Wpływ włączenia nanocząstek miedzi i cynku do klejów dentystycznych (1170575)

Cel ogólny Ocena wpływu wprowadzenia nanocząstek miedzi lub cynku do kleju dentystycznego na jego działanie przeciwdrobnoustrojowe oraz ich wpływ na aktywność metaloproteaz macierzy zębiny. Analiza właściwości mechanicznych kleju i biozgodności. Cele szczegółowe

1. Opracowanie i strukturalna charakterystyka kleju dentystycznego domieszkowanego nanocząstkami miedzi lub cynku.

   1.1. Przygotowanie nanokompozytów adhezyjnych; 1.2. Charakterystyka strukturalna adhezyjnych nanokompozytów.

2. Ocena mechanicznych, biochemicznych i funkcjonalnych efektów adhezyjnych nanokompozytów in vitro. Omówione zostaną testy porównujące dodanie kleju kontrolnego lub kleju domieszkowanego miedzią lub cynkiem na świeżo usuniętych zębach (np. faza życia) 2.1. Aby przetestować aktywność przeciwdrobnoustrojową kleju; 2. 2. Zbadanie wpływu nanokompozytów adhezyjnych na poziom i/lub aktywność metaloproteaz macierzy;2.3. Ocena właściwości mechanicznych kleju; 2.4. Aby ocenić biokompatybilność. Omówione zostaną testy żywotności w pierwotnej hodowli fibroblastów dziąseł.
3. Ocena modelu in vivo (faza kliniczna) właściwości przeciwdrobnoustrojowych, poziomów i/lub aktywności metaloproteaz macierzy i katepsyny B, biokompatybilności nanokompozytów adhezyjnych in vivo oraz właściwości mechanicznych. Zęby przedtrzonowe wskazane do ekstrakcji zostaną odbudowane przy użyciu tradycyjnego systemu wiążącego lub nanokompozytu adhezyjnego. Po miesiącu zęby przedtrzonowe zostaną usunięte i poddane analizie zgodnie z opisem.

3.1. Określenie powierzchniowych właściwości przeciwdrobnoustrojowych nanokompozytów adhezyjnych; 3.2. Ocena poziomu metaloproteaz macierzy i katepsyny B i/lub aktywności w zmacerowanej tkance zębiny;3.3 Aby określić biokompatybilność. Miazga zębowa będzie pozyskiwana z usuniętych zębów przedtrzonowych, a molekularne markery żywotności komórek lub uszkodzeń komórek zostaną skierowane na adhezyjne nanokompozyty;3.4 Ocena właściwości mechanicznych kleju.

METODY

1. Opracowanie kleju dentystycznego domieszkowanego nanocząstkami miedzi lub cynku. 1.1. Przygotowanie nanokompozytów adhezyjnych (1): CuNP/nanokompozyty adhezyjne zostaną przygotowane przy użyciu jednobutelkowego systemu adhezyjnego Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Ten klej na bazie acetonu zawiera mieszaninę dimetakrylanu uretanu i kwaśnego monomeru dipentaerytrytopentaakrylanomonofosforanu. Aby przygotować nanokompozyty adhezyjne, odpowiednie ilości proszku nanocząsteczkowego (CuNp i ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chile) zostaną odważone i dodane bezpośrednio do butelki z klejem przy ciągłym mieszaniu magnetycznym. Zawiesina będzie następnie dalej dyspergowana w łaźni ultradźwiękowej w temperaturze 37°C przez 10 minut. Nanokompozyty adhezyjne zostaną przygotowane z zawartością CuNP w zakresie od 0,015 do 0,045% wag., zgodnie z wcześniejszymi danymi z naszych laboratoriów. Pięć stężeń klejów domieszkowanych Cu i Zn będzie wynosić 0,0150%, 0,0075% i 0,00038% (stężenia o właściwościach antybakteryjnych na podstawie naszych wcześniejszych danych (Cu 1-2-3 i Zn 1-2-3).

   1.2. Charakterystyka strukturalna nanokompozytów adhezyjnych (1): Morfologia i skład nanokompozytowych materiałów adhezyjnych zostaną scharakteryzowane za pomocą SEM-EDX w trybie wstecznie rozproszonych elektronów w celu wytworzenia kontrastu fazowego i mikroskopii AFM. Struktura chemiczna matrycy polimerowej i zawartość resztkowych monomerów zostaną przeanalizowane za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera i ramanowskiej z osłabionym całkowitym odbiciem. Resztkowy monomer będzie analizowany z uwzględnieniem drgań podwójnego wiązania węgiel-węgiel monomeru akrylowego w zakresie 1684 - 1636 cm-1.

2. Ocena działania antybakteryjnego, mechanicznego, biochemicznego i funkcjonalnego nanokompozytów adhezyjnych in vitro i ex vivo. Omówione zostaną testy porównujące dodanie zwykłego kleju lub kleju domieszkowanego miedzią lub cynkiem.

   2.1. Badanie właściwości przeciwdrobnoustrojowych nanokompozytu adhezyjnego (2) 2.1.1 Działanie antybakteryjne: Pokrótce, 10-milimetrowe krążki o grubości 2 mm zostaną wytworzone przy użyciu kompozytu żywicy (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) i pozostawione bez powłoki (kontrola) lub pokryte klejem Prime&Bond 2.1 i równoważne eksperymentalnie mieszanki klejów dwunastu grup i polimeryzowano zgodnie z zaleceniami producenta przez 10 sekund przy użyciu urządzenia do utwardzania światłem LED (Radii Cal,SDI,AU) przy gęstości mocy 1000 mW/cm2. Krążki amalgamatu (Contour; Kerr, Orange, CA) zostaną wytworzone zgodnie z wcześniejszym opisem i użyte jako dodatkowa kontrola pozytywna. W tej części doświadczenia zostanie ocenionych ogółem czternaście grup badawczych, po osiem próbek na grupę: (1) kontrola; (2) amalgamat (materiał metaliczny stosowany jako kontrola pozytywna) i 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 i 8) Zn3. Aby zapewnić usunięcie niespolimeryzowanego monomeru, krążki należy zanurzyć w 10 ml sterylnej dejonizowanej wody i mieszać przez 2 godziny przy 200 obr./min w temperaturze 37,8°C, po czym pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na co najmniej 24 godziny. Krążki będą sterylizowane przez inkubację w 70% etanolu przez 10 minut, a następnie suszone aseptycznie przez co najmniej 48 godzin. Powierzchnia każdego krążka zostanie zaszczepiona 100 ml określonego żywego stężenia 1,108 komórek/ml hodowanych beztlenowo Streptococcus mutans, ATCC1 25175 w infuzji mózgowo-sercowej (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) . Aby określić stężenie żywotnych komórek dla każdej badanej grupy w jednostkach tworzących kolonie na ml (CFU/ml), zaszczepione krążki zostaną poddane obróbce beztlenowej, po czym zostanie określona całkowita liczba odzyskanych CFU.

   2.2. Ocena in vitro i ex vivo aktywności MMP (1-2) 2.2.1 Test hamowania aktywności MMP (in vitro): Ilościowa aktywność MMP-2, MMP-8 i MMP-9 in vitro zostanie określona za pomocą komercyjnego testu fluorometrycznego MMP zestawy (zestawy testowe SensoLyte; AnaSpec, San Jose, CA, USA) do badań przesiewowych aktywności anty-MMP. Do buforu reakcyjnego zostaną dodane kleje domieszkowane Cu i ZnNP w różnych stężeniach oraz kontrole bez klejów Cu lub ZnNP, a oznaczenie zostanie przeprowadzone zgodnie z zaleceniami producenta. Po rozszczepieniu na 2 oddzielne fragmenty przez MMP, fluorescencja 5-FAM będzie monitorowana przez fluorescencyjny czytnik mikropłytek (Sinergy TM).

   2.2.2 Oznaczanie aktywności i poziomów MMP (próbki zębiny ex vivo z próbkami uzyskanymi z odbudowanych zębów za pomocą domieszkowanych substancji wiążących i kontrola): Dwadzieścia pięć (n=5) usuniętych ludzkich trzecich zębów trzonowych wolnych od próchnicy zostanie pobranych po uzyskaniu informacji od pacjentów zgoda. Zęby zostaną zdezynfekowane w 0,5% chloraminie, przechowywane w wodzie destylowanej i zużyte w ciągu sześciu miesięcy od ekstrakcji. Niewielka preparacja okluzyjna o znormalizowanych wymiarach 3x3x5 mm zostanie wykonana przez skalibrowanego operatora w środku zęba za pomocą cylindrycznego wiertła diamentowego (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) i wysokoobrotowej rękojeści, jednocześnie zapewniając strumień powietrza i wody. Po zakończeniu preparacji ubytku zostanie on wypełniony kompozytem żywicznym (Filtek Supreme; 3M ESPE). Eksperymentalne kleje domieszkowane Cu i Zn zostaną użyte zgodnie z zaleceniami producenta, a klej nie domieszkowany zostanie użyty jako kontrola na homologicznym górnym przedtrzonowcu. Kompozyt żywiczny (Filtek Supreme; 3M ESPE) zostanie nałożony techniką przyrostową. Szkliwo zostanie całkowicie usunięte za pomocą wolnoobrotowej piły diamentowej (Remet, Bolonia, Włochy) z irygacją solą fizjologiczną, a zęby zostaną pocięte w celu uzyskania płatków zębiny koronowej o grubości 1 mm, które następnie zostaną sproszkowane za pomocą Młot stalowy. Następnie sproszkowana zębina zostanie równomiernie rozdrobniona i zdemineralizowana (w temperaturze 4°C przez 24 godziny z mieszaniem) w jednym z następujących roztworów wodnych: (1) 0,87 M kwas octowy, pH = 2,3; (2) 0,26 M kwas cytrynowy, pH = 2,3; lub (3) 0,5 M EDTA, pH = 6,4; lub (4) 0,5 M EGTA, pH = 6,4. Ekstrakcja enzymatyczna zdemineralizowanej zębiny zostanie zawieszona w buforze ekstrakcyjnym (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, zawierający 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,1% NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2, 0,02% NaN3) i koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Próbki będą następnie poddawane działaniu ultradźwięków przy mocy wyjściowej 40 W przez 3 impulsy po 10 sekund każdy w temperaturze 4°C (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA). Fiolki będą wirowane przy 18 000 obr./min przez 30 min w 4°C i zebrane zostaną supernatanty. Wszystkie białka obecne w supernatantach zostaną wytrącone w temperaturze 4°C przez dodanie sproszkowanego siarczanu amonu (wag./obj.) do uzyskania końcowego stężenia 85% i pH 7,0. Osad zostanie zebrany przez odwirowanie przy 24 000 obr./min przez 30 min w 4°C, ponownie rozpuszczony w 10-krotnym rozcieńczeniu w buforze do ekstrakcji, dializowany przez 30-kDa membranę wobec buforu do ekstrakcji przez noc i przechowywany w 4°C do czasu analizy. Następnie proszek zębinowy zostanie poddany analizie w celu oceny poziomów aktywności MMP-2, MMP-9 i katepsyny B mierzonej za pomocą zymografii żelatynowej oraz w celu oceny MMP-8 za pomocą zymografii kolagenu, jak opisano wcześniej.56 Densytometria zostanie wyrażona jako du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA). Pokrótce, próbki proszku zębiny zostaną poddane elektroforezie w nieredukujących warunkach denaturujących w żelach SDS/PAGE zawierających 1 mg/ml żelatyny lub 0,1 mg/ml kolagenu jako substratów. Następnie zostaną namoczone dwukrotnie w 2,5% Triton X-100 i inkubowane przez 17 godzin w buforze do rozwijania (20 mM Tris pH 7,4 i 5 mM CaCl2), wybarwione Coomassie Brilliant Blue R-250 i odbarwione 10% kwasem octowym i 20% roztwór metanolu. Poziomy MMP-2, MMP-8, MMP-9, katepsyny B i ICTP (jako markera hydrolizy kolagenu zębiny) zostaną określone za pomocą komercyjnego zestawu ELISA lub multipleksowych testów immunologicznych (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, dla technologii Luminex) zgodnie z zaleceniami producenta.

   2.3. Badanie właściwości mechanicznych nanokompozytów adhezyjnych (1-2) Siła wiązania 2.3.1 Wybór i preparacja zęba: Siedemdziesiąt usuniętych ludzkich trzecich zębów trzonowych wolnych od próchnicy zostanie pobranych po uzyskaniu świadomej zgody pacjentów kliniki dentystycznej Uniwersytetu Chile (≈2000 III ekstrakcji zębów trzonowych rocznie, zapewniając dostępność tych zębów, które normalnie są odrzucane). Zęby zostaną zdezynfekowane w 0,5% chloraminie, przechowywane w wodzie destylowanej i zużyte w ciągu sześciu miesięcy od ekstrakcji. Płaska powierzchnia zębiny zostanie odsłonięta po zeszlifowaniu na mokro szkliwa okluzyjnego papierem #180 SiC. Odsłonięte powierzchnie zębiny będą dalej polerowane mokrym papierem #600 SiC przez 60 sekund w celu ujednolicenia warstwy mazistej.

   2.3.2 Projekt eksperymentu: Zęby zostaną losowo przydzielone do dwunastu grup po pięć (6 grup na klej), z których każda zostanie potraktowana innym stężeniem domieszkowanego kleju. Jako kontrola bez NP systemu Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE) zostaną wykorzystane.

   2.3.3. Procedura odtwórcza i przygotowanie preparatu: Systemy adhezyjne należy nakładać ściśle według instrukcji producenta.

   2.3.4 Po zabiegach bondingu: Wszystkie zęby otrzymają odbudowę kompozytową mikrohybrydową w dwóch warstwach co 2 mm. Każdy przyrost będzie polimeryzowany światłem przez 40 sekund przy użyciu urządzenia do utwardzania światłem LED przy ustawieniu 1200 mW/cm2 (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australia). Odbudowane zęby będą przechowywane w wodzie destylowanej w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie pocięte wzdłużnie w kierunku mezjalno-dystalnym i policzkowo-językowym w poprzek sklejonej powierzchni styku za pomocą wolnoobrotowej piły diamentowej (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) w celu uzyskania 15 do 20 sztyftów z żywicy i zębiny, każdy o powierzchni przekroju około 0,8 mm2 mierzonej suwmiarką cyfrową (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokio, Japonia). Każda próbka z każdego zęba zostanie oceniona pod kątem przyczepności mikrorozciągliwej wytrzymałości (mTBS) z wyjątkiem sześciu losowo wybranych próbek związanych żywicą z zębiną, które zostaną podzielone w celu pomiaru stopnia konwersji in situ (DC) i nanoprzecieku (NL).

   2.3.5. Badanie siły wiązania mikrorozciągliwego: Patyczki połączone żywicą z zębiną zostaną przymocowane do przyrządu Geraldeli za pomocą kleju cyjanoakrylanowego i przetestowane pod obciążeniem (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brazylia) przy 0,5 mm/min, aż do zniszczenia. Wartości mTBS zostaną obliczone poprzez podzielenie obciążenia w chwili zniszczenia przez powierzchnię wiązania przekroju poprzecznego. Tryb uszkodzenia próbek zostanie sklasyfikowany jako kohezyjny (uszkodzenie wyłącznie w obrębie zębiny lub kompozytu żywicy), adhezyjny (uszkodzenie na styku żywica/zębina) lub mieszany (uszkodzenie na styku żywica/zębina, w tym uszkodzenie spoistości sąsiednich podłoży ). Klasyfikacja zostanie przeprowadzona pod mikroskopem stereoskopowym (SZ40; Olympus, Tokio, Japonia) przy powiększeniu 100x. Próbki z przedwczesnymi niepowodzeniami (PF) zostaną uwzględnione w średniej.

   2.3.6. Stopień konwersji in situ: Trzy patyczki połączone żywicą z zębiną z każdego zęba zostaną wypolerowane na mokro papierem SiC #1500, #2000 i #2500. Następnie będą czyszczone ultradźwiękami przez 20 minut i przechowywane w wodzie o temperaturze 37,8°C przez 24 godziny przed pomiarem prądu stałego. Analiza spektroskopii mikro-Ramanowskiej zostanie przeprowadzona przy użyciu aparatu Senterra (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Badenia-Wirtembergia, Niemcy). Kalibracja mikrospektrometru ramanowskiego zostanie przeprowadzona poprzez wyzerowanie go, a następnie pomiar współczynnika próbki krzemu. Próbki będą analizowane przy użyciu następujących parametrów mikro-ramanowskich: laser neonowy 20 mW przy 532 nm, rozdzielczość przestrzenna przy 3 mm, rozdzielczość widmowa przy 5 cm-1, czas akumulacji przy 30 sekundach z 6 współaddycjami i powiększenie przy 110x ( Olympus UK, London, UK) do średnicy wiązki 1 mm. Widma zostaną pobrane na styku zębina-adhezyjny w trzech różnych miejscach w obrębie zębiny między kanalikami dla każdego sztyftu związanego żywicą-zębiną. Widma niespolimeryzowanych klejów zostaną wykorzystane jako odnośniki. Obróbka końcowa widm zostanie przeprowadzona przy użyciu dedykowanego oprogramowania Opus Spectroscopy Software w wersji 6.5. Obliczony zostanie stosunek zawartości wiązań podwójnych monomeru do polimeru w kleju: gdzie „R” jest stosunkiem powierzchni pików alifatycznych i aromatycznych przy 1639 cm-1 i 1609 cm-1 w klejach spolimeryzowanych i niespolimeryzowanych. DC in situ wszystkich pałeczek połączonych żywicą z zębiną z tego samego zęba zostanie uśrednione do celów statystycznych.

   2.3.7. Ocena nanoprzecieku: Trzy połączone żywicą patyczki z każdego zęba zostaną umieszczone w amoniakalnym azotanie srebra przygotowanym zgodnie z protokołem opisanym przez Tay i wsp.57 i przechowywane w ciemności przez 24 godziny. Następnie zostaną one dokładnie wypłukane w wodzie destylowanej i zanurzone w roztworze do wywoływania zdjęć na 8 godzin w świetle fluorescencyjnym, aby zredukować jony srebra do ziaren metalicznego srebra w pustych przestrzeniach wzdłuż sklejonej powierzchni. Próbki będą polerowane na mokro papierem SiC #600, #1000, #1200, #1500, #2000 i #2500 oraz pastą diamentową 1 i 0,25 mm (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) przy użyciu ściereczka do polerowania. Zostaną oczyszczone ultradźwiękami, wysuszone powietrzem, zamontowane na odcinkach i pokryte złotem węglowym (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). Granice faz żywica-zębina będą analizowane w skaningowym mikroskopie elektronowym z emisją polową pracującym w trybie rozproszenia wstecznego (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, UK). Wykonane zostaną trzy zdjęcia każdego sztyftu związanego z żywicą i zębiną. Względny procent NL w warstwie adhezyjnej i hybrydowej w każdej próbce zostanie zmierzony na wszystkich obrazach za pomocą oprogramowania Image J58 przez zaślepionego badacza. Wartości z tej samej próbki zostaną uśrednione, a średnia NL wszystkich pałeczek z tego samego zęba będzie średnia.

   2.4 Ocena biozgodności, testy żywotności w hodowlach pierwotnych fibroblastów dziąsłowych 2.4.1 Hodowle komórkowe: Pierwotne hodowle ludzkich fibroblastów zostaną uzyskane metodą eksplantacji z tkanki zatrzonowcowej trzecich zębów trzonowych trzech dorosłych osobników płci męskiej.

   Linia komórkowa ludzkiego kostniakomięsaka Saos-2, powszechnie stosowana do oceny biokompatybilności między osteoblastami a biomateriałami, będzie hodowana w sposób opisany przez Alcaide i wsp.60.

   Komórki zostaną wysiane na 96-studzienkową płytkę z gęstością 3000 komórek na studzienkę. Po 24h pożywkę kontrolną należy zastąpić 100 µl różnych rozcieńczeń odpowiedniego kleju (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). Płytki inkubować przez 24h, 48h i 72h w 37h °C inkubator (5% CO2) przed testami żywotności lub śmierci komórek.

   2.4.2 Analiza żywotności komórek i cyklu komórkowego: Pierwotne hodowle ludzkich fibroblastów zostaną uzyskane metodą eksplantacji z tkanki zatrzonowcowej trzecich zębów trzonowych trzech dorosłych osobników płci męskiej.

   Linia komórkowa ludzkiego kostniakomięsaka Saos-2, powszechnie stosowana do oceny biokompatybilności między osteoblastami a biomateriałami, będzie hodowana w sposób opisany przez Alcaide i wsp.60.

   Komórki zostaną wysiane na 96-studzienkową płytkę z gęstością 3000 komórek na studzienkę. Po 24h pożywkę kontrolną należy zastąpić 100 µl różnych rozcieńczeń odpowiedniego kleju (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). Płytki inkubować przez 24h, 48h i 72h w 37h °C inkubator (5% CO2) przed testami żywotności lub śmierci komórek.

   2.4.3 Oznaczenie ilościowe żywotnych, wczesnych, późnych apoptotycznych i nekrotycznych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej: zostanie wykorzystany protokół opisany przez Kasibhatla i wsp. 61. Komórki będą barwione roztworem oranżu akrydynowego/bromku etydyny (AO/EB) i będą badane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. AO zabarwi zarówno żywe, jak i martwe komórki. EB wybarwi tylko komórki, które utraciły integralność błony. Żywe komórki będą wyglądać na jednolicie zielone. Wczesne komórki apoptotyczne będą zabarwiać się na zielono i zawierać jasnozielone kropki w jądrach w wyniku kondensacji chromatyny i fragmentacji jądra. Późne komórki apoptotyczne będą również zawierały bromek etydyny i dlatego zabarwią się na pomarańczowo, ale w przeciwieństwie do komórek nekrotycznych, komórki późnej apoptozy będą wykazywać skondensowane i często fragmentaryczne jądra. Komórki martwicze wybarwiają się na pomarańczowo, ale mają morfologię jądra przypominającą żywe komórki, bez skondensowanej chromatyny61.

   2.4.4 Wykrywanie apoptozy przez ekspozycję na fosfatydyloserynę, drabinkowanie DNA oraz ilościowe oznaczenie apoptotycznego mRNA i białek: Ekspozycja fosfatydyloseryny na zewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej będzie analizowana jako wczesny sygnał apoptozy poprzez barwienie aneksyną V (A5)- allofikocyjaniną (APC), jak opisano w Alcaide i wsp.60. Fluorescencja sondy APC będzie analizowana metodą cytometrii przepływowej.

   Test drabiny apoptotycznej DNA zostanie przeprowadzony przy użyciu zestawu drabinkowego DNA (Roche, Niemcy).

   Poziomy mRNA i białek dla mediatorów supresorowych guza (p53), proapoptotycznych (bax, kaspaza 3) i antyapoptotycznych (bcl-2) zostaną zbadane za pomocą ilościowego PCR i immunoblotu.

   2.4.5 Ocena autofagii: Aby przetestować przypuszczalny wpływ nanocząstek metali na autofagię komórek, zostaną omówione różne markery autofagii. Przepływ autofagiczny i poziom p62 zostaną wykryte metodą Western blot, a autofagosomy zostaną zwizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez zliczenie LC3-dodatnich puncta63.

3. Ocena poziomu i/lub aktywności metaloproteaz oraz biokompatybilności nanokompozytów adhezyjnych in vivo.

   Zęby przedtrzonowe wskazane do ekstrakcji zostaną odbudowane przy użyciu tradycyjnego systemu wiążącego lub nanokompozytu adhezyjnego. Po miesiącu (po kontakcie telefonicznym i po badaniu klinicznym) pacjenci zostaną zbadani, a zęby przedtrzonowe zostaną usunięte i przeanalizowane przez ślepych ewaluatorów (skodyfikowanych liczbowo) na wszystkich etapach zgodnie z opisem. Ekstrakcje zębów przedtrzonowych będą prowadzone przez nauczycieli stomatologii, wszelkie efekty pozabiegowe będą zakładane i rozwiązywane przez zespół badawczy, zabiegi dla pacjentów są bezpłatne, a wszystko ściśle przestrzegane będzie zaleceń wydziałowej komisji etycznej stomatologii Uniwersytetu Chile.

   3.1 Ocena in vivo adhezyjnych nanokompozytów: Siedemdziesięciu ochotników wymagających ekstrakcji górnych prawych i lewych pierwszych zębów przedtrzonowych (n = 35 na grupę) ze względów ortodontycznych zostanie wybranych z programu specjalizacji ortodontycznej w klinice Uniwersytetu Chile (będzie tam być okresem rekrutacji trwającym 3 miesiące ze współbadaczem odpowiedzialnym za monitorowanie (CB)). Kryteriami włączenia będą (1) plany leczenia wskazujące na ekstrakcje zębów przedtrzonowych ze względów ortodontycznych, (2) obecność zdrowych, nienaruszonych, niepróchnicowych, nieodbudowanych iw pełni wyrzniętych zębów leczonych oraz (3) pacjenci z dobrze kontrolowanymi warunkami zdrowotnymi które pozwalają na wykonanie wszystkich procedur w badaniu przy minimalnym ryzyku. Kryteriami wykluczenia będą (1) pacjenci, którzy nie zgodzą się na ochotnika do badania oraz (2) pacjenci niespełniający wszystkich kryteriów włączenia. Niewielka preparacja okluzyjna zostanie wykonana przez skalibrowanego operatora w centrum zęba za pomocą cylindrycznego diamentu wiertła (.63109/018,Medium Grit (60730025), Dentsply, NY,USA) i szybkoobrotowej rękojeści, zapewniając jednocześnie natrysk wodno-powietrzny o znormalizowanych wymiarach 3x3x5 mm. Po zakończeniu preparacji ubytku zostanie on wypełniony kompozytem żywicznym (Filtek Supreme; 3M ESPE). Eksperymentalne kleje z domieszką Cu i Zn zostaną użyte zgodnie z instrukcjami producenta, a klej bez domieszki zostanie użyty jako kontrola homologicznego górnego zęba przedtrzonowego i projektu poprzez prostą randomizację grup równoległych. Kompozyt żywiczny (Filtek Supreme; 3M ESPE) zostanie nałożony techniką przyrostową, a na koniec jedna warstwa kleju zostanie nałożona jako powierzchnia uzupełnienia kompozytowego i polimeryzowana przez 10 sek. Zgryz zostanie sprawdzony, a uzupełnienia zostaną wykończone i wypolerowane zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie polerowanie i ostateczne wykończenie zostaną wykorzystane do nałożenia warstwy adhezyjnej na ostateczne uzupełnienie, które będzie polimeryzowane przez 10 sekund (Raddi Cal, SDI, AU). Jeden ząb na raz zostanie usunięty miesiąc po wykonaniu uzupełnień. Pacjent otrzyma znieczulenie nasiękowe i śródwięzadłowe (około 1,8 ml 2% mepiwakainy (36 mg)) z adrenaliną w stosunku 1:100 000 (18 mg). Następnie zęby zostaną poddane badaniom.

   3.2 Określenie powierzchniowych właściwości przeciwdrobnoustrojowych nanokompozytów adhezyjnych: Aby ocenić właściwości antybakteryjne powierzchniowych domieszkowanych substancji adhezyjnych, jedna końcowa warstwa substancji adhezyjnych zostanie nałożona na ostateczną powierzchnię uzupełnień protetycznych w modelu in vivo. Procedura zostanie wykorzystana do oceny liczby CFU S.Mutans na powierzchniach kompozytowych (główny wynik). Przed pobraniem próbki biofilmu zostaną przygotowane tace do drukowania biofilmu na uzupełnieniach. Do tego zastosowania użyjemy jednorazowych tacek do aplikacji żelu fluorkowego (Deepak Products Inc., Miami, USA), z których każda zostanie wysterylizowana w kapturze bezpieczeństwa biologicznego (Esco Technologies Inc., Harboro, USA) w świetle ultrafioletowym przez 30 minut. Następnie każdą tacę napełni się 7,5 ml agaru TYCSB (kazeina, ekstrakt drożdżowy, L-cysteina, sacharoza, bacytracyna) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA), który jest podłożem selektywnym dla S. mutans. Następnie, w celu zindywidualizowania techniki pobierania próbek, łyżki zostaną przycięte tak, aby pasowały nie więcej niż 3 zęby. Natychmiast po tym tace zostaną umieszczone na sterylnych płytkach Petriego i przechowywane w szczelnych plastikowych torebkach w lodówce. Przed użyciem tacki zostaną umieszczone w inkubatorze/piecu (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Korea) na 24 godziny w temperaturze 37°C jako środek kontroli jakości. Trzeci i czwarty operator przeprowadzą pobieranie próbek w godzinach 11:00-13:00, aby umożliwić reorganizację biofilmu po porannym szczotkowaniu. Pobieranie próbek zostanie przeprowadzone przez niewidomego operatora, który delikatnie dociska łyżkę przez 20 s nad uzupełnieniem RC, po czym następuje homologiczne uzupełnienie RC z lub bez środka wiążącego z domieszką Cu lub Zn.

   Po przechowywaniu tacek z próbkami na sterylnych płytkach Petriego będą one transportowane w temperaturze 4°C, a następnie inkubowane w temperaturze 37°C w mikroaerofilu (słoik ze świecą CO2 10%) przez 48 godzin. Liczenie S.mutans będzie wykonywane przez czwartego operatora, który będzie zaślepiony na tackę użytą do wydrukowania uzupełnień RC. Później zostanie przeprowadzone barwienie metodą Grama w celu określenia mikromorfologii kolonii. Liczba S.mutans zostanie wyrażona w jednostkach tworzących kolonie (CFU) S.mutans z płytek i tacek z agarem TYCSB. Wybrane kolonie, które będą zgodne z adhezją i cechami morfologicznymi S. mutans, zostaną zawieszone w bulionie Todd-Hewitt (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) i inkubowane w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Kolonie zostaną następnie poddane testom biochemicznym w celu identyfikacji gatunku S. mutans i odróżnienia go od S. sobrinus. Testy biochemiczne obejmują fermentację rafinozy, fermentację melibiozy i testy hydrolizy eskuliny. Pozytywny wynik wszystkich trzech testów wskazuje na obecność S. mutans.

   3.3 Ocena poziomów i/lub aktywności metaloproteaz w zmacerowanej tkance zębiny będzie oparta na podobnej metodologii jak w punkcie 2.4.2 3.3.1 Zymografia do oceny aktywności MMP 2 i 9 in situ (wynik): Metoda opisana przez Mazzoniego i in. .65 zostanie użyte na 20 (n=5 na grupę) świeżo usuniętych, niepróchnicowych ludzkich górnych zębów przedtrzonowych, odbudowanych poprzednią procedurą. Po usunięciu szkliwa i cementu uzyskuje się krążki środkowej/głębokiej zębiny koronowej o grubości 1 mm. Przygotowano roztwór podstawowy żelatyny znakowanej fluoresceiną o stężeniu 1,0 mg/ml, dodając 1,0 ml wody do fiolek zawierających liofilizowany substrat i przechowując w temperaturze -20°C aż do użycia. Roztwór podstawowy żelatyny rozcieńcza się 1:8 buforem do rozcieńczania (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) i dodaje środek zapobiegający blaknięciu (Mounting Medium with Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, Wielka Brytania). 50 μl mieszaniny fluorescencyjnej żelatyny umieszcza się na wierzchu każdej płytki i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. Szkiełka są chronione przed światłem i inkubowane w nawilżanych komorach w temperaturze 37°C. W celu określenia optymalnego okresu inkubacji wykonuje się zdjęcia fluorescencyjne od 1 godziny do 7 dni. Szczegółowy opis analizy 3D zymografii in situ za pomocą mikroskopii konfokalnej. W skrócie, hydrolizę schłodzonego substratu żelatynowego skoniugowanego z fluoresceiną, która wskazuje na endogenną aktywność enzymu żelatynolitycznego, oceniono przez badanie pod wielofotonowym mikroskopem konfokalnym (np. , Niemcy). Przekroje optyczne o grubości 85 μm zostały pozyskane z różnych płaszczyzn ogniskowania, a ułożone obrazy zostały przeanalizowane, określone ilościowo i przetworzone za pomocą oprogramowania ZEN 2010 (Carl Zeiss).

   3.4. Oznaczanie biozgodności. Z usuniętych zębów przedtrzonowych zostanie pobrana miazga zębowa, a także zostaną omówione molekularne markery żywotności komórek (wyników) lub uszkodzenia komórek przez adhezyjne nanokompozyty.

   Miazgę dentystyczną uzyskuje się w sposób opisany przez Vaseemuddina66 z usuniętych zębów przedtrzonowych. Całkowity RNA zostanie rozdzielony, a poziomy mRNA specyficznych markerów apoptozy i autofagii zostaną zmierzone za pomocą qPCR, jak opisano wcześniej (2.4.4-2.4.5).

   3.5 Ocena właściwości mechanicznych (nanoprzeciek i analiza stopnia konwersji w celu oceny stabilności wiązania (wynik)) będzie równa metodom w 2.1

4. Analiza statystyczna: Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania SPSS 23.0 (IBM, Nowy Jork, NY, USA). Porównania między zmiennymi ilościowymi (siła wiązania mikrorozciągliwego, nanoprzeciek, stopień konwersji, liczba CFU) między dwiema niezależnymi grupami zostaną przeanalizowane za pomocą testu t dla par niesparowanych, testu ANOVA i testu pots-hoc (lub odpowiednich testów nieparametrycznych według Shapiro-Wilka testowanie dystrybucji danych). Zależności między oznaczeniami próbek zostaną obliczone za pomocą korelacji Pearsona lub Spearmana. Obliczenia mocy przeprowadzono na podstawie danych z poprzedniego badania67. Aby znaleźć statystycznie istotną różnicę w końcowej liczbie CFU (główny wynik), biorąc pod uwagę moc statystyczną 0,8 na podstawie Vildosoli i badania64, potrzebna była próba o minimalnej wielkości 35 pacjentów na grupę i na każdą grupę badania64 (1 -β). Istotność zostanie uwzględniona, jeśli wartość p wynosi