Kuparin ja sinkin nanohiukkasten liittämisen vaikutus hammasliimoihin (1170575)

Yleinen tavoite Arvioida kuparin tai sinkin nanohiukkasten liittämisen vaikutusta hammasliimaan sen antimikrobiseen vaikutukseen ja niiden vaikutusta dentiinimatriisin metalloproteaasien aktiivisuuteen. Analysoida liiman mekaanisia ominaisuuksia ja bioyhteensopivuutta Erityiset tavoitteet

1. Kuparin tai sinkin nanohiukkasilla seostetun hammasliiman kehittäminen ja rakenteellinen karakterisointi.

   1.1. Kiinnittyvien nanokomposiittien valmistus; 1.2. Liima-nanokomposiittien rakenteellinen karakterisointi.

2. Arvioida adhesiivisten nanokomposiittien mekaanisia, biokemiallisia ja toiminnallisia vaikutuksia in vitro. Analyysejä tarkastellaan vertaamalla kontrolliliiman tai joko kuparilla tai sinkillä seostettua liimaa tuoreisiin äskettäin poistettuihin hampaisiin (esim. vivo-vaihe) 2.1. Testaa liiman antimikrobista aktiivisuutta; 2. 2. Tutkia adhesiivisten nanokomposiittien vaikutusta matriisin metalloproteaasien tasoon ja/tai aktiivisuuteen;2.3. Arvioida liiman mekaanisia ominaisuuksia;2.4. Biologisen yhteensopivuuden arvioimiseksi. Tarkastellaan primaariviljeltyjen ienfibroblastien elinkelpoisuusmäärityksiä.
3. In vivo -mallin (kliinisen vaiheen) antimikrobisten ominaisuuksien, matriksin metalloproteaasien ja katepsiini B -tasojen ja/tai aktiivisuuden, tarttuvien nanokomposiittien bioyhteensopivuuden in vivo ja mekaanisten ominaisuuksien arvioimiseksi. Uutettaviksi tarkoitetut esihampaat palautetaan joko perinteisellä liimalla tai liiman nanokomposiitilla. Kuukauden kuluttua esihampaat uutetaan ja analysoidaan kuvatulla tavalla.

3.1. Liima-nanokomposiittien pinnan antimikrobisten ominaisuuksien määrittäminen; 3.2. Matriksin metalloproteaasien ja katepsiini B -tasojen ja/tai aktiivisuuden arvioimiseksi maseroidussa dentiinikudoksessa; 3.3 Biologisen yhteensopivuuden määrittämiseksi. Hammasmassaa saadaan uutetuista esihampaista, ja solujen elinkelpoisuuden tai soluvaurion molekyylimarkkereita käsitellään adhesiivisilla nanokomposiiteilla; 3.4 Arvioida liiman mekaanisia ominaisuuksia.

MENETELMÄT

1. Kuparin tai sinkin nanohiukkasilla seostetun hammasliiman kehittäminen. 1.1. Liima-nanokomposiittien valmistus (1): CuNP/liima-nanokomposiitit valmistetaan käyttämällä yhden pullon liimajärjestelmää Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Tämä asetonipohjainen liima sisältää uretaanidimetakrylaatin ja happaman monomeerin dipentaerytritolipentaakrylaattimonofosfaatin seosta. Liiman nanokomposiittien valmistamiseksi punnitaan sopiva määrä nanopartikkelijauhetta (CuNp ja ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chile) ja lisätään suoraan liimapulloon jatkuvassa magneettisekoituksessa. Suspensiota dispergoidaan sitten edelleen ultraäänihauteessa 37 °C:ssa 10 minuutin ajan. Liima-nanokomposiitteja valmistetaan CuNP-pitoisuudella 0,015 - 0,045 painoprosenttia laboratorioidemme aikaisempien tietojen mukaan. Cu- ja Zn-seostettujen liimojen viisi pitoisuutta ovat 0,0150 %, 0,0075 % ja 0,00038 % (pitoisuudet, joilla on antibakteerisesti aktiivisia ominaisuuksia aiempien tietojemme perusteella (Cu 1-2-3 ja Zn 1-2-3).

   1.2. Liima-nanokomposiittien rakenteellinen karakterisointi (1): Nanokomposiittiliimamateriaalien morfologia ja koostumus karakterisoidaan SEM-EDX:llä takaisinsirontaelektronitilassa faasikontrasti- ja AFM-mikroskopian tuottamiseksi. Polymeerimatriisin kemiallinen rakenne ja jäännösmonomeeripitoisuudet analysoidaan heikennetyn kokonaisheijastuksen Fourier-muunnoksen infrapuna- ja Raman-spektroskopioilla. Jäännösmonomeeri analysoidaan ottaen huomioon akryylimonomeerin hiili-hiili-kaksoissidosvärähtely alueella 1684 - 1636 cm-1.

2. Arvioida adhesiivisten nanokomposiittien antibakteerisia, mekaanisia, biokemiallisia ja toiminnallisia vaikutuksia in vitro ja ex vivo. Määrityksiä tarkastellaan vertaamalla tavallisen liiman tai joko kuparilla tai sinkillä seostettua liimaa.

   2.1. Liiman nanokomposiitin antimikrobisten ominaisuuksien määrittäminen (2) 2.1.1 Antibakteerinen aktiivisuus: Lyhyesti sanottuna 10 mm:n levyt, joiden paksuus on 2 mm, valmistetaan hartsikomposiitista (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) ja joko jätetään pinnoittamatta (kontrolli) tai päällystetään liimalla Prime&Bond 2.1 ja vastaava kokeellinen. kahdentoista ryhmän liimasekoitukset ja polymeroituvat valmistajan suositusten mukaisesti 10 sekunnin ajan käyttämällä LED-valokovetusyksikköä (Radii Cal,SDI,AU) tehotiheydellä 1000 mW/cm2. Amalgaamikiekot (Contour; Kerr, Orange, CA) valmistetaan edellä kuvatulla tavalla ja niitä käytetään lisäpositiivisena kontrollina. Yhteensä neljätoista tutkimusryhmää, joissa on kahdeksan näytettä ryhmää kohden, arvioidaan tässä kokeen osassa: (1) kontrolli; (2) amalgaami (metallimateriaalia, kuten positiivista kontrollia) ja 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 ja 8) Zn3. Polymeroimattoman monomeerin poistamisen varmistamiseksi levyt upotetaan 10 ml:aan steriiliä deionisoitua vettä ja niitä sekoitetaan 2 tuntia nopeudella 200 rpm ja 37,8 °C, minkä jälkeen levyjen annetaan kuivua huoneenlämpötilassa vähintään 24 tuntia. Levyt steriloidaan inkuboimalla 70 % etanolissa 10 minuuttia ja kuivataan sitten aseptisesti vähintään 48 tuntia. Kunkin levyn pinta ympätään 100 ml:lla määriteltyä elinkelpoista pitoisuutta 1 108 solua/ml anaerobisesti kasvatettua Streptococcus mutansia, ATCC1 25175 aivosydäninfuusiona (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) . Kunkin käsittelyryhmän elävien solujen pitoisuuden määrittämiseksi pesäkkeitä muodostavina yksiköinä ml:aa kohti (CFU/ml), siirrostetut levyt käsitellään anaerobisesti, minkä jälkeen talteen otettujen CFU:iden kokonaismäärä määritetään.

   2.2. MMP-aktiivisuuden arviointi in vitro ja ex vivo (1-2) 2.2.1 MMP-aktiivisuuden estomääritys (in vitro): Kvantitatiivinen MMP-2-, MMP-8- ja MMP-9-aktiivisuus in vitro määritetään kaupallisella MMP-fluorometrisellä määrityksellä sarjat (SensoLyte assay kits; AnaSpec, San Jose, CA, USA) anti-MMP-aktiivisuuden seulomiseksi. Cu- ja ZnNP-seostettuja liimoja eri pitoisuuksina ja kontrollit ilman Cu- tai ZnNP-liimoja lisätään reaktiopuskuriin, ja määritys suoritetaan valmistajan suositusten mukaisesti. Kun MMP:llä pilkotaan kahdeksi erilliseksi fragmentiksi, 5-FAM:n fluoresenssia seurataan fluoresoivalla mikrolevylukijalla (Sinergy TM).

   2.2.2 MMP-aktiivisuuden ja -tasojen määrittäminen (ex vivo dentiininäytteet näytteillä, jotka on otettu kunnostetuista hampaista dopatuilla liima-aineilla ja kontrolli): 25 (n=5) uutettua kariesvapaata kolmatta poskihammaa kerätään sen jälkeen, kun potilaille on tiedotettu suostumus. Hampaat desinfioidaan 0,5-prosenttisessa kloramiinissa, varastoidaan tislattuun veteen ja käytetään kuuden kuukauden kuluessa poistosta. Kalibroitu operaattori tekee hampaan keskelle pienen okklusaalipreparoinnin standardoiduilla mitoilla 3x3x5 mm käyttämällä sylinterimäistä timanttiporakonetta (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) ja nopeaa poraa. käsikappale tarjoten samalla ilma-vesisuihkua. Ontelon esikäsittelyn jälkeen se täytetään hartsikomposiitilla (Filtek Supreme; 3M ESPE). Cu:lla ja Zn:llä seostettuja kokeellisia liimoja käytetään valmistajan ohjeiden mukaisesti ja seostamatonta liimaa käytetään kontrollina homologisessa ylemmän esihamlaarin päällä. Hartsikomposiitti (Filtek Supreme; 3M ESPE) levitetään inkrementtitekniikalla. Kiille poistetaan kokonaan hitaalla timanttisahalla (Remet, Bologna, Italia) suolaliuoksella kastettaessa ja hampaat leikataan 1 mm:n paksuisten koronaalisten dentiinikiekkojen saamiseksi, jotka jauhetaan sen jälkeen jauheeksi. teräs vasara. Dentiinijauhe jaetaan sitten tasaisesti ja demineralisoidaan (4 °C:ssa 24 tuntia sekoittaen) yhdessä seuraavista vesiliuoksista: (1) 0,87 M etikkahappo, pH = 2,3; (2) 0,26 M sitruunahappo, pH = 2,3; tai (3) 0,5 M EDTA, pH = 6,4; tai (4) 0,5 M EGTA, pH = 6,4. Demineralisoidun dentiinijauheen entsyymiuutto suspendoidaan uuttopuskuriin (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, sisältää 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2 0,02 % NaN3) ja EDTA-vapaa proteaasi-inhibiittoricocktail (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Näytteitä käsitellään sitten ultraäänellä 40 W:n teholla 3 purskea, kukin 10 sekuntia 4 °C:ssa (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA). Pullot sentrifugoidaan nopeudella 18 000 rpm 30 minuuttia 4 °C:ssa, ja supernatantit kerätään. Kaikki supernatanteissa olevat proteiinit saostetaan 4 °C:ssa lisäämällä jauhemaista ammoniumsulfaattia (w/v) 85 %:n lopullisen pitoisuuden ja pH:n 7,0 saavuttamiseksi. Sakka kerätään sentrifugoimalla nopeudella 24 000 rpm 30 minuuttia 4 °C:ssa, liuotetaan uudelleen 10-kertaiseen laimennokseen uuttopuskuriin, dialysoidaan 30 kDa:n kalvon läpi uuttopuskuria vastaan ​​yön yli ja säilytetään 4 °C:ssa analysointiin asti. Tämän jälkeen dentiinijauhe analysoidaan MMP-2-, MMP-9- ja katepsiini B -aktiivisuustasojen arvioimiseksi gelatiinitsymografialla mitattuna ja MMP-8:n arvioimiseksi kollageenitsymografialla, kuten aiemmin on kuvattu.56 Densitometria ilmaistaan ​​muodossa du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA). Lyhyesti sanottuna dentiinijauhenäytteet altistetaan elektroforeesille ei-pelkistävissä denaturoivissa olosuhteissa SDS/PAGE-geeleissä, jotka sisältävät 1 mg/ml gelatiinia tai 0,1 mg/ml kollageenia substraattina. Sitten niitä liotetaan kahdesti 2,5-prosenttisessa Triton X-100:ssa ja inkuboidaan 17 tuntia kehityspuskurissa (20 mM Tris pH 7,4 ja 5 mM CaCl2), värjätään Coomassie Brilliant Blue R-250:lla ja poistetaan 10-prosenttisella etikkahapolla ja 20 % metanoliliuos. MMP-2:n, MMP-8:n, MMP-9:n, katepsiini B:n ja ICTP:n (dentiinikollageenin hydrolyysin merkkiaineena) tasot määritetään joko kaupallisella ELISA Kitillä tai multipleksisilla immunomäärityksillä (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, Luminex-teknologialle) valmistajan suositusten mukaisesti.

   2.3. Liima-nanokomposiittien mekaanisten ominaisuuksien testaus (1-2) Sidoslujuus 2.3.1 Hampaiden valinta ja valmistelu: Seitsemänkymmentä uutettua kariestonta ihmisen kolmatta poskihampaa kerätään sen jälkeen, kun Chilen yliopiston hammasklinikalta on saatu potilaiden tietoinen suostumus (≈2000 kolmasosaa) poskipoistot vuodessa, mikä varmistaa näiden normaalisti hylättyjen hampaiden saatavuuden). Hampaat desinfioidaan 0,5-prosenttisessa kloramiinissa, varastoidaan tislattuun veteen ja käytetään kuuden kuukauden kuluessa poistosta. Tasainen dentiinipinta paljastuu sen jälkeen, kun okklusaalikiille on märkähiontattu #180 SiC -paperilla. Paljastuneita dentiinipintoja kiillotetaan edelleen märällä #600 SiC-paperilla 60 sekunnin ajan sivelykerroksen standardoimiseksi.

   2.3.2 Kokeellinen suunnittelu: Hampaat jaetaan satunnaisesti kahteentoista viiden hengen ryhmään (6 ryhmää liimaa kohti), joista kutakin käsitellään eri pitoisuudella seostettua liimaa. Kontrollina ilman Prime & Bond 2.1 -järjestelmän NP:itä (Dentsply Caulk, Milford) , DE) käytetään.

   2.3.3. Korjausmenettely ja näytteen valmistelu: Liimajärjestelmät tulee käyttää tarkasti kunkin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

   2.3.4 Kiinnitystoimenpiteiden jälkeen: Kaikki hampaat saavat mikrohybridikomposiittirestauroinnin kahdessa 2 mm:n välein. Kutakin lisäystä valopolymeroidaan 40 sekunnin ajan käyttämällä LED-valokovetusyksikköä 1200 mW/cm2-asetuksella (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australia). Palautettuja hampaita säilytetään tislatussa vedessä 37 °C:ssa 24 tuntia ja sitten leikataan pituussuunnassa mesio-distaali- ja bukkaali-linguaalisuunnassa liimatun rajapinnan poikki käyttämällä hidasnopeuksista timanttisahaa (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) saadakseen 15-20 hartsi-dentiinitikkua, joiden jokaisen poikkileikkauspinta-ala on noin 0,8 mm2 mitattuna digitaalisella jarrusatulalla (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokio, Japani). Jokaisesta hampaasta tulevan näytteen mikrovetosidos arvioidaan lujuus (mTBS) lukuun ottamatta kuutta satunnaisesti valittua hartsi-dentiini-sidottua näytettä, jotka jaetaan in situ -konversioasteen (DC) ja nanovuodon (NL) mittaamista varten.

   2.3.5. Mikrovetosidoslujuustesti: Hartsi-dentiinisidottu tikkuja kiinnitetään Geraldelin jigiin käyttämällä syanoakrylaattiliimaa ja testataan jännityksen alaisena (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brasilia) nopeudella 0,5 mm/min, kunnes ne rikkoutuvat. mTBS-arvot lasketaan jakamalla kuormitus vikaantuessa poikkileikkauksen sidosalalla. Näytteiden vikatila luokitellaan koheesiiviseksi (rikkoutuminen yksinomaan dentiinin tai hartsikomposiitin sisällä), liimaiseksi (vika hartsi/dentiini-rajapinnassa) tai sekoitettu (vika hartsi/dentiini-rajapinnassa, mukaan lukien viereisten substraattien koheesiovaurio ). Luokittelu suoritetaan stereomikroskoopilla (SZ40; Olympus, Tokio, Japani) 100-kertaisella suurennuksella. Näytteet, joissa on ennenaikaisia ​​vikoja (PF), sisällytetään keskiarvoon.

   2.3.6. Konversion aste in situ: Kolme hartsi-dentiini-sidottua tikkua kustakin hampaasta märkäkiillotetaan #1500, #2000 ja #2500 SiC-paperilla. Sen jälkeen niitä puhdistetaan ultraäänellä 20 minuuttia ja säilytetään 37,8 °C:n vedessä 24 tuntia ennen DC:n mittaamista. Mikro-Raman-spektroskopiaanalyysi suoritetaan käyttämällä Senterra-laitteita (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Wu¨rttemberg, Saksa). Mikro-Raman-spektrometrin kalibrointi suoritetaan nollaamalla ja sitten mittaamalla piinäytteen kerroin. Näytteet analysoidaan käyttämällä seuraavia mikro-Raman-parametreja: 20 mW neonlaser aallonpituudella 532 nm, spatiaalinen resoluutio 3 mm, spektriresoluutio 5 cm-1, kerääntymisaika 30 sekunnissa 6 lisäyksellä ja 110-kertainen suurennus ( Olympus UK, Lontoo, UK) 1 mm:n säteen halkaisijaan. Spektrit otetaan dentiini-adhesiivirajapinnalta kolmesta eri kohdasta tubulaarisen dentiinin sisällä jokaisesta hartsi-dentiini-sidotusta tikusta. Referenssinä käytetään polymeroimattomien liimojen spektrejä. Spektrien jälkikäsittely suoritetaan käyttämällä Opus Spectroscopy Softwaren versiota 6.5. Monomeerin ja polymeerin kaksoissidospitoisuuden suhde liimassa lasketaan: jossa ''R'' on alifaattisten ja aromaattisten piikkien pinta-alojen suhde 1639 cm-1:n ja 1609 cm-1:n kohdalla polymeroiduissa ja polymeroimattomissa liimoissa. Kaikkien samasta hampaasta peräisin olevien hartsi-dentiinisidosten in situ DC:stä lasketaan keskiarvo tilastollisia tarkoituksia varten.

   2.3.7. Nanovuodon arviointi: Kolme hartsilla sidottua tikkua kustakin hampaasta laitetaan ammoniakkihopeanitraattiin, joka on valmistettu Tay et al.57:n kuvaaman protokollan mukaisesti, ja säilytetään pimeässä 24 tuntia. Sen jälkeen ne huuhdellaan perusteellisesti tislatussa vedessä ja upotetaan valokehitysliuokseen 8 tunniksi fluoresoivassa valossa hopea-ionien pelkistämiseksi metallisiksi hopearakeiksi sidotun rajapinnan onteloissa. Näytteet märkäkiillotetaan #600, #1000, #1200, #1500, #2000 ja #2500 SiC-paperilla sekä 1 ja 0,25 mm:n timanttipastalla (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) käyttämällä kiillotusliina. Ne puhdistetaan ultraäänellä, ilmakuivataan, kiinnitetään tykkiin ja päällystetään hiilikullalla (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). Hartsi-dentiini-rajapinnat analysoidaan kenttäemission pyyhkäisyelektronimikroskoopilla, jota käytetään takaisinsirontatilassa (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, UK). Jokaisesta hartsi-dentiiniliitetystä tikusta otetaan kolme kuvaa. Sokeutunut tutkija mittaa NL:n suhteellisen prosenttiosuuden liima- ja hybridikerroksissa kussakin näytteessä kaikissa kuvissa Image J -ohjelmistolla58. Saman näytteen arvoista lasketaan keskiarvo, ja kaikkien samasta hampaasta olevien tikkojen keskimääräinen NL on keskiarvo.

   2.4 Arvioi bioyhteensopivuus, elinkelpoisuusmääritykset primaarisesti viljellyissä ienfibroblasteissa. 2.4.1 Soluviljelmät: Ihmisen fibroblastien primääriviljelmät saadaan eksplanttimenetelmällä kolmen aikuisen miespuolisen poskihaavan retromolaarisesta kudoksesta.

   Ihmisen Saos-2-osteosarkoomasolulinjaa, jota käytetään yleisesti arvioimaan osteoblastien ja biomateriaalien bioyhteensopivuutta, viljellään Alcaide et ai.60:n kuvatulla tavalla.

   Solut kylvetään 96-kuoppaiselle levylle tiheydellä 3000 solua kuoppaa kohti. 24 tunnin kuluttua kontrollielatusaine korvataan 100 µl:lla eri laimennoksia oikeaa liimaa (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %). Levyjä inkuboidaan 24 tuntia, 48 tuntia ja 72 tuntia 37 °C:ssa °C inkubaattori (5 % CO2) ennen elinkelpoisuus- tai solukuolemamäärityksiä.

   2.4.2 Solujen elinkelpoisuus ja solusyklianalyysi: Ihmisen fibroblastien primääriviljelmät saadaan explant-menetelmällä kolmen aikuisen miespuolisen poskihaavan retromolaarisesta kudoksesta.

   Ihmisen Saos-2-osteosarkoomasolulinjaa, jota käytetään yleisesti arvioimaan osteoblastien ja biomateriaalien bioyhteensopivuutta, viljellään Alcaide et ai.60:n kuvatulla tavalla.

   Solut kylvetään 96-kuoppaiselle levylle tiheydellä 3000 solua kuoppaa kohti. 24 tunnin kuluttua kontrollielatusaine korvataan 100 µl:lla eri laimennoksia oikeaa liimaa (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %). Levyjä inkuboidaan 24 tuntia, 48 tuntia ja 72 tuntia 37 °C:ssa °C inkubaattori (5 % CO2) ennen elinkelpoisuus- tai solukuolemamäärityksiä.

   2.4.3 Elinkykyisten, varhaisten apoptoottisten, myöhäisten apoptoottisten ja nekroottisten solujen kvantifiointi fluoresenssimikroskoopilla: Kasibhatlan et al:n kuvaamaa protokollaa käytetään 61. Solut värjätään akridiinioranssi/etidiumbromidiliuoksella (AO/EB) ja tutkitaan fluoresenssimikroskopialla. AO värjää sekä elävät että kuolleet solut. EB värjää vain solut, jotka ovat menettäneet kalvon eheyden. Elävät solut näyttävät tasaisen vihreiltä. Varhaiset apoptoottiset solut värjäytyvät vihreiksi ja sisältävät kirkkaan vihreitä pisteitä ytimissä kromatiinin kondensaation ja tuman fragmentoitumisen seurauksena. Myöhäiset apoptoottiset solut sisältävät myös etidiumbromidia ja värjäytyvät siksi oranssiksi, mutta toisin kuin nekroottisissa soluissa, myöhäisissä apoptoottisissa soluissa on kondensoituneita ja usein fragmentoituneita ytimiä. Nekroottiset solut värjäytyvät oranssiksi, mutta niiden tuman morfologia muistuttaa elävien solujen morfologiaa ilman kondensoitunutta kromatiinia61.

   2.4.4 Apoptoosin havaitseminen fosfatidyyliseriinin paljastamisella, DNA-portaat sekä apoptoottisen mRNA:n ja proteiinien kvantitointi: Fosfatidyyliseriinin esiintyminen plasmakalvon ulkopinnalla analysoidaan varhaisena signaalina apoptoosista värjäämällä anneksiini V (A5)-allofykosyaanilla (APC), kuten on kuvattu julkaisussa Alcaide et al60. Koettimen APC fluoresenssi analysoidaan virtaussytometrialla.

   Apoptoottinen DNA ladder -määritys suoritetaan käyttämällä DNA ladder Kit -sarjaa (Roche, Saksa).

   Tuumorisuppressorin (p53), pro-apoptoottisen (bax, kaspaasi 3) ja anti-apoptoottisen (bcl-2) välittäjäaineiden mRNA- ja proteiinitasoja tarkastellaan kvantitatiivisen PCR:n ja immunoblottin avulla.

   2.4.5 Autofagian arviointi: Metallien NP:iden oletettujen vaikutusten testaamiseksi solun autofagiaan tarkastellaan erilaisia ​​autofagiamarkkereita. Autofaginen virtaus ja p62-taso havaitaan Western blot -menetelmällä, ja autofagosomit visualisoidaan fluoresenssimikroskoopilla laskemalla LC3-positiivinen puncta63.

3. Metalloproteaasitasojen ja/tai liima-nanokomposiittien aktiivisuuden ja biologisen yhteensopivuuden arviointi in vivo.

   Uutettaviksi tarkoitetut esihampaat palautetaan joko perinteisellä liimalla tai liiman nanokomposiitilla. Kuukauden kuluttua (palauttaminen puhelimitse ja klinikkatutkimuksen jälkeen) potilaat tutkitaan ja potilaan esihammashampaat poimitaan ja analysoidaan sokeiden arvioijien toimesta (koodattu numeroilla) kaikissa vaiheissa kuvatulla tavalla. Esihammashampaiden poistot tekevät hammaslääketieteen opettajat, toimenpiteen jälkeiset vaikutukset oletetaan ja ratkaistaan ​​tutkimusryhmässä, toimenpiteet potilaille ovat ilmaisia ​​ja kaikessa noudatetaan tiukasti tiedekunnan eettisen toimikunnan suosituksia. Chilen yliopiston hammaslääketieteestä.

   3.1 Liima-nanokomposiittien in vivo -arviointi: Seitsemänkymmentä vapaaehtoista, jotka tarvitsevat oikomissyistä oikean ja vasemman ylemmän esihammasta (n = 35 per ryhmä) oikomissyistä, valitaan Chilen yliopiston klinikan oikomishoidon erikoistumisohjelmasta. olla 3 kuukauden rekrytointijakso valvonnasta vastaavan tutkijan kanssa (CB)). Osallistumiskriteereinä ovat (1) hoitosuunnitelmat, jotka osoittavat esihammaspoistot oikomissyistä, (2) terveiden, ehjien, ei-karioosien, korjaamattomien ja täysin puhjenneiden hoitohampaiden läsnäolo ja (3) potilaat, joiden terveydentila on hyvin hallinnassa. jotka mahdollistavat kaikkien toimenpiteiden suorittamisen tutkimuksessa minimaalisella riskillä. Poissulkemiskriteerit ovat (1) potilaat, jotka eivät suostu osallistumaan tutkimukseen, ja (2) potilaat, jotka eivät täytä kaikkia osallistumiskriteerejä. Kalibroitu operaattori tekee pienen purentavalmisteen hampaan keskelle käyttämällä sylinteritimanttia. poranterä (.63109/018,Medium Grit (60730025), Dentsply,NY,USA) ja nopea käsikappale, joka tarjoaa ilma-vesisuihkun standardoiduilla mitoilla 3x3x5 mm. Ontelon esikäsittelyn jälkeen se täytetään hartsikomposiitilla (Filtek Supreme; 3M ESPE). Cu:lla ja Zn:llä seostettuja kokeellisia liimoja käytetään valmistajan ohjeiden mukaisesti ja seostamatonta liimaa käytetään kontrollina homologisessa ylemmissä esihamlaarissa ja suunnittelussa yksinkertaisella rinnakkaisten ryhmien satunnaistaminen. Hartsikomposiitti (Filtek Supreme; 3M ESPE) levitetään inkrementaalisella tekniikalla, ja lopuksi levitetään yksi kerros liimaa komposiittirestauroinnin pinnaksi ja polymeroidaan 10 sekuntia. Okkluusio tarkistetaan ja täytteet viimeistellään ja kiillotetaan valmistajan ohjeiden mukaan. Myöhemmin kiillotusta ja viimeistelyä käytetään liimakerroksen levittämiseen lopulliseen restauraatioon, joka polymeroituu 10 sekuntia (Raddi Cal, SDI, AU). Yksi hammas kerrallaan poistetaan kuukauden kuluttua korjausten tekemisestä. Potilas saa infiltratiivisen ja ligamentaalisen anestesian (noin 1,8 ml 2 % mepivakaiinia (36 mg)) epinefriinillä suhteessa 1:100 000 (18 mg). Sitten hampaat testataan.

   3.2 Liiman nanokomposiittien pinnan antimikrobisten ominaisuuksien määrittäminen: Seostettujen liimojen antibakteeristen pintaominaisuuksien arvioimiseksi levitetään yksi lopullinen liimakerros täytteiden lopulliselle pinnalle in vivo -mallissa. Menettelyä käytetään S.Mutansin CFU-määrän arvioimiseen komposiittipinnoilla (päätulos). Ennen biofilmin näytteenottoa alustat valmistetaan biofilmin painamiseksi täytteiden päälle. Tässä sovelluksessa käytämme kertakäyttöisiä fluoridigeelin levitysalustoja (Deepak Products Inc., Miami, USA), joista jokainen steriloidaan bioturvallisessa hupussa (Esco Technologies Inc., Harboro, USA) ultraviolettivalossa 30 minuutin ajan. Jokaiselle alustalle ladataan sitten 7,5 ml TYCSB-agaria (kaseiini, hiivauute, L-kysteiini, sakkaroosi, basitrasiini) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA), joka on selektiivinen väliaine S. mutansille. Myöhemmin näytteenottotekniikan yksilöimiseksi alustat leikataan siten, että ne sopivat enintään 3 hampaan. Välittömästi tämän jälkeen alustat asetetaan steriileille petrimaljoille ja säilytetään suljetuissa muovipusseissa jääkaapissa. Ennen käyttöä alustat asetetaan inkubaattoriin/liesiin (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Korea) 24 tunniksi 37 °C:een laadunvalvontatoimenpiteenä. Kolmas ja neljäs operaattori suorittavat näytteenoton, joka suoritetaan klo 11.00-13.00, jotta biofilmi voidaan järjestää uudelleen aamuharjauksen jälkeen. Näytteenoton suorittaa sokea käyttäjä, joka painaa alustaa varovasti 20 sekunnin ajan RC-restauroinnin päällä, minkä jälkeen suoritetaan homologinen RC-restaurointi Cu- tai Zn-seosteisella liimalla ja ilman.

   Kun näytelevyt on säilytetty steriileillä petrimaljoilla, ne kuljetetaan 4 °C:ssa ja inkuboidaan sitten 37 °C:ssa mikroaerofiilisessä (purkkikynttilä CO2 10 %) 48 tuntia. S.mutans-laskennan suorittaa neljäs operaattori, joka sokeutuu lokeroon, jota käytettiin RC-restauraatioiden tulostamiseen. Myöhemmin Gram-värjäys suoritetaan pesäkkeiden mikromorfologian määrittämiseksi. S. mutans -määrä ilmaistaan ​​S. mutansin pesäkkeitä muodostavina yksiköinä (CFU) levyiltä ja levyiltä TYCSB-agarilla. Valitut pesäkkeet, jotka ovat yhteensopivia S. mutansin adheesion ja morfologisten ominaisuuksien kanssa, suspendoidaan Todd-Hewitt-liemeen (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) ja inkuboidaan 37 °C:ssa 48 tuntia. Pesäkkeille suoritetaan sitten biokemialliset testit S. mutans -lajin tunnistamiseksi ja sen erottamiseksi S. sobrinuksesta. Biokemialliset testit sisältävät raffinoosikäymisen, melibioosin käymisen ja eskuliinin hydrolyysikokeet. Positiivinen tulos kaikissa kolmessa testissä osoittaa S. mutansin läsnäolon.

   3.3 Metalloproteaasitasojen ja/tai aktiivisuuden arvioinnissa maseroidussa dentiinikudoksessa käytetään samanlaista menetelmää kuin kohdassa 2.4.2. 3.3.1 Tsymografia in situ MMP:iden 2 ja 9 aktiivisuuden arvioimiseksi (tulos): Mazzoni et al. 0,65 käytetään 20:lle (n = 5 ryhmää kohti) juuri uutetulle ei-karioosittomalle ihmisen ylemmälle esihammasta, jotka on palautettu aikaisemmalla menetelmällä. Kiilteen ja sementin poistamisen jälkeen saadaan 1 mm:n paksuiset keski-/syväkoronaalisen dentiinilevyt. Fluoreseiinileimatun gelatiinin 1,0 mg/ml varastoliuos valmistettiin lisäämällä 1,0 ml vettä pulloihin, jotka sisälsivät lyofilisoitua substraattia, ja varastoimalla -20 °C:ssa käyttöön asti. Gelatiinivarastoliuos laimennetaan suhteessa 1:8 laimennuspuskurilla (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) ja lisätään haalistumista estävää ainetta (Mounting Medium with Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, UK). Jokaisen laatan päälle asetetaan 50 μl määrä fluoresoivaa gelatiiniseosta ja peitetään peitinlasilla. Objektilasit ovat valosuojattuja ja niitä inkuboidaan kostutetuissa kammioissa 37 °C:ssa. Optimaalisen inkubaatioajan tunnistamiseksi fluoresoivia kuvia otetaan 1 tunnista 7 päivään. Yksityiskohtainen kuvaus in situ -tsymografian 3D-analyysistä konfokaalimikroskopialla. Lyhyesti sanottuna sammutetun fluoreseiinikonjugoidun gelatiinisubstraatin hydrolyysi, joka viittaa endogeeniseen gelatinolyyttiseen entsyymiaktiivisuuteen, arvioitiin tutkimalla monifotonikonfokaalimikroskoopilla (esim. 488 nm ja em: lp530 nm; Zeiss, LSM Ze8, 0, Carlkocheniss 78, 0). , Saksa). 85 μm paksuja optisia leikkeitä hankittiin eri polttotasoista, ja pinotut kuvat analysoitiin, kvantifioitiin ja käsiteltiin ZEN 2010 -ohjelmistolla (Carl Zeiss).

   3.4. Biologisen yhteensopivuuden määritys. Hammasmassaa saadaan uutetuista esihammasta, ja solujen elinkelpoisuuden (tulosten) tai liima-nanokomposiittien aiheuttaman soluvaurion molekyylimarkkereita käsitellään.

   Hammasmassaa saadaan Vaseemuddin66:n kuvaamalla tavalla uutetuista esihammasta. Kokonais-RNA erotetaan ja spesifisten apoptoosien ja autofagiamarkkerien mRNA-tasot mitataan qPCR:llä, kuten aiemmin on kuvattu (2.4.4-2.4.5).

   3.5 Mekaanisten ominaisuuksien arviointi (nanovuoto- ja astekonversioanalyysi sidoksen stabiiliuden arvioimiseksi (tulos)) on sama kuin kohdassa 2.1.

4. Tilastollinen analyysi: Tilastollinen analyysi suoritetaan käyttämällä SPSS 23.0 -ohjelmistoa (IBM, New York, NY, USA). Kvantitatiivisten muuttujien (mikrotensiilisen sidoksen lujuus, nanovuoto, konversioaste, CFU-luku) vertailut kahden riippumattoman ryhmän välillä analysoidaan parittoman t-testillä, ANOVA- ja pots-hoc-testillä (tai vastaavilla ei-parametrisilla testeillä Shapiro-Wilkin mukaan tietojen jakelun testaus). Näytteenmääritysten väliset assosiaatiot lasketaan Pearsonin tai Spearmanin korrelaatiolla. Teholaskenta suoritettiin käyttämällä aikaisemman tutkimuksen tietoja67. Otoskoko, jossa oli vähintään 35 potilasta ryhmää ja kutakin tutkimushaaria kohti, tarvittiin tilastollisesti merkitsevän eron löytämiseksi CFU:n lopullisessa määrässä (päätulos), kun otetaan huomioon tilastollinen teho 0,8, joka perustuu Vildosola et a -tutkimukseen64 (1). -β). Merkitys otetaan huomioon, jos p-arvo on