterer at melde sig frivilligt til undersøgelsen og (2) patienter, der ikke opfylder alle inklusionskriterierne. En lille okklusal forberedelse vil blive lavet af en kalibreret operatør i midten af ​​tanden ved hjælp af en cylinderdiamant bur (.63109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) og et højhastighedshåndstykke, mens det giver luft-vand-spray med standardiserede dimensioner på 3x3x5 mm. Efter færdiggørelse af hulrumsforberedelsen vil den blive fyldt med harpikskomposit (Filtek Supreme; 3M ESPE). De eksperimentelle klæbemidler doteret med Cu og Zn vil blive brugt i henhold til producentens anvisninger, og det ikke-doterede klæbemiddel vil blive brugt som kontrol på den homologe øvre præmolar og design ved simpel randomisering af parallelle grupper. Harpikskompositten (Filtek Supreme; 3M ESPE) påføres ved hjælp af den trinvise teknik, og til sidst påføres et lag klæbemiddel som en overflade af kompositrestaurering og polymeriseres i 10 sek. Okklusionen vil blive kontrolleret, og restaureringerne vil blive afsluttet og poleret efter producentens instruktioner. Efterfølgende vil polering og afsluttende finish bruges til at påføre et lag klæbemiddel på den endelige restaurering, som polymeriseres i 10 sekunder (Raddi Cal, SDI, AU). En tand ad gangen vil blive trukket ud en måned efter, at restaureringerne er udført. Patienten vil modtage infiltrativ og intraligamental anæstesi (ca. 1,8 ml 2 % Mepivacaine (36 mg)) med epinephrin i forholdet 1:100.000 (18 mg). Derefter vil tænderne blive udsat for test.

   3.2 Bestem overfladeantimikrobielle egenskaber af klæbende nanokompositter: For at vurdere de antibakterielle overfladeegenskaber af doterede klæbemidler vil et sidste lag klæbemidler blive påført over den endelige overflade af restaureringer i en in vivo-model. Proceduren vil blive brugt til at vurdere antallet af CFU af S.Mutans på kompositoverflader (Main Outcome). Forud for prøvetagning af biofilmen, vil bakker blive forberedt til at printe biofilmen over restaureringerne. Til denne applikation vil vi bruge engangs fluoridgelpåføringsbakker (Deepak Products Inc., Miami, USA), som hver vil blive steriliseret i en biosikkerhedshætte (Esco Technologies Inc., Harboro, USA) under ultraviolet lys i 30 minutter. Hver bakke vil derefter blive fyldt med 7,5 ml TYCSB-agar (kasein, gærekstrakt, L-cystein, saccharose, bacitracin) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA), som er et selektivt medium for S. mutans. Efterfølgende, for at individualisere prøveindsamlingsteknikken, vil bakkerne blive skåret til, så de ikke passer til mere end 3 tænder. Umiddelbart herefter lægges bakkerne i sterile petri-plader og opbevares i forseglede plastikposer i køleskab. Før brug placeres bakkerne i en inkubator/komfur (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Korea) i 24 timer ved 37 °C som en kvalitetskontrolforanstaltning. Den tredje og fjerde operatør vil udføre prøvetagningen, som vil blive udført mellem 11:00-13:00 for at give mulighed for biofilm-reorganisering efter morgenbørstning. Prøveudtagningen vil blive udført af en blind operatør, der forsigtigt presser bakken i 20 s over RC-restaureringen, efterfulgt af homolog RC-restaurering med og uden Cu- eller Zn-doteret klæbemiddel.

   Efter at prøvebakkerne er opbevaret i sterile petri-plader, vil de blive transporteret ved 4 °C og derefter inkuberet ved 37 °C i en mikroaerofil (krukkelys CO2 10%) i 48 timer. Optællingen af ​​S.mutans vil blive udført af den fjerde operatør, der vil blive blændet til bakken blev brugt til at udskrive RC-restaureringerne. Senere vil der blive udført Gram-farvning for at bestemme mikromorfologien af ​​kolonierne. S.mutans-antallet vil blive udtrykt i kolonidannende enheder (CFU) af S.mutans fra pladerne og bakkerne med TYCSB-agaren. Udvalgte kolonier, der vil være kompatible med S.mutans adhæsion og morfologiske karakteristika, vil blive suspenderet i Todd-Hewitt bouillon (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) og inkuberet ved 37 °C i 48 timer. Kolonierne vil derefter blive udsat for biokemiske tests for at identificere arten af ​​S. mutans og for at skelne den fra S. sobrinus. De biokemiske tests inkluderer raffinosefermentering, melibiosefermentering og esculinhydrolysetests. Et positivt resultat for alle tre test indikerer tilstedeværelsen af ​​S. mutans.

   3.3 Vurdering af metalloproteaseniveauer og/eller aktivitet i udblødt dentinvæv vil bruge en metode svarende til den i 2.4.2 3.3.1 Zymografi til in situ for at vurdere aktiviteterne af MMP 2 og 9 (udfald): En metode beskrevet af Mazzoni et al. .65 vil blive brugt på 20 (n=5 pr. gruppe) friskudtrukne ikke-carious menneskelige øvre præmolarer restaureret ved en tidligere procedure. Efter fjernelse af emaljen og cementen opnås 1 mm tykke skiver af mellem/dyb koronalt dentin. En 1,0 mg/ml stamopløsning af fluorescein-mærket gelatine blev fremstillet ved at tilsætte 1,0 ml vand til hætteglassene indeholdende det lyofiliserede substrat og opbevare ved -20°C indtil brug. Gelatinestamopløsningen fortyndes 1:8 med fortyndingsbufferen (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0), og et anti-fading middel tilsættes (monteringsmedium med Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, Storbritannien). En 50-μL mængde af den fluorescerende gelatineblanding anbringes oven på hver plade og dækkes med et dækglas. Objektglassene er lysbeskyttede og inkuberes i befugtede kamre ved 37°C. Til identifikation af den optimale inkubationsperiode tages fluorescerende billeder fra 1 time til 7 dage. Detaljeret beskrivelse af 3D-analyse af in situ zymografi med konfokal mikroskopi. Kort fortalt blev hydrolyse af quenchet fluorescein-konjugeret gelatinesubstrat, som er indikativ for endogen gelatinolytisk enzymaktivitet, vurderet ved undersøgelse under et multi-foton konfokalt mikroskop (eks.: 488nm og em: lp530nm; Zeiss, LSM 780, Oberchen, Oberchen , Tyskland). Optiske sektioner på 85 μm tykke blev erhvervet fra forskellige fokalplaner, og de stablede billeder blev analyseret, kvantificeret og behandlet med ZEN 2010-software (Carl Zeiss).

   3.4. Bestemmelse af biokompatibilitet. Tandpulp vil blive opnået fra ekstraherede præmolarer, og molekylære markører for cellelevedygtighed (resultater) eller cellebeskadigelse af klæbende nanokompositter vil blive behandlet.

   Tandpulp vil blive opnået som beskrevet af Vaseemuddin66 fra ekstraherede præmolarer. Totalt RNA vil blive adskilt, og mRNA-niveauer af specifik apoptose og autofagi markører vil blive målt ved qPCR, som tidligere beskrevet (2.4.4-2.4.5).

   3.5 Vurdering af mekaniske egenskaber (nanolækage og gradkonverteringsanalyse til vurdering af bindingsstabiliteterne (outcome)) vil være lig med metoder i 2.1

4. Statistisk analyse: Statistisk analyse vil blive udført med SPSS 23.0 software (IBM, New York, NY, USA). Sammenligninger mellem kvantitative variable (mikrotensilbindingsstyrke, nanolækage, konverteringsgrad, tælling af CFU) mellem to uafhængige grupper vil blive analyseret ved uparret t-test, ANOVA og pots-hoc-test (eller respektive ikke-parametriske tests ifølge Shapiro-Wilk test af datadistribution). Associationer mellem prøvebestemmelser vil blive beregnet ved Pearsons eller Spearmans korrelation. En effektberegning blev udført ved hjælp af data fra en tidligere undersøgelse67. En stikprøvestørrelse med minimum 35 patienter pr. gruppe og pr. hver undersøgelsesgruppe var nødvendig for at finde en forskel med statistisk signifikans i en endelig optælling af CFU (hovedudfald), i betragtning af en statistisk styrke på 0,8 baseret på Vildosola et en undersøgelse64 (1 -β). Signifikans vil blive overvejet, hvis p-værdien er