Efecto de la Incorporación de Nanopartículas de Cobre y Zinc en Adhesivos Dentales (1170575)

Objetivo General Evaluar la influencia de la incorporación de nanopartículas de cobre o zinc en un adhesivo dental sobre su acción antimicrobiana y su influencia sobre la actividad de las metaloproteasas de la matriz dentinaria. Analizar las propiedades mecánicas y la biocompatibilidad de los adhesivos Objetivos específicos

1. Desarrollar y caracterizar estructuralmente un adhesivo dental dopado con nanopartículas de cobre o zinc.

   1.1. Preparación de nanocompuestos adhesivos; 1.2. Caracterización estructural de nanocompositos adhesivos.

2. Evaluar los efectos mecánicos, bioquímicos y funcionales de nanocompuestos adhesivos in vitro. Los ensayos se abordarán comparando la adición de adhesivo de control, o el adhesivo dopado con cobre o zinc en dientes recién extraídos frescos (ej. fase vivo) 2.1. Para probar la actividad antimicrobiana del adhesivo; 2. 2. Estudiar la influencia de los nanocompuestos adhesivos en los niveles y/o actividad de las metaloproteasas de matriz; 2.3. Evaluar las propiedades mecánicas del adhesivo; 2.4. Para evaluar la biocompatibilidad. Se abordarán los ensayos de viabilidad en fibroblastos gingivales de cultivo primario.
3. Evaluar las propiedades antimicrobianas del modelo in vivo (fase clínica), los niveles y/o la actividad de las metaloproteasas de la matriz y la catepsina B, la biocompatibilidad de los nanocompuestos adhesivos in vivo y las propiedades mecánicas. Los premolares indicados para la extracción se restaurarán con adhesivo tradicional o nanocompuesto adhesivo. Después de un mes, los premolares se extraerán y analizarán como se describe.

3.1. Determinar las propiedades antimicrobianas superficiales de los nanocompuestos adhesivos; 3.2. Evaluar los niveles y/o actividad de metaloproteasas de matriz y catepsina B en tejido dentinario macerado;3.3 Para determinar la biocompatibilidad. Se obtendrá pulpa dental a partir de premolares extraídos, y se abordarán marcadores moleculares de viabilidad celular o daño celular de nanocompuestos adhesivos;3.4 Evaluar las propiedades mecánicas del adhesivo.

MÉTODOS

1. Desarrollar un adhesivo dental dopado con nanopartículas de cobre o zinc. 1.1. Preparación de nanocompuestos adhesivos (1): Los nanocompuestos adhesivos/CuNP se prepararán utilizando el sistema adhesivo de una botella Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Este adhesivo a base de acetona contiene una mezcla de dimetacrilato de uretano y monómero ácido dipentaeritritolpentaacrilatomonofosfato. Para preparar los nanocompuestos adhesivos, se pesarán cantidades apropiadas de polvo de nanopartículas (CuNp y ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chile) y se agregarán directamente a la botella de adhesivo bajo agitación magnética constante. Luego, la suspensión se dispersará más en un baño ultrasónico a 37 °C durante 10 minutos. Los nanocompuestos adhesivos se prepararán con un contenido de CuNP en el rango de 0,015 a 0,045% en peso según datos previos de nuestros laboratorios. Las cinco concentraciones de adhesivos dopados con Cu y Zn serán 0,0150 %, 0,0075 % y 0,00038 % (concentraciones con propiedades activas antibacterianas basadas en nuestros datos anteriores (Cu 1-2-3 y Zn 1-2-3).

   1.2. Caracterización estructural de nanocompuestos adhesivos (1): La morfología y composición de los materiales adhesivos nanocompuestos se caracterizarán mediante SEM-EDX en modo de retrodispersión de electrones para producir contraste de fase y microscopía AFM. La estructura química de la matriz polimérica y los contenidos de monómeros residuales se analizarán mediante espectroscopías Raman e infrarroja transformada de Fourier de reflexión total atenuada. El monómero residual será analizado considerando la vibración del doble enlace carbono-carbono del monómero acrílico en el rango de 1684 - 1636 cm-1.

2. Evaluar los efectos antibacterianos, mecánicos, bioquímicos y funcionales de los nanocompuestos adhesivos in vitro y ex vivo. Los ensayos se abordarán comparando la adición de adhesivo regular o el adhesivo dopado con cobre o zinc.

   2.1. Ensayo de las propiedades antimicrobianas del nanocompuesto adhesivo (2) 2.1.1 Actividad antibacteriana: Brevemente, se fabricarán discos de 10 mm y 2 mm de espesor usando compuesto de resina (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) y se dejarán sin recubrir (control) o se recubrirán con el adhesivo Prime&Bond 2.1, y equivalente experimental. mezclas de adhesivos de doce grupos y polimerizados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante durante 10 segundos usando una unidad de curado con luz LED (Radii Cal, SDI, AU) a una densidad de potencia de 1000 mW/cm2. Los discos de amalgama (Contour; Kerr, Orange, CA) se fabricarán como se describió anteriormente y se usarán como control positivo adicional. En esta parte del experimento se evaluará un total de catorce grupos de estudio con ocho especímenes por grupo: (1) control; (2) amalgama (material metálico utilizado como control positivo) y 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 y 8) Zn3. Para garantizar la eliminación del monómero no polimerizado, los discos se sumergirán en 10 ml de agua desionizada estéril y se agitarán durante 2 horas a 200 rpm y 37,8 °C, después de lo cual se dejarán secar a temperatura ambiente durante al menos 24 horas. Los discos se esterilizarán mediante incubación en etanol al 70 % durante 10 minutos y luego se secarán asépticamente durante un mínimo de 48 horas. La superficie de cada disco se inoculará con 100 mL de una concentración viable definida de 1 108 células/mL Streptococcus mutans, ATCC1 25175 cultivado anaeróbicamente en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) . Para determinar la concentración de células viables para cada grupo de tratamiento en unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml), los discos inoculados serán anaerobios, después de lo cual se determinará el número total de UFC recuperadas.

   2.2. Evaluación in vitro y ex vivo de la actividad de las MMP (1-2) 2.2.1 Ensayo de inhibición de la actividad de las MMP (in vitro): La actividad cuantitativa in vitro de las MMP-2, MMP-8 y MMP-9 se determinará mediante un ensayo comercial fluorométrico de MMP. kits (kits de ensayo SensoLyte; AnaSpec, San José, CA, EE. UU.) para la detección de la actividad anti-MMP. Se agregarán al tampón de reacción adhesivos dopados con Cu y ZnNP en diferentes concentraciones y controles sin adhesivos de Cu o ZnNP, y el ensayo se realizará de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Tras la escisión en 2 fragmentos separados por MMP, la fluorescencia de 5-FAM será monitoreada por un lector de microplacas fluorescentes (Sinergy TM).

   2.2.2 Determinación de la actividad y los niveles de MMP (muestras de dentina ex vivo con muestras obtenidas de dientes restaurados con adhesivos dopados y control): Se recolectarán veinticinco (n=5) terceros molares humanos libres de caries extraídos después de obtener información de los pacientes. consentir. Los dientes se desinfectarán en cloramina al 0,5 %, se almacenarán en agua destilada y se usarán dentro de los seis meses posteriores a la extracción. Un operador calibrado realizará una pequeña preparación oclusal con dimensiones estandarizadas de 3x3x5 mm en el centro del diente utilizando una fresa cilíndrica de diamante (109/018, grano medio (60730025), Dentsply, NY, EE. UU.) y una fresa de alta velocidad. pieza de mano mientras proporciona un rociado de aire y agua. Después de completar la preparación de la cavidad, se rellenará con composite de resina (Filtek Supreme; 3M ESPE). Los adhesivos experimentales dopados con Cu y Zn se utilizarán según las instrucciones del fabricante, y el adhesivo no dopado se utilizará como control sobre un premolar superior homólogo. El composite de resina (Filtek Supreme; 3M ESPE) se aplicará mediante la técnica incremental. Se eliminará completamente el esmalte con una sierra de diamante de baja velocidad (Remet, Bolonia, Italia) bajo irrigación salina, y se seccionarán los dientes para obtener obleas de dentina coronal de 1 mm de espesor, que posteriormente se pulverizarán en polvo con un martillo de acero. A continuación, el polvo de dentina se dividirá por igual y se desmineralizará (a 4 °C durante 24 horas con agitación) en una de las siguientes soluciones acuosas: (1) ácido acético 0,87 M, pH = 2,3; (2) ácido cítrico 0,26 M, pH = 2,3; o (3) EDTA 0,5 M, pH = 6,4; o (4) EGTA 0,5 M, pH = 6,4. La extracción enzimática del polvo de dentina desmineralizada se suspenderá en tampón de extracción (Tris-HCl 50 mM, pH 6,0, que contiene CaCl2 5 mM, NaCl 100 mM, Triton X-100 al 0,1 %, NONIDET P-40 al 0,1 %, ZnCl2 0,1 mM, 0,02 % NaN3) y cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EE. UU.). Luego, las muestras se tratarán ultrasónicamente a una salida de 40 W durante 3 ráfagas de 10 segundos cada una a 4 ° C (Procesador de líquido ultrasónico Sonicator modelo W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, EE. UU.). Los viales se centrifugarán a 18.000 rpm durante 30 min a 4 °C y se recogerán los sobrenadantes. Todas las proteínas presentes en los sobrenadantes se precipitarán a 4°C mediante la adición de sulfato de amonio en polvo (p/v) para lograr una concentración final del 85% y un pH de 7,0. El precipitado se recogerá mediante centrifugación a 24 000 rpm durante 30 min a 4 °C, se volverá a disolver en una dilución de 10 veces en tampón de extracción, se dializará a través de una membrana de 30 kDa contra el tampón de extracción durante la noche y se almacenará a 4 °C hasta que se analice. Después de esto, el polvo de dentina se analizará para evaluar los niveles de actividad de MMP-2, MMP-9 y catepsina B medidos por zimografía de gelatina y para evaluar MMP-8 por zimografía de colágeno, como se describió anteriormente.56 La densitometría se expresará como du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, EE. UU.). Brevemente, las muestras de polvo de dentina se someterán a electroforesis en condiciones desnaturalizantes no reductoras en geles SDS/PAGE que contienen 1 mg/ml de gelatina o 0,1 mg/ml de colágeno como sustratos. Luego se remojarán dos veces en Triton X-100 al 2,5 % y se incubarán durante 17 h en tampón de desarrollo (Tris 20 mM pH 7,4 y CaCl2 5 mM), se tiñerán con Coomassie Brilliant Blue R-250 y se decolorarán con ácido acético al 10 % y Solución de metanol al 20%. Los niveles de MMP-2, MMP-8, MMP-9, catepsina B e ICTP (como marcador de la hidrólisis del colágeno de la dentina) se determinarán mediante un kit ELISA comercial o inmunoensayos multiplex (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU., para la tecnología Luminex) según las recomendaciones del fabricante.

   2.3. Pruebas de propiedades mecánicas de nanocompuestos adhesivos (1-2) Fuerza de unión 2.3.1 Selección y preparación de dientes: Se recolectarán 70 terceros molares humanos libres de caries extraídos después de obtener los consentimientos informados de los pacientes de la clínica dental de la Universidad de Chile (≈2000 terceros extracciones de molares por año, asegurando la disponibilidad de estos dientes que normalmente se desechan). Los dientes se desinfectarán en cloramina al 0,5 %, se almacenarán en agua destilada y se usarán dentro de los seis meses posteriores a la extracción. Una superficie de dentina plana quedará expuesta después de moler en húmedo el esmalte oclusal con un papel #180 SiC. Las superficies expuestas de la dentina se pulirán aún más con un papel SiC #600 húmedo durante 60 segundos para estandarizar la capa de barrillo dentinario.

   2.3.2 Diseño experimental: Los dientes se asignarán aleatoriamente en doce grupos de cinco (6 grupos por adhesivo), cada uno de los cuales se tratará con una concentración diferente de adhesivo dopado. Como control sin NP del sistema Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE) se utilizará.

   2.3.3. Procedimiento de restauración y preparación de muestras: Los sistemas adhesivos se aplicarán estrictamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante respectivo.

   2.3.4 Después de los procedimientos de unión: todos los dientes recibirán una restauración de composite microhíbrido en dos incrementos de 2 mm. Cada incremento se fotopolimerizará durante 40 segundos utilizando una unidad de polimerización con luz LED en la configuración de 1200 mW/cm2 (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australia). Los dientes restaurados se almacenarán en agua destilada a 37 °C durante 24 horas y luego se seccionarán longitudinalmente en las direcciones mesiodistal y bucal-lingual a través de la interfaz adherida utilizando una sierra de diamante de baja velocidad (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) para obtener de 15 a 20 barras de resina y dentina, cada una con un área de sección transversal de aproximadamente 0,8 mm2 cuando se mide con un calibrador digital (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokio, Japón). Cada muestra de cada diente se evaluará para la unión de microtracción. (mTBS) excepto para seis especímenes adheridos con resina y dentina seleccionados al azar, que se dividirán para medir el grado de conversión in situ (DC) y la nanofiltración (NL).

   2.3.5. Prueba de resistencia de la unión a microtracción: las barras unidas con resina y dentina se unirán a una plantilla de Geraldeli con adhesivo de cianoacrilato y se probarán bajo tensión (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brasil) a 0,5 mm/min hasta la falla. Los valores de mTBS se calcularán dividiendo la carga en la falla por el área de unión de la sección transversal. El modo de falla de las muestras se clasificará como cohesivo (fallo exclusivamente dentro de la dentina o resina compuesta), adhesivo (fallo en la interfaz resina/dentina) o mixto (fallo en la interfaz resina/dentina, incluido el fallo cohesivo de los sustratos vecinos). ). La clasificación se realizará bajo un microscopio estereoscópico (SZ40; Olympus, Tokio, Japón) con un aumento de 100x. Los especímenes con fallas prematuras (PF) se incluirán en la media.

   2.3.6. Grado de conversión in situ: se pulirán en húmedo tres barras unidas con resina y dentina de cada diente con papel SiC n.° 1500, n.° 2000 y n.° 2500. Luego se limpiarán ultrasónicamente durante 20 minutos y se almacenarán en agua a 37,8 °C durante 24 horas antes de medir la CC. El análisis de espectroscopía Micro-Raman se realizará utilizando un equipo Senterra (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Wur¨rttemberg, Alemania). La calibración del espectrómetro micro-Raman se realizará restableciéndolo a cero y luego midiendo el coeficiente de una muestra de silicio. Las muestras se analizarán utilizando los siguientes parámetros micro-Raman: láser de neón de 20 mW a 532 nm, resolución espacial de 3 mm, resolución espectral de 5 cm-1, tiempo de acumulación de 30 segundos con 6 coadiciones y aumento de 110x ( Olympus UK, Londres, Reino Unido) a un diámetro de haz de 1 mm. Se tomarán espectros en la interfase dentina-adhesivo en tres sitios diferentes dentro de la dentina intertubular para cada barra adherida con resina y dentina. Los espectros de adhesivos no polimerizados se utilizarán como referencias. El posprocesamiento de los espectros se llevará a cabo utilizando la versión 6.5 del software de espectroscopia Opus dedicado. Se calculará la relación de contenido de doble enlace de monómero a polímero en el adhesivo: donde ''R'' es la relación de las áreas de los picos alifáticos y aromáticos a 1639 cm-1 y 1609 cm-1 en adhesivos polimerizados y no polimerizados. El DC in situ de todos los bastoncillos adheridos con resina y dentina del mismo diente se promediará con fines estadísticos.

   2.3.7. Evaluación de nanofiltración: Se colocarán tres tiras de resina de cada diente en nitrato de plata amoniacal preparado según el protocolo descrito por Tay et al.57 y se almacenarán en la oscuridad durante 24 horas. Luego se enjuagarán completamente en agua destilada y se sumergirán en una solución de revelado fotográfico durante 8 horas bajo una luz fluorescente para reducir los iones de plata a granos de plata metálica dentro de los huecos a lo largo de la interfaz unida. Las muestras se pulirán en húmedo con papel de SiC n.° 600, n.° 1000, n.° 1200, n.° 1500, n.° 2000 y n.° 2500 y con pasta de diamante de 1 y 0,25 mm (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) utilizando un paño de pulido. Se limpiarán ultrasónicamente, se secarán al aire, se montarán en talones y se recubrirán con carbón-oro (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). Las interfaces resina-dentina se analizarán en un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo operado en el modo de retrodispersión (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, Reino Unido). Se capturarán tres imágenes de cada barra adherida con resina y dentina. Un investigador ciego medirá el porcentaje relativo de NL dentro de las capas adhesivas e híbridas en cada muestra en todas las imágenes utilizando el software Image J58. Se promediarán los valores del mismo espécimen, y el NL medio de todos los palos del mismo diente será el promedio.

   2.4 Evaluar ensayos de biocompatibilidad y viabilidad en cultivos primarios de fibroblastos gingivales 2.4.1 Cultivos celulares: Se obtendrán cultivos primarios de fibroblastos humanos por el método de explante, a partir del tejido retromolar de terceros molares de tres individuos adultos masculinos.

   La línea celular de osteosarcoma humano Saos-2, comúnmente utilizada para evaluar la biocompatibilidad entre osteoblastos y biomateriales, se cultivará como se describe por Alcaide et al.60.

   Las células se sembrarán en una placa de 96 pocillos a una densidad de 3000 células por pocillo. A las 24h se sustituirá el medio de cultivo control por 100 µl de diferentes diluciones del adhesivo adecuado (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). Las placas se incubarán durante 24h, 48h y 72h en un 37 °C de incubadora (5%CO2) previo a los ensayos de viabilidad o muerte celular.

   2.4.2 Análisis de viabilidad celular y ciclo celular: Se obtendrán cultivos primarios de fibroblastos humanos por el método de explante, a partir del tejido retromolar de terceros molares de tres individuos adultos de sexo masculino.

   La línea celular de osteosarcoma humano Saos-2, comúnmente utilizada para evaluar la biocompatibilidad entre osteoblastos y biomateriales, se cultivará como se describe por Alcaide et al.60.

   Las células se sembrarán en una placa de 96 pocillos a una densidad de 3000 células por pocillo. A las 24h se sustituirá el medio de cultivo control por 100 µl de diferentes diluciones del adhesivo adecuado (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). Las placas se incubarán durante 24h, 48h y 72h en un 37 °C de incubadora (5%CO2) previo a los ensayos de viabilidad o muerte celular.

   2.4.3 Cuantificación de células viables, apoptóticas tempranas, apoptóticas tardías y necróticas mediante microscopía de fluorescencia: se utilizará el protocolo descrito por Kasibhatla et al 61. Las células se tiñerán con una solución de naranja de acridina/bromuro de etidio (AO/EB) y se examinarán mediante microscopía de fluorescencia. AO teñirá tanto las células vivas como las muertas. EB teñirá solo las células que han perdido la integridad de la membrana. Las células vivas aparecerán uniformemente verdes. Las células apoptóticas tempranas se tiñen de verde y contienen puntos verdes brillantes en los núcleos como consecuencia de la condensación de la cromatina y la fragmentación nuclear. Las células apoptóticas tardías también incorporarán bromuro de etidio y, por lo tanto, se tiñerán de naranja, pero, a diferencia de las células necróticas, las células apoptóticas tardías mostrarán núcleos condensados ​​y, a menudo, fragmentados. Las células necróticas se tiñen de naranja, pero tienen una morfología nuclear similar a la de las células viables, sin cromatina condensada61.

   2.4.4 Detección de apoptosis por exposición de fosfatidilserina, escalonamiento de ADN y cuantificación de proteínas y ARNm apoptóticos: La exposición de fosfatidilserina en la superficie exterior de la membrana plasmática se analizará como una señal temprana de apoptosis mediante tinción con anexina V (A5)-aloficocianina (APC), como se describe en Alcaide et al60. La fluorescencia de la sonda APC se analizará mediante citometría de flujo.

   El ensayo de escalera de ADN apoptótico se llevará a cabo utilizando un kit de escalera de ADN (Roche, Alemania).

   Los niveles de ARNm y proteínas para los mediadores supresores de tumores (p53), proapoptóticos (bax, caspasa 3) y antiapoptóticos (bcl-2) se abordarán mediante PCR cuantitativa e inmunotransferencia.

   2.4.5 Evaluación de la autofagia: para probar los efectos putativos de las NP metálicas en la autofagia celular, se abordarán diferentes marcadores de autofagia. El flujo autofágico y el nivel de p62 se detectarán mediante transferencia Western, y los autofagosomas se visualizarán mediante microscopía de fluorescencia contando los puntos LC3 positivos63.

3. Evaluación de niveles y/o actividad de metaloproteasas y biocompatibilidad de nanocompuestos adhesivos in vivo.

   Los premolares indicados para la extracción se restaurarán con adhesivo tradicional o nanocompuesto adhesivo. Después de un mes (recordatorio por contacto telefónico y luego del examen clínico), los pacientes serán examinados y los premolares serán extraídos y analizados por evaluadores ciegos (codificados por números) en todas las etapas como se describe. Las extracciones de premolares serán realizadas por docentes de odontología, cualquier efecto posterior al procedimiento será asumido y resuelto por el equipo de investigación, los procedimientos para los pacientes son gratuitos y todo se apegará estrictamente a las recomendaciones del comité de ética de la facultad. de odontología de la universidad de chile.

   3.1 Evaluación in vivo de nanocompuestos adhesivos: Se seleccionarán 70 voluntarios del Programa de Especialización en Ortodoncia en la clínica de la Universidad de Chile que requieran extracción de primeros premolares superiores derechos e izquierdos (n = 35 por grupo) por motivos de ortodoncia (habrá habrá un periodo de contratación de 3 meses con un co-investigador responsable del seguimiento (CB)). Los criterios de inclusión serán (1) planes de tratamiento que indiquen extracciones de premolares por motivos de ortodoncia, (2) presencia de dientes de tratamiento sanos, intactos, sin caries, no restaurados y completamente erupcionados, y (3) pacientes con condiciones de salud bien controladas. que permitan realizar todos los procedimientos de la investigación con el mínimo riesgo. Los criterios de exclusión serán (1) pacientes que no acepten ser voluntarios para el estudio y (2) pacientes que no cumplan con todos los criterios de inclusión. Un operador calibrado realizará una pequeña preparación oclusal en el centro del diente utilizando un diamante cilíndrico. fresa (.63109/018, grano medio (60730025), Dentsply, NY, EE. UU.) y una pieza de mano de alta velocidad mientras proporciona un rociado de aire y agua con dimensiones estandarizadas de 3x3x5 mm. Después de completar la preparación de la cavidad, se rellenará con composite de resina (Filtek Supreme; 3M ESPE). Los adhesivos experimentales dopados con Cu y Zn se utilizarán según las instrucciones del fabricante, y el adhesivo no dopado se utilizará como control sobre el premolar superior homólogo y se diseñará mediante aleatorización simple de grupos paralelos. El composite de resina (Filtek Supreme; 3M ESPE) se aplicará mediante la técnica incremental y, finalmente, se aplicará una capa de adhesivo como superficie de restauración de composite y se polimerizará durante 10 seg. Se comprobará la oclusión y se terminarán y pulirán las restauraciones siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se utilizará el pulido y acabado final para aplicar una capa de adhesivo sobre la restauración final, que será polimerizada durante 10 segundos (Raddi Cal, SDI, AU). Se extraerá un diente a la vez un mes después de que se realicen las restauraciones. El paciente recibirá anestesia infiltrativa e intraligamentaria (aproximadamente 1,8 mL de Mepivacaína al 2% (36 mg)) con epinefrina en una proporción de 1:100.000 (18 mg). Luego, los dientes serán sometidos a pruebas.

   3.2 Determinar las propiedades antimicrobianas de la superficie de los nanocompuestos adhesivos: para evaluar las propiedades antibacterianas de la superficie de los adhesivos dopados, se aplicará una capa final de adhesivos sobre la superficie final de las restauraciones en un modelo in vivo. El procedimiento se utilizará para evaluar el número de UFC de S. Mutans en superficies compuestas (Resultado principal). Antes de tomar muestras del biofilm, se prepararán bandejas para imprimir el biofilm sobre las restauraciones. Para esta aplicación utilizaremos cubetas de aplicación de gel de flúor desechables (Deepak Products Inc., Miami, EE. UU.), cada una de las cuales se esterilizará en campana de bioseguridad (Esco Technologies Inc., Harboro, EE. UU.) bajo luz ultravioleta durante 30 minutos. A continuación, cada bandeja se cargará con 7,5 ml de agar TYCSB (Caseína, extracto de levadura, L-cisteína, sacarosa, bacitracina) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, EE. UU.), que es un medio selectivo para S. mutans. Posteriormente, para individualizar la técnica de recogida de muestras, se cortarán las cubetas para que no quepan más de 3 dientes. Inmediatamente después de esto, las bandejas se colocarán en placas petri estériles y se almacenarán en bolsas de plástico selladas en un refrigerador. Antes de su uso, las bandejas se colocarán en una incubadora/estufa (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Corea) durante 24 h a 37 °C como medida de control de calidad. Los operadores tercero y cuarto realizarán el muestreo, que se llevará a cabo entre las 11:00 y las 13:00 para permitir la reorganización del biofilm después del cepillado matutino. La toma de muestras la realizará un operador ciego presionando suavemente la cubeta durante 20 s sobre la restauración RC, seguida de una restauración RC homóloga con y sin adhesivo dopado con Cu o Zn.

   Después de que las bandejas de muestra se almacenen en placas petri estériles, se transportarán a 4 °C y luego se incubarán a 37 °C en un microaerófilo (tarro vela CO2 10 %) durante 48 h. El recuento de S.mutans lo realizará el cuarto operador, que estará cegado a la bandeja que se utilizó para imprimir las restauraciones RC. Posteriormente se realizará tinción de Gram para determinar la micromorfología de las colonias. El recuento de S.mutans se expresará en unidades formadoras de colonias (UFC) de S.mutans de las placas y bandejas con agar TYCSB. Las colonias seleccionadas que serán compatibles con la adhesión y las características morfológicas de S. mutans se suspenderán en caldo Todd-Hewitt (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, EE. UU.) y se incubarán a 37 °C durante 48 h. Luego, las colonias se someterán a pruebas bioquímicas para identificar la especie de S. mutans y distinguirla de S. sobrinus. Las pruebas bioquímicas incluyen fermentación de rafinosa, fermentación de melibiosa y pruebas de hidrólisis de esculina. Un resultado positivo de las tres pruebas indica la presencia de S. mutans.

   3.3 La evaluación de los niveles y/o la actividad de las metaloproteasas en el tejido de dentina macerado utilizará una metodología similar a la de 2.4.2 3.3.1 Zymography in situ para evaluar las actividades de las MMP 2 y 9 (resultado): Un método descrito por Mazzoni et al. .65 se utilizará en 20 (n=5 por grupo) premolares superiores humanos no cariados recién extraídos restaurados mediante un procedimiento anterior. Después de retirar el esmalte y el cemento, se obtendrán discos de dentina coronal media/profunda de 1 mm de espesor. Se preparó una solución madre de gelatina marcada con fluoresceína de 1,0 mg/ml añadiendo 1,0 ml de agua a los viales que contenían el sustrato liofilizado y almacenándolos a -20 °C hasta su uso. La solución madre de gelatina se diluye 1:8 con el tampón de dilución (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) y se agrega un agente anti-decoloración (Mounting Medium with Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, Reino Unido). Se coloca una cantidad de 50 μL de la mezcla de gelatina fluorescente encima de cada placa y se cubre con un cubreobjetos. Los portaobjetos se protegen de la luz y se incuban en cámaras humidificadas a 37 °C. Para la identificación del período de incubación óptimo, se toman imágenes fluorescentes de 1 hora a 7 días. Descripción detallada del análisis 3D de zimografía in situ con microscopía confocal. Brevemente, la hidrólisis del sustrato de gelatina conjugada con fluoresceína inactivada, que es indicativa de la actividad de la enzima gelatinolítica endógena, se evaluó mediante un examen bajo un microscopio confocal multifotónico (por ejemplo, 488nm y em: lp530nm; Zeiss, LSM 780, Carl Zeiss, Oberkochen , Alemania). Se adquirieron secciones ópticas de 85 μm de espesor desde diferentes planos focales y las imágenes apiladas se analizaron, cuantificaron y procesaron con el software ZEN 2010 (Carl Zeiss).

   3.4. Determinación de biocompatibilidad. Se obtendrá pulpa dental a partir de premolares extraídos y se abordarán marcadores moleculares de viabilidad celular (resultados) o daño celular por nanocompuestos adhesivos.

   La pulpa dental se obtendrá como describe Vaseemuddin66, a partir de premolares extraídos. El ARN total se separará y los niveles de ARNm de marcadores específicos de apoptosis y autofagia se medirán mediante qPCR, como se describió anteriormente (2.4.4-2.4.5).

   3.5 La evaluación de las propiedades mecánicas (nanofugas y análisis de conversión de grados para evaluar las estabilidades de los enlaces (resultado)) será igual a los métodos en 2.1

4. Análisis estadístico: El análisis estadístico se realizará utilizando el software SPSS 23.0 (IBM, Nueva York, NY, EE. UU.). Las comparaciones entre variables cuantitativas (fuerza de unión a la microtracción, nanofiltración, grado de conversión, recuento de UFC) entre dos grupos independientes se analizarán mediante la prueba t no pareada, ANOVA y prueba pot-hoc (o pruebas no paramétricas respectivas según Shapiro-Wilk pruebas de distribución de datos). Las asociaciones entre determinaciones de muestras se calcularán mediante la correlación de Pearson o Spearman. Se realizó un cálculo de potencia a partir de datos de un estudio previo67. Se necesitó un tamaño de muestra con un mínimo de 35 pacientes por grupo y por cada brazo de estudio para encontrar una diferencia con significancia estadística en un conteo final de UFC (resultado principal), considerando un poder estadístico de 0.8 basado en Vildosola et a study64 (1 -β). Se considerará la significación si el valor de p es