A réz és cink nanorészecskék fogászati ​​ragasztókba való beépülésének hatása (1170575)

Általános cél Felmérni a réz vagy cink nanorészecskék fogászati ​​ragasztóba való beépülésének hatását annak antimikrobiális hatására, valamint a dentin mátrix metalloproteázok aktivitására. A ragasztó mechanikai tulajdonságainak és biokompatibilitásának elemzése Specifikus Célok

1. Réz vagy cink nanorészecskékkel adalékolt fogászati ​​ragasztó kifejlesztése és szerkezeti jellemzése.

   1.1. Ragasztó nanokompozitok készítése; 1.2. Ragasztó nanokompozitok szerkezeti jellemzése.

2. Ragasztó nanokompozitok mechanikai, biokémiai és funkcionális hatásainak in vitro felmérése. A vizsgálatokat a kontroll ragasztóanyag hozzáadásának, illetve a rézzel vagy cinkkel adalékolt ragasztónak a frissen kihúzott fogakon történő összehasonlításával hasonlítják össze. vivo fázis) 2.1. A ragasztó antimikrobiális hatásának tesztelése; 2. 2. Tapadó nanokompozitok hatásának vizsgálata a mátrix metalloproteázok szintjére és/vagy aktivitására;2.3. A ragasztó mechanikai tulajdonságainak értékelése;2.4. A biokompatibilitás értékelésére. Az elsődleges tenyésztett gingivális fibroblasztokban végzett életképességi vizsgálatokkal foglalkozunk.
3. In vivo modell (klinikai fázis) antimikrobiális tulajdonságainak, mátrix metalloproteázok és katepszin B szintjének és/vagy aktivitásának, adhezív nanokompozitok in vivo biokompatibilitásának és mechanikai tulajdonságainak értékelése. Az extrahálásra javasolt premolárisok helyreállítása hagyományos ragasztóval vagy adhezív nanokompozit segítségével történik. Egy hónap elteltével a premolárisokat a leírtak szerint kivonják és elemzik.

3.1. Ragasztó nanokompozitok felületi antimikrobiális tulajdonságainak meghatározása; 3.2. A mátrix metalloproteázok és a katepszin B szintjének és/vagy aktivitásának értékelése macerált dentinszövetben; 3.3. A biokompatibilitás meghatározásához. A fogászati ​​pépet az extrahált előfogakból nyerik, és a sejt életképességét vagy sejtkárosodását jelző molekuláris markereket adhezív nanokompozitokkal kezelik; 3.4. A ragasztó mechanikai tulajdonságainak értékelése.

MÓD

1. Réz vagy cink nanorészecskékkel adalékolt fogászati ​​ragasztó kifejlesztése. 1.1. Ragasztó nanokompozitok előállítása (1): CuNP/ragasztó nanokompozitokat a Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE) egypalackos ragasztórendszerrel készítenek. Ez az aceton alapú ragasztó uretán-dimetakrilát és savas monomer dipentaeritrit-pentaakrilát-monofoszfát keverékét tartalmazza. A ragasztó nanokompozitok elkészítéséhez megfelelő mennyiségű nanorészecskés port (CuNp és ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chile) lemérünk, és állandó mágneses keverés mellett közvetlenül a ragasztópalackhoz adjuk. A szuszpenziót ezután ultrahangos fürdőben 37 °C-on 10 percig tovább diszpergáljuk. Laboratóriumaink korábbi adatai szerint 0,015-0,045 tömeg% CuNP tartalommal fogunk készíteni ragasztós nanokompozitokat. A Cu és Zn-dal adalékolt ragasztók öt koncentrációja 0,0150%, 0,0075% és 0,00038% lesz (korábbi adataink alapján (Cu 1-2-3 és Zn 1-2-3) antibakteriális hatású koncentrációk).

   1.2. Ragasztó nanokompozitok szerkezeti jellemzése (1): A nanokompozit ragasztóanyagok morfológiáját és összetételét SEM-EDX-szel jellemezzük visszaszórt elektron módban, fáziskontraszt és AFM mikroszkóppal előállítva. A polimer mátrix kémiai szerkezetét és a maradék monomer tartalmát csillapított teljes reflexiós Fourier transzformációs infravörös és Raman spektroszkópiával elemezzük. A maradék monomer elemzése az akril monomer szén-szén kettős kötés rezgésének figyelembevételével történik az 1684-1636 cm-1 tartományban.

2. Ragasztó nanokompozitok antibakteriális, mechanikai, biokémiai és funkcionális hatásainak vizsgálata in vitro és ex vivo. A vizsgálatokat a szokásos ragasztó hozzáadásának vagy a rézzel vagy cinkkel adalékolt ragasztóanyag hozzáadásával kell összehasonlítani.

   2.1. A ragasztó nanokompozit antimikrobiális tulajdonságainak vizsgálata (2) 2.1.1. Antibakteriális hatás: Röviden összefoglalva, 10 mm-es, 2 mm vastagságú korongokat gyantakompozitból (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) készítenek, és bevonat nélkül hagyják (kontroll), vagy bevonják a Prime&Bond 2.1 ragasztóval, és ezzel egyenértékű kísérleti eljárással. Tizenkét csoport ragasztókeverékei, és a gyártó ajánlása szerint polimerizáltak 10 másodpercig LED-fénykeményítő egységgel (Radii Cal,SDI,AU) 1000 mW/cm2 teljesítménysűrűséggel. Az amalgámkorongokat (Contour; Kerr, Orange, CA) a korábban leírtak szerint gyártják, és további pozitív kontrollként használják. A kísérlet ezen részében összesen tizennégy vizsgálati csoportot értékelünk, csoportonként nyolc mintával: (1) kontroll; (2) amalgám (pozitív kontrollként használt fémanyag) és 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 és 8) Zn3. A nem polimerizált monomer eltávolítása érdekében a korongokat 10 ml steril ionmentes vízbe merítjük, és 2 órán át 200 fordulat/perc sebességgel és 37,8 °C-on keverjük, majd a korongokat szobahőmérsékleten legalább 24 órán át száradni hagyjuk. A korongokat 70%-os etanolban 10 percig végzett inkubálással sterilizáljuk, majd legalább 48 órán át aszeptikusan szárítjuk. Mindegyik lemez felületét 100 ml meghatározott életképes koncentrációjú 1108 sejt/ml koncentrációjú anaerob módon tenyésztett Streptococcus mutans, ATCC1 25175, agyszívinfúzióban oltjuk be (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) . Az egyes kezelt csoportok életképes sejtkoncentrációjának meghatározásához kolóniaképző egység/ml-ben (CFU/ml) a beoltott korongokat anaerob módon kezeljük, majd meghatározzuk a visszanyert CFU-k teljes számát.

   2.2. Az MMP-k aktivitásának in vitro és ex vivo értékelése (1-2) 2.2.1 MMP-aktivitás gátlási vizsgálat (in vitro): A kvantitatív MMP-2, MMP-8 és MMP-9 in vitro aktivitást kereskedelmi MMP fluorometriás vizsgálattal határozzuk meg készletek (SensoLyte assay kits; AnaSpec, San Jose, CA, USA) az anti-MMP aktivitás szűrésére. Cu- és ZnNP-vel adalékolt ragasztókat különböző koncentrációkban és kontrollokat Cu- vagy ZnNP-ragasztó nélkül adunk a reakciópufferhez, és az assay-t a gyártó ajánlásai szerint hajtjuk végre. Az MMP-vel 2 különálló fragmensre történő hasítás után az 5-FAM fluoreszcenciáját fluoreszcens mikrolemez-leolvasóval (Sinergy TM) követjük nyomon.

   2.2.2 Az MMP aktivitás és szintek meghatározása (ex vivo dentin minták adalékolt ragasztóval helyreállított fogakból vett mintákkal és kontroll): Huszonöt (n=5) kivont fogszuvasodásmentes harmadik őrlőfogat gyűjtünk a betegek tájékoztatása után. beleegyezés. A fogakat 0,5%-os klóraminban fertőtlenítik, desztillált vízben tárolják, és a foghúzást követő hat hónapon belül felhasználják. Egy kalibrált kezelő a fog közepén, hengeres gyémántfúróval (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) és nagysebességű okkluzális preparátumot készít szabványosított méretekkel, 3x3x5 mm kézi darab, miközben levegő-víz permetet biztosít. Az üreg előkészítése után gyanta kompozittal (Filtek Supreme; 3M ESPE) töltjük fel. A Cu-val és Zn-nel adalékolt kísérleti ragasztókat a gyártó utasításai szerint használjuk, a nem adalékolt ragasztót pedig kontrollként egy homológ felső előőrlőfogon. A gyanta kompozit (Filtek Supreme; 3M ESPE) inkrementális technikával kerül felhordásra. A zománcot lassú fordulatszámú gyémántfűrésszel (Remet, Bologna, Olaszország) sóoldattal végzett öntözés mellett teljesen eltávolítják, majd a fogakat metszve 1 mm vastag koronális dentin ostyát kapnak, amelyet ezt követően porrá porrá törnek. acélkalapács. A dentinport ezután egyenlő arányban elosztjuk és ionmentesítjük (4 °C-on 24 órán át keverés közben) a következő vizes oldatok egyikében: (1) 0,87 M ecetsav, pH = 2,3; (2) 0,26 M citromsav, pH = 2,3; vagy (3) 0,5 M EDTA, pH=6,4; vagy (4) 0,5 M EGTA, pH = 6,4. A demineralizált dentinpor enzimes extrakcióját extrakciós pufferben (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,1% NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2) szuszpendáljuk. 0,02% NaN3) és EDTA-mentes proteáz inhibitor koktél (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). A mintákat ezután ultrahanggal kezeljük 40 W-os kimeneten 3, egyenként 10 másodperces sorozatban 4 °C-on (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA). A fiolákat 18 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 30 percig 4 °C-on, és a felülúszókat összegyűjtjük. A felülúszóban lévő összes fehérje kicsapódik 4 °C-on porított ammónium-szulfát (w/v) hozzáadásával, hogy 85%-os végső koncentrációt és 7,0 pH-t érjünk el. A csapadékot centrifugálással 24 000 fordulat/perc mellett 30 percig 4 °C-on összegyűjtjük, 10-szeres hígításban extrakciós pufferben újra feloldjuk, 30 kDa-os membránon keresztül dializáljuk az extrakciós pufferrel szemben egy éjszakán át, és az elemzésig 4 °C-on tároljuk. Ezt követően a dentinport elemzik az MMP-2, MMP-9 és katepszin B aktivitás szintjének felmérésére zselatin zimográfiával és az MMP-8 kollagén zimográfiával történő értékelésére, a korábban leírtak szerint.56 A denzitometriát du-ban fejezzük ki (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA). Röviden, a dentinpor mintákat nem redukáló denaturáló körülmények között, 1 mg/ml zselatint vagy 0,1 mg/ml kollagént szubsztrátként tartalmazó SDS/PAGE gélekben elektroforézisnek vetjük alá. Ezután kétszer áztatják 2,5%-os Triton X-100-ban, és 17 órán át inkubálják előhívó pufferben (20 mM Tris pH 7,4 és 5 mM CaCl2), Coomassie Brilliant Blue R-250-nel megfestik, majd 10%-os ecetsavval és 20%-os metanolos oldat. Az MMP-2, MMP-8, MMP-9, katepszin B és ICTP (mint a dentin kollagén hidrolízis markere) szintjét kereskedelmi forgalomban kapható ELISA Kit vagy multiplex immunoassay segítségével határozzák meg (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, Luminex technológiához) a gyártó ajánlásai szerint.

   2.3. Ragasztó nanokompozitok mechanikai tulajdonságainak vizsgálata (1-2) Kötési szilárdság 2.3.1 Fogak kiválasztása és előkészítése: Hetven kivont fogszuvasodástól mentes emberi harmadik őrlőfogat gyűjtenek a Chilei Egyetem fogászati ​​klinikájának (≈2000 harmadának) a betegek beleegyezése után évenkénti őrlőfoghúzás, biztosítva a normál esetben eldobott fogak rendelkezésre állását). A fogakat 0,5%-os klóraminban fertőtlenítik, desztillált vízben tárolják, és a foghúzást követő hat hónapon belül felhasználják. Az okkluzális zománc #180-as SiC papírral történő nedves csiszolása után egy lapos dentinfelület szabaddá válik. A kitett dentinfelületeket nedves #600-as SiC papírral tovább polírozzák 60 másodpercig, hogy szabványosítsák a kenetréteget.

   2.3.2 Kísérleti terv: A fogakat véletlenszerűen tizenkét, ötből álló csoportba osztják (6 csoport ragasztónként), amelyek mindegyikét különböző koncentrációjú adalékolt ragasztóval kezelik. Kontrollként a Prime & Bond 2.1 rendszer NP-i nélkül (Dentsply Caulk, Milford). , DE) kerül felhasználásra.

   2.3.3. Helyreállítási eljárás és minta előkészítés: A ragasztórendszereket szigorúan a gyártó utasításai szerint kell felhordani.

   2.3.4 Ragasztási eljárások után: Minden fog mikrohibrid kompozit restaurációt kap két 2 mm-es lépésben. Minden lépést 40 másodpercig fénypolimerizálunk egy LED-fénykeményítő egység használatával 1200 mW/cm2 beállításon (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Ausztrália). A helyreállított fogakat 37°C-os desztillált vízben tárolják 24 órán keresztül, majd hosszirányban metszetre vágják mesio-distalis és bukkális-linguális irányban a ragasztott határfelületen egy lassú gyémántfűrész segítségével (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL), hogy 15-20 gyanta-dentin pálcikát kapjunk, amelyek keresztmetszete egyenként körülbelül 0,8 mm2 digitális tolómérővel mérve (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokió, Japán). szilárdság (mTBS), kivéve hat véletlenszerűen kiválasztott gyanta-dentin kötésű mintát, amelyeket felosztanak az in situ konverziós fok (DC) és nanoszivárgás (NL) mérésére.

   2.3.5. Mikro-feszítő kötési szilárdsági teszt: A gyanta-dentin kötésű pálcikákat cianoakrilát ragasztóval rögzítik egy Geraldeli's jig-hez, és feszítés alatt tesztelik (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brazília) 0,5 mm/perc sebességgel a meghibásodásig. Az mTBS értékek kiszámítása úgy történik, hogy a meghibásodáskori terhelést elosztjuk a keresztmetszeti kötési területtel. A minták meghibásodási módja kohéziós (kizárólag a dentin vagy gyanta kompoziton belüli tönkremenetel), ragasztó (hiba a gyanta/dentin határfelületen) vagy vegyes (meghibásodás a gyanta/dentin határfelületen, beleértve a szomszédos szubsztrátok kohéziós meghibásodását is) kategóriába sorolható. ). Az osztályozás sztereomikroszkóp alatt (SZ40; Olympus, Tokió, Japán) 100-szoros nagyítással történik. Az idő előtti meghibásodásokkal (PF) rendelkező minták beleszámítanak az átlagba.

   2.3.6. Az in situ konverzió mértéke: Minden egyes fogból három gyanta-dentin kötésű pálcikát nedvesen políroznak #1500, #2000 és #2500 SiC papírral. Ezután 20 percig ultrahanggal tisztítják, és 24 órán keresztül 37,8 °C-os vízben tárolják, mielőtt megmérnék az egyenáramot. A mikro-Raman spektroszkópiai analízist Senterra berendezéssel (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Wu¨rttemberg, Németország) végezzük. A mikro-Raman spektrométer kalibrálása úgy történik, hogy nullára állítjuk, majd megmérjük a szilícium minta együtthatóját. A minták elemzése a következő mikro-Raman paraméterekkel történik: 20 mW-os neonlézer 532 nm-en, térbeli felbontás 3 mm-nél, spektrális felbontás 5 cm-1-nél, akkumulációs idő 30 másodpercnél 6 együttadással és 110-szeres nagyítás ( Olympus UK, London, UK) 1 mm-es gerendaátmérőjűre. A spektrumot a dentin-adhezív határfelületen veszik három különböző helyen az intertubuláris dentin belül minden egyes gyanta-dentin kötésű pálcika esetében. Referenciaként a polimerizálatlan ragasztók spektrumait használjuk. A spektrumok utófeldolgozása a dedikált Opus Spectroscopy Software 6.5-ös verziójával történik. A monomer és a polimer kettőskötés-tartalmának arányát a ragasztóban kiszámítjuk: ahol "R" az alifás és aromás csúcsterületek aránya 1639 cm-1 és 1609 cm-1 polimerizált és nem polimerizált ragasztókban. Az ugyanabból a fogból származó összes gyanta-dentin kötésű pálcika in situ egyenáramát statisztikai célokra átlagoljuk.

   2.3.7. A nanoszivárgás értékelése: Mindegyik fogból három gyantával összekötött pálcikát helyeznek a Tay és munkatársai által leírt protokoll szerint elkészített ammóniás ezüst-nitrátba57, és 24 órán át sötétben tárolják. Ezután alaposan leöblítik őket desztillált vízben, és fluoreszcens fény alatt 8 órára fotóelőhívó oldatba merítik, hogy az ezüstionokat fémes ezüstszemcsékké redukálják a kötött felület mentén lévő üregekben. A mintákat #600, #1000, #1200, #1500, #2000 és #2500 SiC papírral, valamint 1 és 0,25 mm-es gyémántpasztával (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) nedvesen polírozzák. polírozó kendő. Ultrahanggal megtisztítják, levegőn szárítják, csonkra szerelik és szén-arany bevonattal látják el őket (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). A gyanta-dentin interfészeket tér-emissziós pásztázó elektronmikroszkóppal elemezzük, amely visszaszórt üzemmódban működik (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, UK). Minden gyanta-dentin kötésű pálcikáról három kép készül. Az egyes mintákban lévő ragasztó- és hibridrétegekben az NL relatív százalékos arányát az Image J szoftverrel58 egy vak kutató minden képen megméri. Az ugyanabból a mintából származó értékeket átlagoljuk, és az ugyanabból a fogból származó összes rúd átlagos NL értéke átlagos lesz.

   2.4 A biokompatibilitás és életképesség vizsgálata elsődleges tenyésztett ínyfibroblasztban 2.4.1 Sejttenyészetek: A humán fibroblasztok elsődleges tenyészeteit explantációs módszerrel nyerjük ki három felnőtt férfi egyed harmadik őrlőfogának retromoláris szövetéből.

   A Saos-2 humán osteosarcoma sejtvonalat, amelyet általában az oszteoblasztok és a bioanyagok közötti biokompatibilitás értékelésére használnak, az Alcaide és munkatársai által leírtak szerint tenyésztik 60.

   A sejteket 96 lyukú lemezre oltjuk 3000 sejt/lyuk sűrűséggel. 24 óra elteltével a kontrolltenyésztő tápközeget 100 µl különböző hígítású megfelelő ragasztóanyaggal helyettesítjük (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). A lemezeket 24, 48 és 72 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk. °C-os inkubátorban (5% CO2) az életképességi vagy sejthalál vizsgálatok előtt.

   2.4.2 Sejtéletképesség és sejtciklus elemzés: A humán fibroblasztok elsődleges tenyészetét explantációs módszerrel nyerjük ki három felnőtt férfi egyed harmadik őrlőfogának retromoláris szövetéből.

   A Saos-2 humán osteosarcoma sejtvonalat, amelyet általában az oszteoblasztok és a bioanyagok közötti biokompatibilitás értékelésére használnak, az Alcaide és munkatársai által leírtak szerint tenyésztik 60.

   A sejteket 96 lyukú lemezre oltjuk 3000 sejt/lyuk sűrűséggel. 24 óra elteltével a kontrolltenyésztő tápközeget 100 µl különböző hígítású megfelelő ragasztóanyaggal helyettesítjük (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). A lemezeket 24, 48 és 72 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk. °C-os inkubátorban (5% CO2) az életképességi vagy sejthalál vizsgálatok előtt.

   2.4.3 Életképes, korai apoptotikus, késői apoptotikus és nekrotikus sejtek mennyiségi meghatározása fluoreszcens mikroszkóppal: Kasibhatla és munkatársai által leírt protokollt alkalmazzuk 61. A sejteket akridinnarancs/etidium-bromid oldattal (AO/EB) festjük, és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáljuk. Az AO megfesti az élő és az elhalt sejteket is. Az EB csak azokat a sejteket fogja megfesteni, amelyek elvesztették a membrán integritását. Az élő sejtek egyenletesen zölden jelennek meg. A korai apoptotikus sejtek a kromatin kondenzációja és a nukleáris fragmentáció következtében zöldre festődnek, és élénkzöld pontokat tartalmaznak a magokban. A késői apoptotikus sejtek etidium-bromidot is tartalmaznak, és ezért narancssárgára festődnek, de a nekrotikus sejtekkel ellentétben a késői apoptotikus sejtek kondenzált és gyakran fragmentált magokat mutatnak. A nekrotikus sejtek narancssárgára festődnek, de nukleáris morfológiájuk az életképes sejtekéhez hasonlít, kondenzált kromatin nélkül61.

   2.4.4 Apoptózis kimutatása foszfatidilszerin expozícióval, DNS létra és apoptotikus mRNS és fehérjék mennyiségi meghatározásával: A foszfatidilszerin expozícióját a plazmamembrán külső felületén annexin V (A5)- allophycocyanin (APC) festéssel az apoptózis korai jeleként elemezzük. ahogy azt Alcaide et al60. Az APC szonda fluoreszcenciáját áramlási citometriával elemezzük.

   Az apoptotikus DNS-létra-vizsgálatot DNS-létrakészlettel (Roche, Németország) végezzük.

   A tumorszuppresszor (p53), pro-apoptotikus (bax, kaszpáz 3) és anti-apoptotikus (bcl-2) mediátorok mRNS és fehérje szintjét kvantitatív PCR és immunblot segítségével vizsgáljuk.

   2.4.5 Az autofágia értékelése: A fém NP-k sejt autofágiára gyakorolt ​​feltételezett hatásainak tesztelése érdekében különböző autofágia markerekkel foglalkozunk. Az autofág fluxust és a p62 szintet Western blot segítségével detektáljuk, az autofagoszómákat pedig fluoreszcens mikroszkóppal, az LC3 pozitív puncta63 megszámlálásával.

3. Ragasztó nanokompozitok metalloproteáz szintjének és/vagy aktivitásának és biokompatibilitásának értékelése in vivo.

   Az extrahálásra javasolt premolárisok helyreállítása hagyományos ragasztóval vagy adhezív nanokompozit segítségével történik. Egy hónap elteltével (telefonos visszahívás és a klinikai vizsgálatot követően) a betegeket megvizsgálják, a premolárisokat pedig vakkiértékelők (számokkal kódolva) a leírtak szerint minden szakaszban kivonják és elemzik. A premoláris extrakciót a fogászat oktatói végzik, a beavatkozás utáni hatásokat a kutatócsoport vállalja és oldja meg, a betegek számára a beavatkozások ingyenesek, és mindenben szigorúan be kell tartani a kari etikai bizottság ajánlásait. a chilei egyetem fogászatáról.

   3.1 Ragasztó nanokompozitok in vivo értékelése: Hetven olyan önkéntest választanak ki a Chilei Egyetem Klinikájának Fogszabályozási Specializációs Programjából, akiknél fogszabályozási okokból a jobb és a bal felső első előfogat extrahálni kell (n = 35 csoportonként). 3 hónapos toborzási időszaknak kell lennie, egy nyomon követésért felelős társvizsgálóval (CB)). A felvételi kritériumok a következők: (1) a fogszabályozási okokból történő premoláris extrakciót feltüntető kezelési tervek, (2) egészséges, ép, nem szuvas, nem helyreállított és teljesen kitört kezelt fogak jelenléte, és (3) jól kontrollált egészségi állapotú betegek amelyek lehetővé teszik a kutatás során minden eljárás minimális kockázattal történő végrehajtását. A kizárási kritériumok a következők lesznek: (1) a betegek, akik nem vállalják, hogy önkéntesen részt vegyenek a vizsgálatban, és (2) olyan betegek, akik nem felelnek meg az összes felvételi kritériumnak. Egy kalibrált kezelő végez egy kis okkluzális előkészítést a fog közepén egy hengeres gyémánt segítségével. bur (.63109/018,Medium Grit (60730025), Dentsply,NY,USA) és egy nagy sebességű kézidarab, miközben levegő-víz permetet biztosít szabványos 3x3x5 mm-es méretekkel. Az üreg előkészítése után gyanta kompozittal (Filtek Supreme; 3M ESPE) töltjük fel. A Cu-val és Zn-nel adalékolt kísérleti ragasztókat a gyártó utasításai szerint használjuk, a nem adalékolt ragasztót pedig kontrollként a homológ felső előmolárison és a párhuzamos csoportok egyszerű randomizálásával tervezzük. A gyanta kompozitot (Filtek Supreme; 3M ESPE) inkrementális technikával hordjuk fel, végül egy réteg ragasztót viszünk fel kompozit restauráció felületeként és 10 másodpercig polimerizáljuk. Az okklúziót ellenőrizni kell, és a restaurációkat a gyártó utasításai szerint befejezik és polírozzák. Ezt követően polírozással és végső kikészítéssel egy ragasztóréteget visznek fel a végső restaurációra, amely 10 másodpercig polimerizálódik (Raddi Cal, SDI, AU). Egyszerre egy-egy fogat húznak ki egy hónappal a helyreállítás után. A beteg infiltratív és intraligamentális érzéstelenítésben részesül (körülbelül 1,8 ml 2%-os mepivakain (36 mg)) 1:100 000 (18 mg) arányú epinefrinnel. Ezután a fogakat vizsgálatnak vetik alá.

   3.2 Ragasztó nanokompozitok felületi antimikrobiális tulajdonságainak meghatározása: Az adalékolt ragasztók antibakteriális felületi tulajdonságainak értékeléséhez egy utolsó ragasztóréteget kell felvinni a restaurációk végső felületére egy in vivo modellben. Az eljárást az S. Mutans CFU számának értékelésére fogják használni kompozit felületeken (fő eredmény). A biofilm mintavétele előtt a tálcákat előkészítik, hogy a biofilmet rányomják a restaurációkra. Ehhez az alkalmazáshoz eldobható fluorid gél felhordó tálcákat fogunk használni (Deepak Products Inc., Miami, USA), amelyek mindegyikét biológiailag biztonságos burkolatban (Esco Technologies Inc., Harboro, USA) ultraibolya fényben sterilizáljuk 30 percig. Ezután minden tálcát megtöltünk 7,5 ml TYCSB agarral (kazein, élesztőkivonat, L-cisztein, szacharóz, bacitracin) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA), amely szelektív táptalaj a S. mutans számára. Ezt követően a mintavételi technika egyedivé tétele érdekében a tálcákat úgy vágják le, hogy legfeljebb 3 fogra illeszkedjenek. Közvetlenül ezután a tálcákat steril Petri-tányérokba helyezzük, és lezárt műanyag zacskókban, hűtőszekrényben tároljuk. Használat előtt a tálcákat egy inkubátorba/tűzhelybe (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Korea) helyezzük 24 órára 37 °C-on minőség-ellenőrzési intézkedésként. A harmadik és negyedik kezelő végzi a mintavételt, amelyet 11:00-13:00 óra között végeznek, hogy lehetővé tegyék a biofilm-újrarendezést a reggeli fogmosást követően. A mintavételt egy vak kezelő végzi el, aki óvatosan nyomja a tálcát 20 másodpercig az RC-restauráció felett, majd homológ RC-restaurációt végez Cu vagy Zn-adalékolt ragasztóval vagy anélkül.

   Miután a mintátálcákat steril Petri-lemezeken tároltuk, 4 °C-on szállítják, majd 37 °C-on mikroaerofil (üveggyertya CO2 10%) 48 órán át inkubálják. A S.mutans számlálását a negyedik operátor fogja elvégezni, akit megvakítanak ahhoz a tálcához, amellyel az RC restaurációkat nyomtatták. Később Gram-festést végeznek a telepek mikromorfológiájának meghatározására. Az S. mutans számát a TYCSB agar lemezekről és tálcákról származó S. mutans kolóniaképző egységeiben (CFU) fejezzük ki. Az S. mutans adhéziójával és morfológiai jellemzőivel kompatibilis kolóniákat Todd-Hewitt táplevesben (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) szuszpendáljuk, és 37 °C-on 48 órán át inkubáljuk. A telepeket ezután biokémiai teszteknek vetik alá, hogy azonosítsák a S. mutans faját, és meg lehessen különböztetni a S. sobrinustól. A biokémiai tesztek közé tartozik a raffinóz fermentáció, a melibióz fermentáció és az eszkulin hidrolízis tesztje. Mindhárom teszt pozitív eredménye S. mutans jelenlétét jelzi.

   3.3 A metalloproteáz szintjének és/vagy aktivitásának értékelése macerált dentinszövetben a 2.4.2 pontban leírthoz hasonló módszertant használ. 3.3.1 Zimográfia in situ az MMP 2 és 9 aktivitásának értékelésére (eredmény): Mazzoni et al. 0,65-öt használnak 20 (n=5 csoportonként) frissen extrahált, korábbi eljárással helyreállított, nem szuvas humán felső premolárison. A zománc és a cement eltávolítása után 1 mm vastag középső/mély koronális dentin korongokat kapunk. A fluoreszceinnel jelölt zselatinból 1,0 mg/ml-es törzsoldatot készítettünk úgy, hogy 1,0 ml vizet adtunk a liofilizált szubsztrátot tartalmazó fiolákhoz, és felhasználásig -20 °C-on tároltuk. A zselatin törzsoldatot 1:8 arányban hígítjuk a hígítópufferrel (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0), és egy fakulásgátló szert adunk hozzá (Mounting Medium with Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, Egyesült Királyság). A fluoreszcens zselatin keverékből 50 μl-t helyezünk minden lemez tetejére, és fedjük le fedőlemezzel. A tárgylemezek fényvédettek, és párásított kamrákban, 37 °C-on inkubálhatók. Az optimális inkubációs időszak meghatározásához fluoreszcens képeket készítünk 1 órától 7 napig. Az in situ zimográfia 3D analízisének részletes leírása konfokális mikroszkóppal. Röviden, a kioltott fluoreszceinnel konjugált zselatin szubsztrát hidrolízisét, amely az endogén zselatinolitikus enzimaktivitást jelzi, többfoton konfokális mikroszkóppal (pl.: 488 nm, és em: lp530 nm; Zeiss, LSM Ze88,0, LSM Ze88, Oberkocheniss, , Németország). Különböző fókuszsíkokból 85 μm vastag optikai metszeteket gyűjtöttünk be, majd a halmozott képeket a ZEN 2010 szoftverrel (Carl Zeiss) elemeztük, számszerűsítettük és feldolgoztuk.

   3.4. A biokompatibilitás meghatározása. A fogászati ​​pépet az extrahált premolárisokból nyerik, és a sejtek életképességének (eredményeinek) vagy a ragasztós nanokompozitok által okozott sejtkárosodásnak a molekuláris markereit kezelik.

   A fogpép a Vaseemuddin66 által leírtak szerint nyerhető ki extrahált premolárisokból. A teljes RNS-t elválasztjuk, és a specifikus apoptózis és autofágia markerek mRNS-szintjét qPCR-rel mérjük, a korábban leírtak szerint (2.4.4-2.4.5).

   3.5 A mechanikai tulajdonságok értékelése (nanoszivárgási és fokú konverziós elemzés a kötés stabilitásának felmérésére (eredmény)) megegyezik a 2.1.

4. Statisztikai elemzés: A statisztikai elemzés az SPSS 23.0 szoftverrel (IBM, New York, NY, USA) történik. A kvantitatív változók (mikrotensilis kötési szilárdság, nanoszivárgás, konverzió mértéke, CFU-szám) összehasonlítását két független csoport között páratlan t-próbával, ANOVA-val és pots-hoc teszttel (vagy a Shapiro-Wilk szerinti megfelelő nem-paraméteres tesztekkel) elemezzük. adatelosztás tesztelése). A mintameghatározások közötti asszociációkat Pearson- vagy Spearman-féle korrelációval számítjuk ki. A teljesítményszámítást egy korábbi tanulmány adatai alapján végezték el67. Csoportonként és vizsgálati ágonként legalább 35 betegből álló mintanagyságra volt szükség ahhoz, hogy statisztikailag szignifikáns különbséget találjunk a végső CFU-számban (fő kimenetel), figyelembe véve a Vildosola és egy tanulmánya alapján 0,8-as statisztikai erőt64 (1). -β). A szignifikancia akkor lesz figyelembe véve, ha a p érték