Effet de l'incorporation de nanoparticules de cuivre et de zinc dans les adhésifs dentaires (1170575)

Objectif général Évaluer l'influence de l'incorporation de nanoparticules de cuivre ou de zinc dans un adhésif dentaire sur son action antimicrobienne et leur influence sur l'activité des métalloprotéases de la matrice dentinaire. Analyser les propriétés mécaniques et la biocompatibilité des adhésifs Objectifs spécifiques

1. Développer et caractériser structurellement un adhésif dentaire dopé avec des nanoparticules de cuivre ou de zinc.

   1.1. Préparation de nanocomposites adhésifs ; 1.2. Caractérisation structurale de nanocomposites adhésifs.

2. Évaluer les effets mécaniques, biochimiques et fonctionnels des nanocomposites adhésifs in vitro. Les dosages seront abordés en comparant l'ajout d'adhésif de contrôle, ou l'adhésif dopé avec du cuivre ou du zinc sur des dents récemment extraites fraîches. (ex phase vivo) 2.1. Pour tester l'activité antimicrobienne de l'adhésif ; 2. 2. Étudier l'influence des nanocomposites adhésifs sur les niveaux et/ou l'activité des métalloprotéases matricielles ;2.3. Évaluer les propriétés mécaniques de l'adhésif ;2.4. Pour évaluer la biocompatibilité. Les tests de viabilité dans les fibroblastes gingivaux de culture primaire seront abordés.
3. Évaluer les propriétés antimicrobiennes du modèle in vivo (phase clinique), les niveaux et/ou l'activité des métalloprotéases matricielles et de la cathepsine B, la biocompatibilité des nanocomposites adhésifs in vivo et les propriétés mécaniques. Les prémolaires indiquées pour l'extraction seront restaurées à l'aide d'un adhésif traditionnel ou d'un nanocomposite adhésif. Après un mois, les prémolaires seront extraites et analysées comme décrit.

3.1. Déterminer les propriétés antimicrobiennes de surface des nanocomposites adhésifs ; 3.2. Évaluer les métalloprotéases matricielles et les niveaux et/ou l'activité de la cathepsine B dans le tissu dentinaire macéré 3.3 Pour déterminer la biocompatibilité. La pulpe dentaire sera obtenue à partir de prémolaires extraites, et les marqueurs moléculaires de la viabilité cellulaire ou des dommages cellulaires seront traités par des nanocomposites adhésifs ;3.4 Évaluer les propriétés mécaniques de l'adhésif.

MÉTHODES

1. Développer un adhésif dentaire dopé avec des nanoparticules de cuivre ou de zinc. 1.1. Préparation des nanocomposites adhésifs (1) : Les nanocomposites CuNP/adhésifs seront préparés à l'aide du système adhésif à une bouteille Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Cet adhésif à base d'acétone contient un mélange de diméthacrylate d'uréthane et de monomère acide de dipentaérythritolpentaacrylatemonophosphate. Pour préparer les nanocomposites adhésifs, des quantités appropriées de poudre de nanoparticules (CuNp et ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chili) seront pesées et ajoutées directement à la bouteille d'adhésif sous agitation magnétique constante. La suspension sera ensuite dispersée dans un bain à ultrasons à 37°C pendant 10 minutes. Les nanocomposites adhésifs seront préparés avec une teneur en CuNP comprise entre 0,015 et 0,045 % en poids selon les données précédentes de nos laboratoires. Les cinq concentrations d'adhésifs dopés Cu et Zn seront de 0,0150 %, 0,0075 % et 0,00038 % (concentrations aux propriétés actives antibactériennes basées sur nos données précédentes (Cu 1-2-3 et Zn 1-2-3).

   1.2. Caractérisation structurale des nanocomposites adhésifs (1) : La morphologie et la composition des matériaux adhésifs nanocomposites seront caractérisées par SEM-EDX en mode électronique rétrodiffusé pour produire un contraste de phase et une microscopie AFM. La structure chimique de la matrice polymère et les teneurs résiduelles en monomères seront analysées par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée et spectroscopie Raman. Le monomère résiduel sera analysé en tenant compte de la vibration de la double liaison carbone-carbone du monomère acrylique dans la plage 1684 - 1636 cm-1.

2. Évaluer les effets antibactériens, mécaniques, biochimiques et fonctionnels des nanocomposites adhésifs in vitro et ex vivo. Les dosages seront abordés en comparant l'ajout d'un adhésif ordinaire ou l'adhésif dopé avec du cuivre ou du zinc.

   2.1. Dosage des propriétés antimicrobiennes du nanocomposite adhésif (2) 2.1.1 Activité antibactérienne : en bref, des disques de 10 mm et de 2 mm d'épaisseur seront fabriqués à l'aide d'un composite de résine (Filtek Supreme Ultra ; 3M, St. Paul, MN) et soit laissés non enduits (témoin), soit enduits de l'adhésif Prime&Bond 2.1, et équivalent expérimental mélanges adhésifs de douze groupes et polymérisés selon les recommandations du fabricant pendant 10 secondes à l'aide d'une unité de photopolymérisation à LED (Radii Cal,SDI,AU) à une densité de puissance de 1000 mW/cm2. Les disques d'amalgame (Contour ; Kerr, Orange, CA) seront fabriqués comme décrit précédemment et utilisés comme contrôle positif supplémentaire. Un total de quatorze groupes d'étude avec huit spécimens par groupe seront évalués dans cette partie de l'expérience : (1) contrôle ; (2) amalgame (matériau métallique utilisé comme contrôle positif) et 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 et 8) Zn3. Pour assurer l'élimination du monomère non polymérisé, les disques seront immergés dans 10 ml d'eau déionisée stérile et agités pendant 2 heures à 200 tr/min et 37,8°C, après quoi les disques seront laissés sécher à température ambiante pendant au moins 24 heures. Les disques seront stérilisés par incubation dans de l'éthanol à 70 % pendant 10 minutes puis séchés aseptiquement pendant un minimum de 48 heures. La surface de chaque disque sera inoculée avec 100 ml d'une concentration viable définie de 1 108 cellules/ml de Streptococcus mutans cultivé en anaérobiose, ATCC1 25175 dans un bouillon cœur-cerveau (BHI ; 211059 ; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) bouillon . Pour déterminer la concentration de cellules viables pour chaque groupe de traitement en unités formant colonies par ml (UFC/ml), les disques inoculés seront anaérobies, après quoi le nombre total d'UFC récupérées sera déterminé.

   2.2. Évaluation in vitro et ex vivo de l'activité des MMP (1-2) 2.2.1 Essai d'inhibition de l'activité des MMP (in vitro) : L'activité quantitative des MMP-2, MMP-8 et MMP-9 in vitro sera déterminée par un essai fluorométrique commercial des MMP kits (kits de dosage SensoLyte ; AnaSpec, San Jose, CA, USA) pour le dépistage de l'activité anti-MMP. Des adhésifs dopés Cu et ZnNP à différentes concentrations et des contrôles sans adhésifs Cu ou ZnNP seront ajoutés au tampon de réaction, et le dosage sera effectué selon les recommandations du fabricant. Lors du clivage en 2 fragments séparés par MMP, la fluorescence du 5-FAM sera contrôlée par un lecteur de microplaques fluorescentes (Sinergy TM).

   2.2.2 Détermination de l'activité et des niveaux de MMP (échantillons de dentine ex vivo avec des échantillons obtenus à partir de dents restaurées avec des adhésifs dopés et contrôle) : Vingt-cinq (n = 5) troisièmes molaires humaines extraites sans carie seront collectées après avoir informé les patients. consentement. Les dents seront désinfectées dans de la chloramine à 0,5 %, conservées dans de l'eau distillée et utilisées dans les six mois suivant l'extraction. Une petite préparation occlusale aux dimensions standardisées de 3x3x5 mm sera réalisée par un opérateur calibré au centre de la dent à l'aide d'une fraise cylindrique diamantée (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) et d'un pièce à main tout en fournissant un jet air-eau. Après avoir terminé la préparation de la cavité, celle-ci sera remplie de résine composite (Filtek Supreme ; 3M ESPE). Les adhésifs expérimentaux dopés au Cu et au Zn seront utilisés selon les instructions du fabricant, et l'adhésif non dopé sera utilisé comme témoin sur une prémolaire supérieure homologue. Le composite de résine (Filtek Supreme ; 3M ESPE) sera appliqué en utilisant la technique incrémentale. L'émail sera complètement éliminé avec une scie diamantée à vitesse lente (Remet, Bologne, Italie) sous irrigation saline, et les dents seront sectionnées pour obtenir des plaquettes de dentine coronale de 1 mm d'épaisseur, qui seront ensuite pulvérisées en poudre avec un marteau en acier. La poudre de dentine sera ensuite divisée en parts égales et déminéralisée (à 4°C pendant 24h sous agitation) dans l'une des solutions aqueuses suivantes : (1) acide acétique 0,87 M, pH = 2,3 ; (2) acide citrique 0,26 M, pH = 2,3; ou (3) EDTA 0,5 M, pH = 6,4; ou (4) EGTA 0,5 M, pH = 6,4. L'extraction enzymatique de la poudre de dentine déminéralisée sera mise en suspension dans un tampon d'extraction (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, contenant 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2, 0,02 % NaN3) et un cocktail d'inhibiteurs de protéase sans EDTA (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Les échantillons seront ensuite traités par ultrasons à une sortie de 40 W pendant 3 rafales de 10 secondes chacune à 4 ° C (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA). Les flacons seront centrifugés à 18 000 rpm pendant 30 min à 4°C, et les surnageants seront collectés. Toutes les protéines présentes dans les surnageants seront précipitées à 4°C par addition de sulfate d'ammonium en poudre (w/v) pour atteindre une concentration finale de 85% et un pH de 7,0. Le précipité sera recueilli par centrifugation à 24 000 tr/min pendant 30 min à 4 °C, redissous dans une dilution de 10 fois dans un tampon d'extraction, dialysé à travers une membrane de 30 kDa contre un tampon d'extraction pendant une nuit et stocké à 4 °C jusqu'à analyse. Après cela, la poudre de dentine sera analysée pour évaluer les niveaux d'activité de la MMP-2, de la MMP-9 et de la cathepsine B mesurés par zymographie sur gélatine et pour évaluer la MMP-8 par zymographie sur le collagène, comme décrit précédemment.56 La densitométrie sera exprimée en du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA). En bref, des échantillons de poudre de dentine seront soumis à une électrophorèse dans des conditions dénaturantes non réductrices dans des gels SDS/PAGE contenant 1 mg/mL de gélatine ou 0,1 mg/mL de collagène comme substrats. Ils seront ensuite trempés deux fois dans du Triton X-100 à 2,5 % et incubés pendant 17 h dans du tampon de développement (Tris 20 mM pH 7,4 et CaCl2 5 mM), colorés au Coomassie Brilliant Blue R-250, et décolorés avec de l'acide acétique à 10 % et Solution de méthanol à 20 %. Les niveaux de MMP-2, MMP-8, MMP-9, cathepsine B et ICTP (en tant que marqueur de l'hydrolyse du collagène dentinaire) seront déterminés soit par un kit ELISA commercial, soit par des immunoessais multiplex (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, pour la technologie Luminex) selon les recommandations du fabricant.

   2.3. Test des propriétés mécaniques des nanocomposites adhésifs (1-2) Force de liaison 2.3.1 Sélection et préparation des dents : Soixante-dix troisièmes molaires humaines extraites sans caries seront collectées après l'obtention du consentement éclairé des patients de la clinique dentaire de l'Université du Chili (≈2000 troisièmes extractions de molaires par an, assurant la disponibilité de ces dents normalement jetées). Les dents seront désinfectées dans de la chloramine à 0,5 %, conservées dans de l'eau distillée et utilisées dans les six mois suivant l'extraction. Une surface de dentine plane sera exposée après le meulage humide de l'émail occlusal avec un papier SiC #180. Les surfaces de dentine exposées seront encore polies avec un papier SiC #600 humide pendant 60 secondes pour normaliser la couche de frottis.

   2.3.2 Conception expérimentale : Les dents seront réparties au hasard en douze groupes de cinq (6 groupes par adhésif), chacun d'eux étant traité avec une concentration différente d'adhésif dopé. Comme témoin sans NP du système Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE) sera utilisé.

   2.3.3. Procédure de restauration et préparation des échantillons : Les systèmes adhésifs seront appliqués strictement conformément aux instructions du fabricant respectif.

   2.3.4 Après les procédures de collage : Toutes les dents recevront une restauration en composite micro hybride en deux incréments de 2 mm. Chaque incrément sera photopolymérisé pendant 40 secondes à l'aide d'une unité de photopolymérisation à LED au réglage de 1200 mW/cm2 (Radii-cal ; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australie). Les dents restaurées seront conservées dans de l'eau distillée à 37 °C pendant 24 heures, puis sectionnées longitudinalement dans les directions mésio-distale et vestibulaire-linguale à travers l'interface collée à l'aide d'une scie diamantée à vitesse lente (Isomet ; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) pour obtenir 15 à 20 bâtonnets de résine-dentine, chacun avec une section transversale d'environ 0,8 mm2 lorsqu'elle est mesurée avec un pied à coulisse numérique (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokyo, Japon). Chaque spécimen de chaque dent sera évalué pour la liaison par microtension (mTBS) à l'exception de six échantillons liés résine-dentine sélectionnés au hasard, qui seront divisés pour la mesure du degré de conversion (DC) in situ et de la nanofuite (NL).

   2.3.5. Test de force de liaison à la microtraction : les bâtonnets collés résine-dentine seront fixés à un gabarit de Geraldeli à l'aide d'un adhésif cyanoacrylate et testés sous tension (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brésil) à 0,5 mm/min jusqu'à la rupture. Les valeurs mTBS seront calculées en divisant la charge à la rupture par la section transversale de liaison. Le mode de défaillance des échantillons sera classé comme cohésif (défaillance exclusivement dans la dentine ou le composite de résine), adhésif (défaillance à l'interface résine/dentine) ou mixte (défaillance à l'interface résine/dentine, y compris la défaillance cohésive des substrats voisins ). La classification sera effectuée sous un stéréomicroscope (SZ40 ; Olympus, Tokyo, Japon) à un grossissement de 100 x. Les spécimens présentant des défaillances prématurées (FP) seront inclus dans la moyenne.

   2.3.6. Degré de conversion in situ : trois bâtonnets liés à la résine et à la dentine de chaque dent seront polis à l'eau avec du papier SiC #1500, #2000 et #2500. Ils seront ensuite nettoyés aux ultrasons pendant 20 minutes et conservés dans de l'eau à 37,8°C pendant 24 heures avant de mesurer le DC. L'analyse par spectroscopie micro-Raman sera effectuée à l'aide d'un équipement Senterra (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Bade-Wurtemberg, Allemagne). L'étalonnage du spectromètre micro-Raman sera effectué en le remettant à zéro puis en mesurant le coefficient d'un échantillon de silicium. Les échantillons seront analysés à l'aide des paramètres micro-Raman suivants : laser néon de 20 mW à 532 nm, résolution spatiale à 3 mm, résolution spectrale à 5 cm-1, temps d'accumulation à 30 secondes avec 6 co-additions et grossissement à 110x ( Olympus UK, Londres, Royaume-Uni) à un diamètre de faisceau de 1 mm. Les spectres seront pris à l'interface dentine-adhésif à trois sites différents dans la dentine intertubulaire pour chaque stick lié résine-dentine. Les spectres des adhésifs non polymérisés seront utilisés comme références. Le post-traitement des spectres sera effectué à l'aide du logiciel dédié Opus Spectroscopy version 6.5. Le rapport de la teneur en double liaison du monomère au polymère dans l'adhésif sera calculé : où ''R'' est le rapport des aires des pics aliphatiques et aromatiques à 1639 cm-1 et 1609 cm-1 dans les adhésifs polymérisés et non polymérisés. Le DC in situ de tous les sticks collés résine-dentine de la même dent sera moyenné à des fins statistiques.

   2.3.7. Évaluation des nanofuites : Trois bâtonnets liés à la résine de chaque dent seront placés dans du nitrate d'argent ammoniacal préparé selon le protocole décrit par Tay et al.57 et conservés dans l'obscurité pendant 24 heures. Ils seront ensuite soigneusement rincés dans de l'eau distillée et immergés dans une solution de développement photographique pendant 8 heures sous une lumière fluorescente pour réduire les ions d'argent en grains d'argent métallique dans les vides le long de l'interface collée. Les spécimens seront polis à l'eau avec un papier SiC n° 600, n° 1000, n° 1200, n° 1500, n° 2000 et n° 2500 et avec une pâte de diamant de 1 et 0,25 mm (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) à l'aide d'un tissu de polissage. Ils seront nettoyés par ultrasons, séchés à l'air, montés sur des talons et recouverts de carbone-or (MED 010 ; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). Les interfaces résine-dentine seront analysées dans un microscope électronique à balayage à émission de champ fonctionnant en mode rétrodiffusé (LEO 435 VP ; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, Royaume-Uni). Trois images seront capturées de chaque stick lié résine-dentine. Le pourcentage relatif de NL dans les couches adhésives et hybrides de chaque spécimen sera mesuré dans toutes les images à l'aide du logiciel Image J58 par un chercheur en aveugle. Les valeurs du même spécimen seront moyennées, et le NL moyen de tous les bâtonnets de la même dent sera moyen.

   2.4 Évaluer la biocompatibilité, les tests de viabilité dans les fibroblastes gingivaux cultivés primaires 2.4.1 Cultures cellulaires : Les cultures primaires de fibroblastes humains seront obtenues par la méthode de l'expiant, à partir du tissu rétromolaire des troisièmes molaires de trois individus adultes mâles.

   La lignée cellulaire d'ostéosarcome humain Saos-2, couramment utilisée pour évaluer la biocompatibilité entre les ostéoblastes et les biomatériaux, sera cultivée comme décrit par Alcaide et al.60.

   Les cellules seront ensemencées dans une plaque de 96 puits à une densité de 3000 cellules par puits. Après 24h, le milieu de culture témoin sera remplacé par 100 µl de différentes dilutions de l'adhésif approprié (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). Les plaques seront incubées pendant 24h, 48h et 72h dans un 37 Incubateur °C (5 % CO2) avant les tests de viabilité ou de mort cellulaire.

   2.4.2 Viabilité cellulaire et analyse du cycle cellulaire : Des cultures primaires de fibroblastes humains seront obtenues par la méthode des explants, à partir du tissu rétromolaire des troisièmes molaires de trois individus adultes mâles.

   La lignée cellulaire d'ostéosarcome humain Saos-2, couramment utilisée pour évaluer la biocompatibilité entre les ostéoblastes et les biomatériaux, sera cultivée comme décrit par Alcaide et al.60.

   Les cellules seront ensemencées dans une plaque de 96 puits à une densité de 3000 cellules par puits. Après 24h, le milieu de culture témoin sera remplacé par 100 µl de différentes dilutions de l'adhésif approprié (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). Les plaques seront incubées pendant 24h, 48h et 72h dans un 37 Incubateur °C (5 % CO2) avant les tests de viabilité ou de mort cellulaire.

   2.4.3 Quantification des cellules viables, apoptotiques précoces, apoptotiques tardives et nécrotiques par microscopie à fluorescence : Le protocole décrit par Kasibhatla et al sera utilisé 61. Les cellules seront colorées avec une solution d'acridine orange/bromure d'éthidium (AO/EB) et seront examinées par microscopie à fluorescence. L'AO colorera les cellules vivantes et mortes. EB colorera uniquement les cellules qui ont perdu l'intégrité de la membrane. Les cellules vivantes apparaîtront uniformément vertes. Les cellules apoptotiques précoces se tacheront en vert et contiendront des points verts brillants dans les noyaux en raison de la condensation de la chromatine et de la fragmentation nucléaire. Les cellules apoptotiques tardives incorporeront également du bromure d'éthidium et se coloreront donc en orange, mais, contrairement aux cellules nécrotiques, les cellules apoptotiques tardives montreront des noyaux condensés et souvent fragmentés. Les cellules nécrotiques se colorent en orange, mais ont une morphologie nucléaire ressemblant à celle des cellules viables, sans chromatine condensée61.

   2.4.4 Détection de l'apoptose par exposition à la phosphatidylsérine, ADN laddering et quantification de l'ARNm et des protéines apoptotiques : l'exposition de la phosphatidylsérine sur la surface externe de la membrane plasmique sera analysée comme signal précoce de l'apoptose par coloration à l'annexine V (A5) - allophycocyanine (APC), comme décrit dans Alcaide et al60. La fluorescence de la sonde APC sera analysée par cytométrie en flux.

   Le test d'échelle d'ADN apoptotique sera effectué à l'aide d'un kit d'échelle d'ADN (Roche, Allemagne).

   Les niveaux d'ARNm et de protéines pour les médiateurs suppresseurs de tumeurs (p53), pro-apoptotique (bax, caspase 3) et anti-apoptotique (bcl-2) seront abordés par PCR quantitative et immunoblot.

   2.4.5 Évaluation de l'autophagie : Afin de tester les effets putatifs des NP métalliques sur l'autophagie cellulaire, différents marqueurs d'autophagie seront abordés. Le flux autophagique et le niveau de p62 seront détectés par western blot, et les autophagosomes seront visualisés par microscopie à fluorescence en comptant les puncta63 LC3 positifs.

3. Évaluation des niveaux et/ou de l'activité et de la biocompatibilité des métalloprotéases des nanocomposites adhésifs in vivo.

   Les prémolaires indiquées pour l'extraction seront restaurées à l'aide d'un adhésif traditionnel ou d'un nanocomposite adhésif. Au bout d'un mois (rappel par contact téléphonique et suite à l'examen clinique), les patients seront examinés et les prémolaires seront extraites et analysées par des évaluateurs en aveugle (codifiés par des numéros) à toutes les étapes décrites. Les extractions de prémolaires seront effectuées par des professeurs de médecine dentaire, tout effet post-procédure sera assumé et résolu par l'équipe de recherche, les procédures pour les patients sont gratuites et tout sera strictement respecté les recommandations du comité d'éthique de la faculté de médecine dentaire de l'université du Chili.

   3.1 Évaluation in vivo des nanocomposites adhésifs : Soixante-dix volontaires nécessitant une extraction des premières prémolaires supérieures droite et gauche (n = 35 par groupe) pour des raisons orthodontiques seront sélectionnés dans le programme de spécialisation orthodontique de la clinique de l'Université du Chili (il y aura être une période de recrutement de 3 mois avec un co-investigateur chargé de la surveillance (CB)). Les critères d'inclusion seront (1) les plans de traitement indiquant les extractions de prémolaires pour des raisons orthodontiques, (2) la présence de dents de traitement saines, intactes, non carieuses, non restaurées et entièrement sorties, et (3) les patients ayant des conditions de santé bien contrôlées qui permettent à toutes les procédures d'être effectuées dans la recherche avec un risque minimal. Les critères d'exclusion seront (1) les patients qui n'acceptent pas de se porter volontaires pour l'étude et (2) les patients ne répondant pas à tous les critères d'inclusion. Une petite préparation occlusale sera réalisée par un opérateur calibré au centre de la dent à l'aide d'un diamant cylindrique fraise (.63109/018, grain moyen (60730025), Dentsply, NY, USA) et une pièce à main à grande vitesse tout en fournissant un jet air-eau avec des dimensions standardisées de 3x3x5 mm. Après avoir terminé la préparation de la cavité, celle-ci sera remplie de résine composite (Filtek Supreme ; 3M ESPE). Les adhésifs expérimentaux dopés au Cu et au Zn seront utilisés selon les instructions du fabricant, et l'adhésif non dopé sera utilisé comme témoin sur la prémolaire supérieure homologue et conçu par simple randomisation de groupes parallèles. Le composite de résine (Filtek Supreme; 3M ESPE) sera appliqué en utilisant la technique incrémentale, et enfin, une couche d'adhésif sera appliquée comme surface de restauration composite et polymérisée pendant 10 secondes. L'occlusion sera vérifiée et les restaurations seront finies et polies selon les instructions du fabricant. Par la suite, le polissage et la finition finale serviront à appliquer une couche d'adhésif sur la restauration finale, qui sera polymérisée pendant 10 secondes (Raddi Cal, SDI, AU). Une dent à la fois sera extraite un mois après la réalisation des restaurations. Le patient recevra une anesthésie infiltrante et intraligamentale (environ 1,8 mL de mépivacaïne à 2 % (36 mg)) avec de l'épinéphrine dans un rapport de 1:100 000 (18 mg). Ensuite, les dents seront soumises à des tests.

   3.2 Déterminer les propriétés antimicrobiennes de surface des nanocomposites adhésifs : Pour évaluer les propriétés de surface antibactériennes des adhésifs dopés, une dernière couche d'adhésifs sera appliquée sur la surface finale des restaurations dans un modèle in vivo. La procédure sera utilisée pour évaluer le nombre d'UFC de S.Mutans sur des surfaces composites (résultat principal). Avant de prélever le biofilm, des plateaux seront préparés pour imprimer le biofilm sur les restaurations. Pour cette application, nous utiliserons des plateaux d'application de gel de fluorure jetables (Deepak Products Inc., Miami, USA), chacun d'entre eux sera stérilisé dans une hotte de sécurité biologique (Esco Technologies Inc., Harboro, USA) sous lumière ultraviolette pendant 30 minutes. Chaque plateau sera ensuite chargé avec 7,5 ml de gélose TYCSB (caséine, extrait de levure, L-cystéine, saccharose, bacitracine) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA), qui est un milieu sélectif pour S. mutans. Par la suite, pour individualiser la technique de prélèvement des échantillons, les gouttières seront découpées pour ne pas dépasser 3 dents. Immédiatement après cela, les plateaux seront placés dans des boîtes de Pétri stériles et stockés dans des sacs en plastique scellés au réfrigérateur. Avant utilisation, les plateaux seront placés dans un incubateur/cuisinière (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Corée) pendant 24 h à 37 ° C comme mesure de contrôle de la qualité. Les troisième et quatrième opérateurs effectueront l'échantillonnage, qui sera effectué entre 11h00 et 13h00 pour permettre la réorganisation du biofilm après le brossage du matin. Le prélèvement sera effectué par un opérateur aveugle appuyant doucement le plateau pendant 20 s sur la restauration RC, suivi d'une restauration RC homologue avec et sans adhésif dopé Cu ou Zn.

   Une fois les plateaux d'échantillons stockés dans des boîtes de pétri stériles, ils seront transportés à 4 °C puis incubés à 37 °C dans un microaérophile (pot bougie CO2 10 %) pendant 48 h. Le comptage de S.mutans sera effectué par le quatrième opérateur qui sera en aveugle sur le plateau qui a servi à imprimer les restaurations RC. Plus tard, une coloration de Gram sera effectuée pour déterminer la micromorphologie des colonies. Le décompte de S.mutans sera exprimé en unités formant colonies (UFC) de S.mutans des plaques et plateaux avec la gélose TYCSB. Les colonies sélectionnées qui seront compatibles avec l'adhérence et les caractéristiques morphologiques de S.mutans seront mises en suspension dans du bouillon Todd-Hewitt (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) et incubées à 37 ° C pendant 48 h. Les colonies seront ensuite soumises à des tests biochimiques pour identifier l'espèce de S. mutans et la distinguer de S. sobrinus. Les tests biochimiques comprennent la fermentation du raffinose, la fermentation du mélibiose et les tests d'hydrolyse de l'esculine. Un résultat positif pour les trois tests indique la présence de S. mutans.

   3.3 L'évaluation des niveaux de métalloprotéases et/ou de l'activité dans le tissu dentinaire macéré utilisera une méthodologie similaire à celle de 2.4.2 .65 sera utilisé sur 20 (n = 5 par groupe) prémolaires supérieures humaines non carieuses fraîchement extraites et restaurées par une procédure précédente. Après élimination de l'émail et du cément, des disques de 1 mm d'épaisseur de dentine coronale moyenne/profonde seront obtenus. Une solution mère de 1,0 mg/ml de gélatine marquée à la fluorescéine a été préparée en ajoutant 1,0 ml d'eau aux flacons contenant le substrat lyophilisé et en la stockant à -20°C jusqu'à utilisation. La solution mère de gélatine est diluée au 1:8 avec le tampon de dilution (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) et un agent anti-fading est ajouté (Mounting Medium with Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, Royaume-Uni). Une quantité de 50 μL du mélange de gélatine fluorescente est placée sur le dessus de chaque plaque et recouverte d'une lamelle. Les lames sont protégées contre la lumière et incubées dans des chambres humidifiées à 37°C. Pour l'identification de la période d'incubation optimale, des images fluorescentes sont prises de 1 h à 7 jours. Description détaillée de l'analyse 3D de la zymographie in situ avec microscopie confocale. En bref, l'hydrolyse d'un substrat de gélatine conjugué à la fluorescéine trempé, qui indique une activité enzymatique gélatinolytique endogène, a été évaluée par examen au microscope confocal multiphotonique (ex : 488 nm et em : lp530 nm ; Zeiss, LSM 780, Carl Zeiss, Oberkochen , Allemagne). Des sections optiques de 85 μm d'épaisseur ont été acquises à partir de différents plans focaux, et les images empilées ont été analysées, quantifiées et traitées avec le logiciel ZEN 2010 (Carl Zeiss).

   3.4. Détermination de la biocompatibilité. La pulpe dentaire sera obtenue à partir de prémolaires extraites, et les marqueurs moléculaires de la viabilité cellulaire (résultats) ou des dommages cellulaires par les nanocomposites adhésifs seront abordés.

   La pulpe dentaire sera obtenue comme décrit par Vaseemuddin66, à partir de prémolaires extraites. L'ARN total sera séparé et les niveaux d'ARNm de marqueurs spécifiques d'apoptose et d'autophagie seront mesurés par qPCR, comme décrit précédemment (2.4.4-2.4.5).

   3.5 L'évaluation des propriétés mécaniques (analyse de nanofuite et de conversion de degré pour évaluer les stabilités de liaison (résultat)) sera identique aux méthodes de 2.1

4. Analyse statistique : L'analyse statistique sera effectuée à l'aide du logiciel SPSS 23.0 (IBM, New York, NY, USA). Les comparaisons entre les variables quantitatives (résistance à la microtraction, nanofuite, degré de conversion, nombre d'UFC) entre deux groupes indépendants seront analysées par un test t non apparié, une ANOVA et un test pot-hoc (ou des tests non paramétriques respectifs selon Shapiro-Wilk test de la distribution des données). Les associations entre les déterminations d'échantillons seront calculées par la corrélation de Pearson ou de Spearman. Un calcul de puissance a été effectué à partir des données d'une étude précédente67. Une taille d'échantillon avec un minimum de 35 patients par groupe et par bras d'étude était nécessaire pour trouver une différence statistiquement significative dans un décompte final d'UFC (résultat principal), en considérant une puissance statistique de 0,8 basée sur Vildosola et une étude64 (1 -β). La signification sera considérée si la valeur p est