Vliv inkoportace nanočástic mědi a zinku do dentálních adheziv (1170575)

Obecný cíl Vyhodnotit vliv inkorporace nanočástic mědi nebo zinku do dentálního adheziva na jeho antimikrobiální působení a jejich vliv na aktivitu metaloproteáz matrice dentinu. Analyzovat mechanické vlastnosti lepidla a biokompatibilitu Specifické cíle

1. Vyvinout a strukturálně charakterizovat dentální lepidlo dopované nanočásticemi mědi nebo zinku.

   1.1. Příprava adhezivních nanokompozitů; 1.2. Strukturní charakterizace adhezivních nanokompozitů.

2. Posoudit mechanické, biochemické a funkční účinky adhezivních nanokompozitů in vitro. Testy budou zaměřeny na porovnání přidání kontrolního adheziva nebo adheziva dopovaného buď mědí nebo zinkem na čerstvé nedávno extrahované zuby. (např. vivo fáze) 2.1. Testovat antimikrobiální aktivitu lepidla; 2. 2. Studovat vliv adhezivních nanokompozitů na hladiny a/nebo aktivitu matricových metaloproteáz; 2.3. Vyhodnotit mechanické vlastnosti lepidla;2.4. Pro posouzení biokompatibility. Budou se zabývat testy životaschopnosti v primárně kultivovaných gingiválních fibroblastech.
3. Vyhodnotit in vivo model (klinická fáze) antimikrobiální vlastnosti, hladiny a/nebo aktivitu matricových metaloproteáz a katepsinu B, biokompatibilitu adhezivních nanokompozitů in vivo a mechanické vlastnosti. Premoláry indikované k extrakci budou obnoveny buď tradičním adhezivem nebo adhezivním nanokompozitem. Po měsíci budou premoláry extrahovány a analyzovány, jak je popsáno.

3.1. Stanovit povrchové antimikrobiální vlastnosti adhezivních nanokompozitů; 3.2. K posouzení hladin matricových metaloproteáz a katepsinu B a/nebo aktivity v macerované dentinové tkáni;3.3 Pro stanovení biokompatibility. Z extrahovaných premolárů bude získána zubní dřeň a adhezivními nanokompozity budou řešeny molekulární markery buněčné životaschopnosti nebo poškození buněk;3.4 Vyhodnotit mechanické vlastnosti lepidla.

METODY

1. Vyvinout dentální lepidlo dopované nanočásticemi mědi nebo zinku. 1.1. Příprava adhezivních nanokompozitů (1): CuNP/adhezivní nanokompozity budou připraveny pomocí jednolahvového adhezního systému Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Toto lepidlo na bázi acetonu obsahuje směs urethandimethakrylátu a kyselého monomeru dipentaerythritolpentaakrylátmonofosfátu. Pro přípravu adhezivních nanokompozitů se odváží příslušné množství prášku nanočástic (CuNp a ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chile) a přidá se přímo do lahvičky s adhezivem za stálého magnetického míchání. Suspenze pak bude dále dispergována v ultrazvukové lázni při 37 °C po dobu 10 minut. Adhezivní nanokompozity budou připraveny s obsahem CuNP v rozmezí 0,015 až 0,045 hm. % dle předchozích údajů z našich laboratoří. Pět koncentrací lepidel dotovaných Cu a Zn bude 0,0150 %, 0,0075 % a 0,00038 % (koncentrace s antibakteriálními aktivními vlastnostmi na základě našich předchozích údajů (Cu 1-2-3 a Zn 1-2-3).

   1.2. Strukturní charakterizace adhezivních nanokompozitů (1): Morfologie a složení nanokompozitních adhezivních materiálů bude charakterizováno pomocí SEM-EDX v módu zpětně odražených elektronů pro vytvoření fázového kontrastu a AFM mikroskopie. Chemická struktura polymerní matrice a obsah zbytkového monomeru budou analyzovány pomocí infračervené a Ramanovy spektroskopie s Fourierovou transformací a zeslabeným úplným odrazem. Zbytkový monomer bude analyzován s ohledem na vibraci dvojné vazby uhlík-uhlík akrylového monomeru v rozsahu 1684 - 1636 cm-1.

2. Posoudit antibakteriální, mechanické, biochemické a funkční účinky adhezivních nanokompozitů in vitro a ex vivo. Budou řešeny testy srovnávající přidání běžného lepidla nebo lepidla dopovaného buď mědí nebo zinkem.

   2.1. Stanovení antimikrobiálních vlastností adhezivního nanokompozitu (2) 2.1.1 Antibakteriální aktivita: Stručně řečeno, 10mm disky o tloušťce 2 mm budou vyrobeny z pryskyřičného kompozitu (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) a buď ponechány nepotažené (kontrola), nebo potaženy lepidlem Prime&Bond 2.1 a ekvivalentní experimentální adhezivní směsi dvanácti skupin a polymerované podle doporučení výrobce po dobu 10 sekund za použití LED světlem vytvrzovací jednotky (Radii Cal,SDI,AU) při hustotě výkonu 1000 mW/cm2. Amalgámové disky (Contour; Kerr, Orange, CA) budou vyrobeny tak, jak bylo popsáno dříve, a použity jako další pozitivní kontrola. V této části experimentu bude hodnoceno celkem čtrnáct studijních skupin s osmi vzorky na skupinu: (1) kontrola; (2) amalgám (kovový materiál používaný jako pozitivní kontrola) a 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 a 8) Zn3. Aby se zajistilo odstranění nepolymerizovaného monomeru, budou disky ponořeny do 10 ml sterilní deionizované vody a míchány po dobu 2 hodin při 200 otáčkách za minutu a 37,8 °C, poté budou disky ponechány schnout při pokojové teplotě po dobu alespoň 24 hodin. Disky budou sterilizovány inkubací v 70% ethanolu po dobu 10 minut a poté asepticky sušeny po dobu minimálně 48 hodin. Povrch každého disku bude naočkován 100 ml definované životaschopné koncentrace 1 108 buněk/ml anaerobně pěstovaných Streptococcus mutans, ATCC1 25175 v mozkové srdeční infuzi (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) bujón . Pro stanovení koncentrace životaschopných buněk pro každou léčebnou skupinu v jednotkách tvořících kolonie na ml (CFU/ml) budou inokulované disky anaerobně a poté bude stanoven celkový počet získaných CFU.

   2.2. Hodnocení aktivity MMP in vitro a ex vivo (1-2) 2.2.1 Test inhibice aktivity MMP (in vitro): Kvantitativní aktivita MMP-2, MMP-8 a MMP-9 in vitro bude stanovena komerčním fluorometrickým testem MMP soupravy (testovací soupravy SensoLyte; AnaSpec, San Jose, CA, USA) pro screening anti-MMP aktivity. Do reakčního pufru budou přidána adheziva dopovaná Cu a ZnNP v různých koncentracích a kontroly bez adheziv Cu nebo ZnNP a test bude proveden podle doporučení výrobce. Po štěpení na 2 samostatné fragmenty pomocí MMP bude fluorescence 5-FAM monitorována fluorescenční čtečkou mikrodestiček (Sinergy TM).

   2.2.2 Stanovení aktivity a hladin MMP (ex vivo vzorky dentinu se vzorky získanými z restaurovaných zubů s dopovanými adhezivy a kontrolou): Po získání informací pacientů bude odebráno dvacet pět (n=5) extrahovaných lidských třetích molárů bez kazu. souhlas. Zuby budou dezinfikovány v 0,5% chloraminu, skladovány v destilované vodě a použity do šesti měsíců od extrakce. Malý okluzní preparát se standardizovanými rozměry 3x3x5 mm zhotoví kalibrovaný operátor ve středu zubu pomocí válcového diamantového vrtáku (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) a vysokorychlostního násadec a zároveň poskytuje sprej vzduch-voda. Po dokončení preparace bude kavita vyplněna pryskyřičným kompozitem (Filtek Supreme; 3M ESPE). Experimentální lepidla dotovaná Cu a Zn budou použita podle pokynů výrobce a nedopované lepidlo bude použito jako kontrola na homologním horním premoláru. Pryskyřičný kompozit (Filtek Supreme; 3M ESPE) bude aplikován pomocí inkrementální techniky. Sklovina bude kompletně odstraněna pomaloběžnou diamantovou pilou (Remet, Bologna, Itálie) za proplachování fyziologickým roztokem a zuby budou nařezány tak, aby se získaly 1 mm silné plátky koronálního dentinu, které budou následně rozdrceny na prášek pomocí ocelové kladivo. Dentinový prášek bude poté rovnoměrně rozdělen a demineralizován (při 4 °C po dobu 24 hodin za míchání) v jednom z následujících vodných roztoků: (1) 0,87 M kyselina octová, pH = 2,3; (2) 0,26 M kyselina citrónová, pH = 2,3; nebo (3) 0,5 M EDTA, pH = 6,4; nebo (4) 0,5 M EGTA, pH = 6,4. Enzymová extrakce demineralizovaného dentinového prášku bude suspendována v extrakčním pufru (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, obsahující 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2, 0,02 % NaN3) a koktejl inhibitoru proteázy bez EDTA (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Vzorky se poté zpracují ultrazvukem při výkonu 40 W ve 3 dávkách po 10 sekundách při 4 °C (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA). Lahvičky se odstřeďují při 18 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut při 4 °C a shromáždí se supernatanty. Všechny proteiny přítomné v supernatantech se vysrážejí při 4 °C přidáním práškového síranu amonného (w/v), aby se dosáhlo konečné koncentrace 85 % a pH 7,0. Sraženina bude shromážděna centrifugací při 24 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut při 4 °C, znovu rozpuštěna v 10násobném ředění v extrakčním pufru, dialyzována přes 30-kDa membránu proti extrakčnímu pufru přes noc a skladována při 4 °C až do analýzy. Poté bude dentinový prášek analyzován, aby se vyhodnotily hladiny aktivity MMP-2, MMP-9 a katepsinu B měřené želatinovou zymografií a aby se stanovila MMP-8 kolagenovou zymografií, jak bylo popsáno dříve.56 Denzitometrie bude vyjádřena jako du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA). Stručně řečeno, vzorky dentinového prášku budou podrobeny elektroforéze za neredukčních denaturačních podmínek v SDS/PAGE gelech obsahujících 1 mg/ml želatiny nebo 0,1 mg/ml kolagenu jako substráty. Poté budou dvakrát namočené v 2,5% Triton X-100 a inkubovány po dobu 17 hodin ve vyvíjecím pufru (20 mM Tris pH 7,4 a 5 mM CaCl2), obarveny Coomassie Brilliant Blue R-250 a odbarveny 10% kyselinou octovou a 20% roztok methanolu. Hladiny MMP-2, MMP-8, MMP-9, kathepsinu B a ICTP (jako marker hydrolýzy dentinového kolagenu) budou stanoveny buď komerční soupravou ELISA nebo multiplexními imunotesty (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, pro technologii Luminex) podle doporučení výrobce.

   2.3. Testování mechanických vlastností adhezivních nanokompozitů (1-2) Síla vazby 2.3.1 Výběr a preparace zubu: Po získání informovaného souhlasu pacientů zubní kliniky Chilské univerzity (≈2000 třetina) bude odebráno 70 extrahovaných lidských třetích molárů bez kazu extrakce molárů za rok, což zajišťuje dostupnost těchto zubů, které se běžně vyřazují). Zuby budou dezinfikovány v 0,5% chloraminu, skladovány v destilované vodě a použity do šesti měsíců od extrakce. Plochý povrch dentinu se obnaží po mokrém broušení okluzní skloviny papírem SiC #180. Exponované povrchy dentinu budou dále leštěny vlhkým papírem SiC #600 po dobu 60 sekund, aby se standardizovala vrstva smearu.

   2.3.2 Experimentální design: Zuby budou náhodně rozděleny do dvanácti skupin po pěti (6 skupin na lepidlo), z nichž každá bude ošetřena jinou koncentrací dopovaného lepidla. Jako kontrola bez NP systému Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE).

   2.3.3. Postup obnovy a příprava vzorků: Lepicí systémy budou aplikovány přesně v souladu s příslušnými pokyny výrobce.

   2.3.4 Po lepení: Všechny zuby obdrží mikro hybridní kompozitní náhradu ve dvou krocích po 2 mm. Každý přírůstek bude polymerován světlem po dobu 40 sekund za použití jednotky vytvrzování světlem LED při nastavení 1200 mW/cm2 (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Austrálie). Obnovené zuby budou uloženy v destilované vodě o teplotě 37 °C po dobu 24 hodin a poté podélně rozříznuty v meziodistálním a bukálně-lingválním směru napříč lepeným rozhraním pomocí pomaloběžné diamantové pily (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) k získání 15 až 20 tyčinek pryskyřice-dentin, každá s plochou průřezu přibližně 0,8 mm2 při měření digitálním posuvným měřítkem (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokio, Japonsko). Každý vzorek z každého zubu bude hodnocen na mikrotahovou vazbu pevnost (mTBS) s výjimkou šesti náhodně vybraných vzorků vázaných pryskyřicí-dentin, které budou rozděleny pro měření in situ stupně konverze (DC) a nanoleakage (NL).

   2.3.5. Test pevnosti vazby v mikrotahu: Tyčinky vázané pryskyřicí a dentinem budou připevněny k přípravku Geraldeli pomocí kyanoakrylátového lepidla a testovány pod tahem (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brazílie) rychlostí 0,5 mm/min až do selhání. Hodnoty mTBS budou vypočteny vydělením zatížení při porušení plochou průřezu spoje. Způsob porušení vzorků bude klasifikován jako kohezní (porucha výhradně v dentinu nebo kompozitu pryskyřice), adhezivní (selhání na rozhraní pryskyřice/dentin) nebo smíšený (selhání na rozhraní pryskyřice/dentin včetně kohezního selhání sousedních substrátů ). Klasifikace bude provedena pod stereomikroskopem (SZ40; Olympus, Tokio, Japonsko) při 100x zvětšení. Vzorky s předčasnými poruchami (PF) budou zahrnuty do průměru.

   2.3.6. Stupeň konverze in situ: Tři tyčinky vázané pryskyřicí a dentinem z každého zubu budou vyleštěny za mokra papírem SiC #1500, #2000 a #2500. Poté budou ultrazvukem čištěny po dobu 20 minut a uloženy ve vodě při 37,8 °C po dobu 24 hodin před měřením DC. Mikro-Ramanova spektroskopická analýza bude provedena pomocí zařízení Senterra (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Bádensko-Württembersko, Německo). Kalibrace mikro-Ramanova spektrometru bude provedena jeho vynulováním a poté měřením koeficientu křemíkového vzorku. Vzorky budou analyzovány pomocí následujících mikro-Ramanových parametrů: 20 mW neonový laser při 532 nm, prostorové rozlišení při 3 mm, spektrální rozlišení při 5 cm-1, doba akumulace při 30 sekundách s 6 koadicemi a zvětšení při 110x ( Olympus UK, Londýn, Velká Británie) na průměr paprsku 1 mm. Spektra budou snímána na rozhraní dentin-adheziv na třech různých místech v intertubulárním dentinu pro každou tyčinku vázanou pryskyřicí-dentin. Jako reference budou použita spektra nepolymerizovaných lepidel. Následné zpracování spekter bude provedeno pomocí specializovaného softwaru Opus Spectroscopy Software verze 6.5. Vypočte se poměr obsahu dvojné vazby monomeru k polymeru v lepidle: kde „R“ je poměr ploch alifatických a aromatických píku při 1639 cm-1 a 1609 cm-1 v polymerizovaných a nepolymerizovaných lepidlech. In situ DC všech tyčinek spojených pryskyřicí a dentinem ze stejného zubu se pro statistické účely zprůměruje.

   2.3.7. Hodnocení nanonetěsnosti: Tři tyčinky navázané pryskyřicí z každého zubu se vloží do amoniakálního dusičnanu stříbrného připraveného podle protokolu popsaného Tayem a kol.57 a uloží se na 24 hodin do temnoty. Poté budou důkladně opláchnuty v destilované vodě a ponořeny do fotovyvolacího roztoku na 8 hodin pod fluorescenčním světlem, aby se ionty stříbra zredukovaly na kovová zrnka stříbra v dutinách podél lepeného rozhraní. Vzorky budou leštěny za mokra papírem SiC #600, #1000, #1200, #1500, #2000 a #2500 a diamantovou pastou 1 a 0,25 mm (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) za použití leštící hadřík. Budou vyčištěny ultrazvukem, vysušeny na vzduchu, namontovány na pahýly a potaženy uhlíkovým zlatem (MED 010; Balzers Union, Balzers, Lichtenštejnsko). Rozhraní pryskyřice-dentin budou analyzována v poli-emisním rastrovacím elektronovém mikroskopu provozovaném v režimu zpětného rozptylu (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, UK). Z každé tyčinky vázané pryskyřicí a dentinem budou zachyceny tři snímky. Relativní procento NL v adhezivní a hybridní vrstvě v každém vzorku bude měřeno na všech snímcích pomocí softwaru Image J58 zaslepeným výzkumníkem. Hodnoty ze stejného vzorku budou zprůměrovány a střední hodnota NL všech tyčinek ze stejného zubu bude průměrná.

   2.4 Posouzení biokompatibility, testy životaschopnosti v primárně kultivovaných gingiválních fibroblastech 2.4.1 Buněčné kultury: Primární kultury lidských fibroblastů budou získány explantační metodou z retromolární tkáně třetích molárů tří dospělých jedinců mužského pohlaví.

   Buněčná linie lidského osteosarkomu Saos-2, běžně používaná pro hodnocení biokompatibility mezi osteoblasty a biomateriály, bude kultivována tak, jak je popsáno v Alcaide et al.60.

   Buňky budou nasazeny na 96jamkovou destičku v hustotě 3000 buněk na jamku. Po 24 hodinách bude kontrolní kultivační médium nahrazeno 100 ul různých ředění vhodného lepidla (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %). Destičky budou inkubovány po dobu 24 hodin, 48 hodin a 72 hodin v 37hodinové °C inkubátor (5%CO2) před testy životaschopnosti nebo buněčné smrti.

   2.4.2 Buněčná životaschopnost a analýza buněčného cyklu: Primární kultury lidských fibroblastů budou získány explantační metodou z retromolární tkáně třetích molárů tří dospělých jedinců mužského pohlaví.

   Buněčná linie lidského osteosarkomu Saos-2, běžně používaná pro hodnocení biokompatibility mezi osteoblasty a biomateriály, bude kultivována tak, jak je popsáno v Alcaide et al.60.

   Buňky budou nasazeny na 96jamkovou destičku v hustotě 3000 buněk na jamku. Po 24 hodinách bude kontrolní kultivační médium nahrazeno 100 ul různých ředění vhodného lepidla (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %). Destičky budou inkubovány po dobu 24 hodin, 48 hodin a 72 hodin v 37hodinové °C inkubátor (5%CO2) před testy životaschopnosti nebo buněčné smrti.

   2.4.3 Kvantifikace životaschopných, časně apoptotických, pozdních apoptotických a nekrotických buněk pomocí fluorescenční mikroskopie: Bude použit protokol popsaný Kasibhatla et al 61. Buňky budou obarveny roztokem akridinové pomeranče/ethidiumbromidu (AO/EB) a budou zkoumány fluorescenční mikroskopií. AO obarví živé i mrtvé buňky. EB obarví pouze buňky, které ztratily integritu membrány. Živé buňky budou vypadat rovnoměrně zelené. Časné apoptotické buňky se zbarví zeleně a obsahují jasně zelené tečky v jádrech v důsledku kondenzace chromatinu a fragmentace jádra. Pozdní apoptotické buňky budou také obsahovat ethidium bromid, a proto se barví oranžově, ale na rozdíl od nekrotických buněk budou pozdní apoptotické buňky vykazovat kondenzovaná a často fragmentovaná jádra. Nekrotické buňky se barví oranžově, ale mají jadernou morfologii podobnou morfologii životaschopných buněk, bez kondenzovaného chromatinu61.

   2.4.4 Detekce apoptózy expozicí fosfatidylserinu, DNA laddering a apoptotickou mRNA a kvantifikací proteinů: Expozice fosfatidylserinu na vnějším povrchu plazmatické membrány bude analyzována jako časný signál apoptózy barvením annexinem V (A5)- alofykocyaninem (APC), jak je popsáno v Alcaide et al60. Fluorescence sondy APC bude analyzována průtokovou cytometrií.

   Apoptotický DNA ladder test bude proveden pomocí DNA ladder Kit (Roche, Německo).

   Hladiny mRNA a proteinů pro tumor supresorové (p53), proapoptotické (bax, kaspáza 3) a antiapoptotické (bcl-2) mediátory budou řešeny pomocí kvantitativní PCR a imunoblotu.

   2.4.5 Vyhodnocení autofagie: Pro testování domnělých účinků kovových NP na buněčnou autofagii budou řešeny různé autofagické markery. Autofagický tok a hladina p62 budou detekovány westernovým přenosem a autofagozomy budou vizualizovány fluorescenční mikroskopií počítáním LC3 pozitivních puncta63.

3. Hodnocení hladin a/nebo aktivity metaloproteáz a biokompatibility adhezivních nanokompozitů in vivo.

   Premoláry indikované k extrakci budou obnoveny buď tradičním adhezivem nebo adhezivním nanokompozitem. Po měsíci (odvolání telefonickým kontaktem a po klinickém vyšetření) budou pacienti vyšetřeni a premoláry budou extrahovány a analyzovány slepými hodnotiteli (kódovanými čísly) ve všech popsaných fázích. Extrakce premolárů budou prováděny učiteli zubního lékařství, případný efekt postprocedury předpokládá a řeší řešitelský tým, procedury pro pacienty jsou bezplatné a vše bude přísně dodržováno doporučení etické komise fakulty stomatologie na univerzitě v Chile.

   3.1 Hodnocení adhezivních nanokompozitů in vivo: Sedmdesát dobrovolníků, kteří z ortodontických důvodů vyžadují extrakci pravého horního a levého prvního premoláru (n = 35 na skupinu), bude vybráno z Ortodontického specializačního programu na klinice Chilské univerzity (bude být náborové období 3 měsíců se spoluřešitelem odpovědným za monitorování (CB)). Kritéria pro zařazení budou (1) léčebné plány indikující extrakce premolárů z ortodontických důvodů, (2) přítomnost zdravých, intaktních, nekazivých, nerestaurovaných a plně prořezaných léčebných zubů a (3) pacienti s dobře kontrolovaným zdravotním stavem které umožňují provádět ve výzkumu všechny postupy s minimálním rizikem. Kritéria pro vyloučení budou (1) pacienti, kteří nesouhlasí s dobrovolnou účastí ve studii, a (2) pacienti, kteří nesplňují všechna kritéria pro zařazení. Malý okluzní preparát provede kalibrovaný operátor ve středu zubu pomocí válcového diamantu vrták (.63109/018,Medium Grit (60730025), Dentsply,NY,USA) a vysokorychlostní násadec poskytující vzduch-voda sprej se standardizovanými rozměry 3x3x5 mm. Po dokončení preparace bude kavita vyplněna pryskyřičným kompozitem (Filtek Supreme; 3M ESPE). Experimentální lepidla dopovaná Cu a Zn budou použita podle pokynů výrobce a nedopované lepidlo bude použito jako kontrola na homologním horním premoláru a návrh jednoduchým náhodným rozdělením paralelních skupin. Pryskyřičný kompozit (Filtek Supreme; 3M ESPE) bude aplikován inkrementální technikou a nakonec bude nanesena jedna vrstva adheziva jako povrch kompozitní náhrady a polymerizována po dobu 10 sekund. Okluze bude zkontrolována a náhrady budou dokončeny a vyleštěny podle pokynů výrobce. Následně leštěním a konečnou úpravou naneseme vrstvu adheziva na konečnou náhradu, která bude polymerizována po dobu 10 sekund (Raddi Cal, SDI, AU). Jeden zub po druhém bude extrahován měsíc po zhotovení náhrad. Pacient dostane infiltrativní a intraligamentální anestezii (přibližně 1,8 ml 2% mepivakainu (36 mg)) s epinefrinem v poměru 1:100 000 (18 mg). Poté budou zuby podrobeny testům.

   3.2 Stanovení povrchových antimikrobiálních vlastností adhezivních nanokompozitů: Pro posouzení antibakteriálních povrchových vlastností dopovaných adheziv bude na finální povrch náhrad aplikována jedna finální vrstva adheziv v modelu in vivo. Postup bude použit k posouzení počtu CFU S. Mutans na kompozitních površích (hlavní výsledek). Před odběrem vzorků biofilmu budou připraveny podnosy pro tisk biofilmu přes výplně. Pro tuto aplikaci použijeme jednorázové aplikační tácky s fluoridovým gelem (Deepak Products Inc., Miami, USA), z nichž každý bude sterilizován v biosafety hood (Esco Technologies Inc., Harboro, USA) pod ultrafialovým světlem po dobu 30 minut. Do každého tácu se poté naplní 7,5 ml agaru TYCSB (kasein, kvasnicový extrakt, L-cystein, sacharóza, bacitracin) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA), což je selektivní médium pro S. mutans. Následně, aby se individualizovala technika odběru vzorků, budou misky nařezány tak, aby se vešly maximálně 3 zuby. Bezprostředně poté se podnosy umístí do sterilních Petriho misek a uloží se do uzavřených plastových sáčků v chladničce. Před použitím budou podnosy umístěny do inkubátoru/kamny (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Korea) na 24 hodin při 37 °C jako opatření kontroly kvality. Třetí a čtvrtý operátor provedou odběr vzorků, který bude proveden mezi 11:00-13:00, aby byla umožněna reorganizace biofilmu po ranním čištění zubů. Odběr vzorků bude proveden tak, že nevidomý operátor jemně přitlačí tác po dobu 20 s na RC náhradu, následuje homologní RC náhrada s adhezivem dopovaným Cu nebo Zn a bez nich.

   Poté, co jsou podnosy se vzorky uloženy ve sterilních Petriho miskách, budou transportovány při 4 °C a poté inkubovány při 37 °C v mikroaerofilní (svíčkové CO2 10%) po dobu 48 hodin. Počítání S.mutans provede čtvrtý operátor, který bude slepý k podnosu, který byl použit k tisku RC náhrad. Později bude provedeno Gramovo barvení ke stanovení mikromorfologie kolonií. Počet S.mutans bude vyjádřen v jednotkách tvořících kolonie (CFU) S.mutans z misek a táců s agarem TYCSB. Vybrané kolonie, které budou kompatibilní s adhezí a morfologickými charakteristikami S.mutans, se suspendují v bujónu Todd-Hewitt (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) a inkubují se při 37 °C po dobu 48 hodin. Kolonie pak budou podrobeny biochemickým testům k identifikaci druhů S. mutans a k jejich odlišení od S. sobrinus. Biochemické testy zahrnují fermentaci rafinózy, fermentaci melibiózy a testy hydrolýzy esculinu. Pozitivní výsledek všech tří testů ukazuje na přítomnost S. mutans.

   3.3 Hodnocení hladin metaloproteázy a/nebo aktivity v macerované dentinové tkáni bude používat podobnou metodologii jako v 2.4.2. .65 bude použito na 20 (n=5 na skupinu) čerstvě extrahovaných nekazivých lidských horních premolárů obnovených předchozím postupem. Po odstranění skloviny a cementu se získají 1 mm silné disky středního/hlubokého koronálního dentinu. Zásobní roztok 1,0 mg/ml fluoresceinem značené želatiny byl připraven přidáním 1,0 ml vody do lahviček obsahujících lyofilizovaný substrát a skladováním při -20 °C až do použití. Zásobní roztok želatiny se zředí 1:8 ředícím pufrem (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) a přidá se činidlo proti vyblednutí (montážní médium s Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, UK). Na vršek každé desky se umístí 50 μl fluorescenční želatinové směsi a přikryje se krycím sklíčkem. Sklíčka jsou chráněna před světlem a inkubována ve zvlhčených komůrkách při 37 °C. Pro identifikaci optimální inkubační doby se pořizují fluorescenční snímky od 1 hodiny do 7 dnů. Podrobný popis 3D analýzy in situ zymografie s konfokální mikroskopií. Stručně řečeno, hydrolýza zhášeného fluoresceinem konjugovaného želatinového substrátu, který ukazuje na aktivitu endogenního želatinolytického enzymu, byla hodnocena vyšetřením pod multifotonovým konfokálním mikroskopem (např.: 488nm a em:lp530nm; Zeiss, LSM 780, Carl Zeiss, Oberkochen , Německo). Optické řezy o tloušťce 85 μm byly získány z různých ohniskových rovin a naskládané snímky byly analyzovány, kvantifikovány a zpracovány pomocí softwaru ZEN 2010 (Carl Zeiss).

   3.4. Stanovení biokompatibility. Z extrahovaných premolárů bude získána zubní dřeň a budou řešeny molekulární markery buněčné životaschopnosti (výsledky) nebo poškození buněk adhezivními nanokompozity.

   Zubní dřeň bude získána způsobem popsaným Vaseemuddin66 z extrahovaných premolárů. Celková RNA bude separována a hladiny mRNA specifických markerů apoptózy a autofagie budou měřeny pomocí qPCR, jak bylo popsáno dříve (2.4.4-2.4.5).

   3.5 Posouzení mechanických vlastností (analýza nanotěsností a stupně konverze pro posouzení stability vazby (výsledek)) bude shodné s metodami v 2.1.

4. Statistická analýza: Statistická analýza bude provedena pomocí softwaru SPSS 23.0 (IBM, New York, NY, USA). Srovnání mezi kvantitativními proměnnými (síla mikrotahové vazby, nanotěsnost, stupeň konverze, počet CFU) mezi dvěma nezávislými skupinami bude analyzováno nepárovým t testem, ANOVA a pots-hoc testem (nebo příslušnými neparametrickými testy podle Shapiro-Wilka testování distribuce dat). Asociace mezi stanoveními vzorků budou vypočítány pomocí Pearsonovy nebo Spearmanovy korelace. Výpočet výkonu byl proveden s použitím údajů z předchozí studie67. K nalezení rozdílu se statistickou významností v konečném počtu CFU (hlavní výsledek) byla potřeba velikost vzorku s minimálně 35 pacienty na skupinu a na každé rameno studie s ohledem na statistickou sílu 0,8 na základě studie Vildosola a studie64 (1 -p). Význam bude uvažován, pokud je hodnota p