Влияние введения наночастиц меди и цинка в стоматологические адгезивы (1170575)

Общая цель Оценить влияние включения наночастиц меди или цинка в стоматологический адгезив на его противомикробное действие и их влияние на активность металлопротеаз матрикса дентина. Анализ механических свойств и биосовместимости адгезивов Особенности Цели

1. Разработать и структурно охарактеризовать стоматологический адгезив, легированный наночастицами меди или цинка.

   1.1. Приготовление адгезивных нанокомпозитов; 1.2. Структурная характеристика адгезивных нанокомпозитов.

2. Оценить механические, биохимические и функциональные эффекты адгезивных нанокомпозитов in vitro. Будут рассмотрены анализы, сравнивающие добавление контрольного клея или клея, легированного медью или цинком, на свежие недавно удаленные зубы (например, прижизненная фаза) 2.1. Проверить антимикробную активность клея; 2. 2. Изучить влияние адгезивных нанокомпозитов на уровень и/или активность матриксных металлопротеаз; 2.3. Оценить механические свойства клея; 2.4. Для оценки биосовместимости. Будут рассмотрены анализы жизнеспособности первично культивируемых фибробластов десны.
3. Оценить антимикробные свойства модели in vivo (клиническая фаза), уровни и/или активность матриксных металлопротеаз и катепсина B, биосовместимость адгезивных нанокомпозитов in vivo и механические свойства. Премоляры, показанные для удаления, будут восстановлены с использованием либо традиционного клея, либо адгезивного нанокомпозита. Через месяц премоляры будут извлечены и проанализированы, как описано.

3.1. Определить поверхностные антимикробные свойства адгезивных нанокомпозитов; 3.2. Для оценки уровней и/или активности матриксных металлопротеаз и катепсина В в мацерированной ткани дентина; 3.3 Для определения биосовместимости. Зубная пульпа будет получена из удаленных премоляров, а молекулярные маркеры жизнеспособности клеток или повреждения клеток будут адресованы адгезивным нанокомпозитам;3.4 Оценить механические свойства клея.

МЕТОДЫ

1. Разработать стоматологический адгезив, легированный наночастицами меди или цинка. 1.1. Подготовка адгезивных нанокомпозитов (1): CuNP/адгезивные нанокомпозиты будут приготовлены с использованием однобутылочной адгезивной системы Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Этот клей на основе ацетона содержит смесь диметакрилата уретана и кислого мономера дипентаэритритпентаакрилатмонофосфата. Для приготовления адгезивных нанокомпозитов взвешивают соответствующие количества порошка наночастиц (CuNp и ZnNp, Sigma Aldrich, Сантьяго, Чили) и добавляют непосредственно в бутылку с клеем при постоянном магнитном перемешивании. Затем суспензию дополнительно диспергируют в ультразвуковой ванне при 37°С в течение 10 минут. Адгезивные нанокомпозиты будут приготовлены с содержанием CuNP в диапазоне от 0,015 до 0,045 мас.% в соответствии с предыдущими данными наших лабораторий. Пять концентраций клеев, легированных Cu и Zn, будут составлять 0,0150%, 0,0075% и 0,00038% (концентрации с антибактериальными активными свойствами, основанные на наших предыдущих данных (Cu 1-2-3 и Zn 1-2-3).

   1.2. Структурная характеристика адгезивных нанокомпозитов (1): Морфология и состав нанокомпозитных адгезивных материалов будут охарактеризованы с помощью SEM-EDX в режиме обратного рассеяния электронов для получения фазово-контрастной и АСМ-микроскопии. Химическая структура полимерной матрицы и содержание остаточного мономера будут проанализированы с помощью инфракрасной спектроскопии Фурье с ослабленным полным отражением и спектроскопии комбинационного рассеяния. Остаточный мономер будет проанализирован с учетом колебаний двойной связи углерод-углерод акрилового мономера в диапазоне 1684-1636 см-1.

2. Оценить антибактериальные, механические, биохимические и функциональные эффекты адгезивных нанокомпозитов in vitro и ex vivo. Анализы будут рассмотрены для сравнения добавления обычного клея или клея, легированного либо медью, либо цинком.

   2.1. Анализ антимикробных свойств адгезивного нанокомпозита (2) 2.1.1 Антибактериальная активность: Вкратце, 10-мм диски толщиной 2 мм будут изготовлены с использованием полимерного композита (Filtek Supreme Ultra; 3M, Сент-Пол, Миннесота) и либо оставлены без покрытия (контроль), либо покрыты адгезивом Prime&Bond 2.1 и эквивалентным экспериментальным клеевых смесей двенадцати групп и полимеризовали в соответствии с рекомендациями производителей в течение 10 секунд с использованием светодиодного фотополимеризатора (Radii Cal,SDI,AU) при плотности мощности 1000 мВт/см2. Диски из амальгамы (Contour; Kerr, Orange, CA) будут изготовлены, как описано ранее, и использованы в качестве дополнительного положительного контроля. Всего в этой части эксперимента будет оцениваться четырнадцать исследовательских групп по восемь образцов в каждой: (1) контроль; (2) амальгама (металлический материал, используемый в качестве положительного контроля) и 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3, 6) Zn1, 7) Zn2 и 8) Zn3. Чтобы обеспечить удаление неполимеризованного мономера, диски погружают в 10 мл стерильной деионизированной воды и перемешивают в течение 2 часов при 200 об/мин и 37,8°C, после чего диски оставляют сохнуть при комнатной температуре не менее чем на 24 часа. Диски стерилизуют путем инкубации в 70% этаноле в течение 10 минут, а затем асептически сушат не менее 48 часов. Поверхность каждого диска инокулируют 100 мл бульона с определенной жизнеспособной концентрацией 1·108 клеток/мл анаэробно выращенного Streptococcus mutans, ATCC1 25175 в инфузии головного мозга и сердца (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). . Для определения концентрации жизнеспособных клеток для каждой лечебной группы в колониеобразующих единицах на мл (КОЕ/мл) инокулированные диски подвергают анаэробной обработке, после чего определяют общее количество восстановленных КОЕ.

   2.2. In vitro и ex vivo оценка активности MMP (1-2) 2.2.1 Анализ ингибирования активности MMP (in vitro): Количественную активность MMP-2, MMP-8 и MMP-9 in vitro определяют с помощью коммерческого флуорометрического анализа MMP. наборы (наборы для анализа SensoLyte; AnaSpec, Сан-Хосе, Калифорния, США) для скрининга активности анти-ММП. Клеи, легированные Cu и ZnNP, в различных концентрациях и контроли без клеев Cu или ZnNP будут добавлены в реакционный буфер, и анализ будет проведен в соответствии с рекомендациями производителя. После расщепления на 2 отдельных фрагмента с помощью ММР флуоресценцию 5-FAM будут контролировать с помощью флуоресцентного ридера для микропланшетов (Sinergy TM).

   2.2.2 Определение активности и уровней ММП (образцы дентина ex vivo с образцами, полученными из зубов, восстановленных с помощью легированных адгезивов, и контроль): Двадцать пять (n=5) удаленных свободных от кариеса третьих моляров человека будут взяты после информирования пациентов. согласие. Зубы дезинфицируют 0,5% раствором хлорамина, хранят в дистиллированной воде и используют в течение шести месяцев после удаления. Небольшая окклюзионная препарация со стандартными размерами 3x3x5 мм будет выполнена квалифицированным оператором в центре зуба с использованием цилиндрического алмазного бора (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) и высокоскоростного инструмента. рукоятка, обеспечивая воздушно-водяной спрей. После завершения препарирования полости она будет заполнена полимерным композитом (Filtek Supreme; 3M ESPE). Экспериментальные клеи, легированные Cu и Zn, будут использоваться в соответствии с инструкциями производителя, а нелегированный адгезив будет использоваться в качестве контроля на гомологичном верхнем премоляре. Композит на основе смолы (Filtek Supreme; 3M ESPE) будет наноситься поэтапно. Эмаль будет полностью удалена низкоскоростной алмазной пилой (Remet, Болонья, Италия) под промыванием физиологическим раствором, а зубы будут разрезаны для получения пластин коронкового дентина толщиной 1 мм, которые впоследствии будут измельчены в порошок с помощью стальной молоток. Затем порошок дентина будет поровну разделен и деминерализован (при 4°C в течение 24 часов при перемешивании) в одном из следующих водных растворов: (1) 0,87 М уксусная кислота, pH = 2,3; (2) 0,26 М лимонная кислота, рН = 2,3; или (3) 0,5 М ЭДТА, рН 6,4; или (4) 0,5 М EGTA, pH = 6,4. Ферментную экстракцию деминерализованного порошка дентина суспендируют в экстракционном буфере (50 мМ Tris-HCl, pH 6,0, содержащий 5 мМ CaCl2, 100 мМ NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % NONIDET P-40, 0,1 мМ ZnCl2, 0,02% NaN3) и смесь ингибиторов протеазы без ЭДТА (Sigma Chemical, Сент-Луис, Миссури, США). Затем образцы подвергают ультразвуковой обработке с выходной мощностью 40 Вт в течение 3 импульсов по 10 с каждый при 4°C (ультразвуковой жидкостный процессор Sonicator, модель W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Фармингдейл, штат Нью-Йорк, США). Флаконы центрифугируют при 18 000 об/мин в течение 30 мин при 4°C и собирают супернатанты. Все белки, присутствующие в супернатантах, будут осаждаться при 4°C путем добавления порошкообразного сульфата аммония (масса/объем) до достижения конечной концентрации 85% и pH 7,0. Осадок собирают центрифугированием при 24 000 об/мин в течение 30 мин при 4°C, повторно растворяют в 10-кратном разбавлении в экстракционном буфере, подвергают диализу через мембрану 30 кДа против экстракционного буфера в течение ночи и хранят при 4°C до анализа. После этого порошок дентина будет проанализирован для оценки уровней активности MMP-2, MMP-9 и катепсина B, измеренных с помощью желатиновой зимографии, и для оценки MMP-8 с помощью коллагеновой зимографии, как описано ранее.56 Денситометрия будет выражаться как du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, США). Вкратце, образцы порошка дентина подвергают электрофорезу в невосстанавливающих денатурирующих условиях в гелях SDS/PAGE, содержащих 1 мг/мл желатина или 0,1 мг/мл коллагена в качестве субстратов. Затем их дважды замачивают в 2,5% растворе тритона Х-100 и инкубируют в течение 17 часов в проявочном буфере (20 мМ трис, рН 7,4 и 5 мМ CaCl2), окрашивают кумасси бриллиантовым синим R-250 и обесцвечивают 10% уксусной кислотой. 20% раствор метанола. Уровни MMP-2, MMP-8, MMP-9, катепсина B и ICTP (в качестве маркера гидролиза коллагена в дентине) будут определяться либо коммерческим набором ELISA, либо мультиплексными иммуноанализами (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, для технологии Luminex) в соответствии с рекомендациями производителя.

   2.3. Испытание механических свойств адгезивных нанокомпозитов (1-2) Сила сцепления 2.3.1 Отбор и подготовка зубов: после получения информированного согласия пациентов стоматологической клиники Чилийского университета (≈2000 моляров в год, что обеспечивает наличие этих зубов, которые обычно выбрасываются). Зубы дезинфицируют 0,5% раствором хлорамина, хранят в дистиллированной воде и используют в течение шести месяцев после удаления. После влажной шлифовки окклюзионной эмали наждачной бумагой #180 SiC обнажается плоская поверхность дентина. Обнаженные поверхности дентина будут дополнительно отполированы влажной бумагой #600 SiC в течение 60 секунд для стандартизации смазанного слоя.

   2.3.2 Схема эксперимента: Зубы будут случайным образом разделены на двенадцать групп по пять штук (6 групп на клей), каждая из которых будет обработана легированным клеем различной концентрации. В качестве контроля без НЧ системы Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Милфорд , DE) будет использоваться.

   2.3.3. Восстановительная процедура и подготовка образцов: Адгезивные системы наносятся строго в соответствии с инструкциями производителя.

   2.3.4 После процедуры фиксации: на все зубы будет наложен микрогибридный композит с шагом 2 мм. Каждая порция будет подвергаться светополимеризации в течение 40 секунд с использованием светодиодного фотополимеризатора при мощности 1200 мВт/см2 (Radii-cal; SDI Limited, Бейсуотер, Виктория, Австралия). Восстановленные зубы будут храниться в дистиллированной воде при температуре 37°C в течение 24 часов, а затем будут сделаны продольные срезы в мезио-дистальном и щечно-язычном направлениях поперек склеиваемой поверхности с использованием низкоскоростной алмазной пилы (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) для получения от 15 до 20 полимерно-дентиновых палочек, каждая с площадью поперечного сечения приблизительно 0,8 мм2 при измерении цифровым штангенциркулем (Digimatic Caliper; Митутойо, Токио, Япония). прочности (mTBS), за исключением шести случайно выбранных образцов, связанных смолой и дентином, которые будут разделены для измерения степени конверсии in situ (DC) и нанопротечки (NL).

   2.3.5. Испытание на прочность сцепления при микрорастяжении. Связанные дентином и резиной стержни будут прикреплены к приспособлению Geraldeli с помощью цианоакрилатного клея и испытаны на растяжение (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Бразилия) со скоростью 0,5 мм/мин до разрушения. Значения mTBS рассчитываются путем деления нагрузки при разрушении на площадь поперечного сечения соединения. Тип разрушения образцов будет классифицироваться как когезионный (разрушение исключительно в пределах дентина или полимерного композита), адгезивный (разрушение на границе раздела полимер/дентин) или смешанный (разрушение на границе раздела полимер/дентин, включая когезионное разрушение соседних субстратов). ). Классификация будет проводиться под стереомикроскопом (SZ40; Olympus, Токио, Япония) при 100-кратном увеличении. Образцы с преждевременным отказом (PF) будут включены в среднее значение.

   2.3.6. Степень конверсии in situ: три штифта из каждого зуба, связанные смолой и дентином, будут отполированы во влажном состоянии с помощью SiC-бумаги #1500, #2000 и #2500. Затем их подвергают ультразвуковой очистке в течение 20 минут и хранят в воде при температуре 37,8 °C в течение 24 часов перед измерением постоянного тока. Анализ микро-рамановской спектроскопии будет выполняться с использованием оборудования Senterra (Bruker Optik GmbH, Эттлинген, Баден-Вюртемберг, Германия). Калибровка микрорамановского спектрометра будет выполняться путем его сброса на ноль, а затем измерения коэффициента кремниевого образца. Образцы будут анализироваться с использованием следующих параметров микрорамановского рассеяния: неоновый лазер мощностью 20 мВт, длина волны 532 нм, пространственное разрешение 3 мм, спектральное разрешение 5 см-1, время накопления 30 секунд с 6 дополнительными добавками и увеличение 110x ( Olympus UK, Лондон, Великобритания) до диаметра луча 1 мм. Спектры будут сняты на границе дентин-адгезив в трех разных местах в межтрубчатом дентине для каждой палочки, связанной смолой и дентином. Спектры неполимеризованных клеев будут использоваться в качестве эталонов. Постобработка спектров будет выполняться с использованием специального программного обеспечения Opus Spectroscopy версии 6.5. Будет рассчитано отношение содержания двойных связей мономера к полимеру в клее: где «R» — отношение площадей алифатических и ароматических пиков при 1639 см-1 и 1609 см-1 в полимеризованных и неполимеризованных клеях. Для статистических целей будет усреднена DC in situ всех штифтов, соединенных смолой и дентином из одного и того же зуба.

   2.3.7. Оценка наноутечки: три соединенных смолой палочки от каждого зуба будут помещены в аммиачный нитрат серебра, приготовленный в соответствии с протоколом, описанным Tay et al.57, и храниться в темноте в течение 24 часов. Затем их тщательно промывают в дистиллированной воде и погружают в фотопроявочный раствор на 8 часов под флуоресцентным светом, чтобы восстановить ионы серебра до зерен металлического серебра внутри пустот вдоль склеиваемой поверхности. Образцы будут подвергаться мокрой полировке с помощью SiC-бумаги № 600, № 1000, № 1200, № 1500, № 2000 и № 2500 и алмазной пасты размером 1 и 0,25 мм (Buehler Ltd., Лейк-Блафф, Иллинойс) с использованием ткань для полировки. Они будут очищены ультразвуком, высушены на воздухе, установлены на заглушки и покрыты углеродным золотом (MED 010; Balzers Union, Balzers, Лихтенштейн). Интерфейсы смолы и дентина будут проанализированы в сканирующем электронном микроскопе с полевой эмиссией, работающем в режиме обратного рассеяния (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Кембридж, Великобритания). Каждой палочки, связанной смолой и дентином, будут сделаны три изображения. Относительный процент NL в клеевом и гибридном слоях в каждом образце будет измеряться на всех изображениях с использованием программного обеспечения Image J58 слепым исследователем. Значения одного и того же образца будут усреднены, а среднее значение NL всех палочек одного и того же зуба будет средним.

   2.4 Оценка биосовместимости, анализ жизнеспособности первично культивированных фибробластов десны 2.4.1 Культуры клеток. Первичные культуры фибробластов человека будут получены методом эксплантации из ретромолярной ткани третьих моляров трех взрослых мужчин.

   Линия клеток остеосаркомы человека Saos-2, обычно используемая для оценки биосовместимости между остеобластами и биоматериалами, будет культивироваться, как описано Alcaide et al.60.

   Клетки будут высевать в 96-луночный планшет с плотностью 3000 клеток на лунку. Через 24 часа контрольную культуральную среду заменяют 100 мкл различных разведений соответствующего клея (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %). Планшеты инкубируют в течение 24, 48 и 72 часов в Инкубатор °C (5%CO2) перед анализом жизнеспособности или гибели клеток.

   2.4.2 Жизнеспособность клеток и анализ клеточного цикла. Первичные культуры фибробластов человека будут получены методом эксплантации из ретромолярной ткани третьих моляров трех взрослых мужчин.

   Линия клеток остеосаркомы человека Saos-2, обычно используемая для оценки биосовместимости между остеобластами и биоматериалами, будет культивироваться, как описано Alcaide et al.60.

   Клетки будут высевать в 96-луночный планшет с плотностью 3000 клеток на лунку. Через 24 часа контрольную культуральную среду заменяют 100 мкл различных разведений соответствующего клея (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %). Планшеты инкубируют в течение 24, 48 и 72 часов в Инкубатор °C (5%CO2) перед анализом жизнеспособности или гибели клеток.

   2.4.3 Количественное определение жизнеспособных, ранних, поздних и некротических клеток с помощью флуоресцентной микроскопии: будет использоваться протокол, описанный Kasibhatla et al. 61. Клетки окрашивают раствором акридинового оранжевого/бромистого этидия (AO/EB) и исследуют с помощью флуоресцентной микроскопии. АО окрашивает как живые, так и мертвые клетки. ЭБ окрашивает только клетки, которые потеряли целостность мембраны. Живые клетки будут равномерно зелеными. Ранние апоптотические клетки окрашиваются в зеленый цвет и содержат ярко-зеленые точки в ядрах вследствие конденсации хроматина и ядерной фрагментации. Клетки с поздним апоптозом также включают бромистый этидий и поэтому окрашиваются в оранжевый цвет, но, в отличие от некротических клеток, клетки с поздним апоптозом будут иметь конденсированные и часто фрагментированные ядра. Некротические клетки окрашиваются в оранжевый цвет, но имеют ядерную морфологию, напоминающую жизнеспособные клетки, без конденсированного хроматина61.

   2.4.4 Обнаружение апоптоза путем воздействия фосфатидилсерина, ступенчатой ​​структуры ДНК и количественного определения апоптотической мРНК и белков: воздействие фосфатидилсерина на внешней поверхности плазматической мембраны будет анализироваться как ранний сигнал апоптоза путем окрашивания аннексином V (A5)-аллофикоцианином (APC), как описано у Alcaide et al60. Флуоресценцию зонда APC будут анализировать с помощью проточной цитометрии.

   Анализ апоптотической ДНК-лестницы будет проводиться с использованием набора ДНК-лестницы (Roche, Германия).

   Уровни мРНК и белков для опухолевых супрессоров (p53), проапоптотических (bax, каспаза 3) и антиапоптотических (bcl-2) медиаторов будут решаться с помощью количественной ПЦР и иммуноблота.

   2.4.5 Оценка аутофагии. Чтобы проверить предполагаемые эффекты НЧ металлов на клеточную аутофагию, будут рассмотрены различные маркеры аутофагии. Аутофагический поток и уровень p62 будут обнаружены с помощью вестерн-блоттинга, а аутофагосомы будут визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии путем подсчета LC3-положительных точек63.

3. Оценка уровней металлопротеазы и/или активности и биосовместимости адгезивных нанокомпозитов in vivo.

   Премоляры, показанные для удаления, будут восстановлены с использованием либо традиционного клея, либо адгезивного нанокомпозита. Через месяц (напомнить по телефону и после клинического осмотра) пациенты будут обследованы, премоляры будут извлечены и проанализированы слепыми оценщиками (кодированные по номерам) на всех этапах, как описано. Удаление премоляров будет проводиться преподавателями стоматологии, любой постпроцедурный эффект будет предполагаться и решаться исследовательской группой, процедуры для пациентов бесплатны, и все будет строго соблюдаться в соответствии с рекомендациями этического комитета факультета. стоматологии Чилийского университета.

   3.1 Оценка адгезивных нанокомпозитов in vivo. Семьдесят добровольцев, которым требуется удаление верхних правых и левых первых премоляров (n = 35 в группе) по ортодонтическим показаниям, будут отобраны из программы ортодонтической специализации в клинике Университета Чили (будут отобраны период набора в течение 3 месяцев с соисследователем, ответственным за мониторинг (CB)). Критериями включения будут (1) планы лечения, указывающие на удаление премоляров по ортодонтическим показаниям, (2) наличие здоровых, интактных, некариозных, нереставрированных и полностью прорезавшихся лечебных зубов и (3) пациенты с хорошо контролируемым состоянием здоровья. которые позволяют выполнять все процедуры в исследовании с минимальным риском. Критериями исключения будут (1) пациенты, которые не согласны добровольно участвовать в исследовании, и (2) пациенты, не соответствующие всем критериям включения. Небольшая окклюзионная препарация будет сделана квалифицированным оператором в центре зуба с использованием цилиндрического алмаза. бор (.63109/018, средняя зернистость (60730025), Dentsply, Нью-Йорк, США) и высокоскоростной наконечник, обеспечивающий распыление воздух-вода со стандартными размерами 3x3x5 мм. После завершения препарирования полости она будет заполнена полимерным композитом (Filtek Supreme; 3M ESPE). Экспериментальные клеи, легированные Cu и Zn, будут использоваться в соответствии с инструкциями производителя, а нелегированный адгезив будет использоваться в качестве контроля гомологичного верхнего премоляра и дизайна путем простой рандомизации параллельных групп. Композит на основе смолы (Filtek Supreme; 3M ESPE) будет наноситься с использованием инкрементной техники, и, наконец, один слой адгезива будет нанесен на поверхность композитной реставрации и полимеризован в течение 10 секунд. Будет проверена окклюзия, а реставрации будут обработаны и отполированы в соответствии с инструкциями производителя. После полировки и окончательной обработки на окончательную реставрацию наносится слой адгезива, который полимеризуется в течение 10 секунд (Raddi Cal, SDI, AU). Через месяц после изготовления реставраций удаляют по одному зубу. Пациент получит инфильтративную и интралигаментарную анестезию (примерно 1,8 мл 2% мепивакаина (36 мг)) с адреналином в соотношении 1:100 000 (18 мг). Затем зубы будут подвергнуты испытаниям.

   3.2 Определение антимикробных свойств поверхности адгезивных нанокомпозитов: Для оценки антибактериальных свойств поверхности легированных адгезивов один последний слой адгезива будет нанесен на конечную поверхность реставрации в модели in vivo. Процедура будет использоваться для оценки количества КОЕ S. Mutans на композитных поверхностях (основной результат). Перед отбором проб биопленки будут подготовлены лотки для нанесения биопленки на реставрации. Для этого применения мы будем использовать одноразовые лотки для нанесения фторидного геля (Deepak Products Inc., Майами, США), каждый из которых будет стерилизоваться в боксе биобезопасности (Esco Technologies Inc., Харборо, США) под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. Затем в каждый лоток загружают 7,5 мл агара TYCSB (казеин, дрожжевой экстракт, L-цистеин, сахароза, бацитрацин) (Difco Laboratories Inc., Детройт, Мичиган, США), который является селективной средой для S. mutans. Впоследствии, чтобы индивидуализировать технику сбора образцов, каппы будут обрезаны так, чтобы в них помещалось не более 3 зубов. Сразу после этого лотки помещают в стерильные чашки Петри и хранят в герметичных пластиковых пакетах в холодильнике. Перед использованием лотки помещают в инкубатор/печь (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Корея) на 24 ч при температуре 37 °C в качестве меры контроля качества. Третий и четвертый операторы будут проводить отбор проб с 11:00 до 13:00, чтобы обеспечить реорганизацию биопленки после утренней чистки. Отбор проб будет выполняться слепым оператором, аккуратно нажимающим на ложку в течение 20 секунд над реставрацией RC, после чего следует гомологичная реставрация RC с медным или легированным цинком адгезивом или без него.

   После того, как лотки с образцами хранятся в стерильных чашках Петри, их транспортируют при 4 °C, а затем инкубируют при 37 °C в микроаэрофильной среде (баночная свеча CO2 10%) в течение 48 часов. Подсчет S.mutans будет выполняться четвертым оператором, который не будет знать, что лоток использовался для печати RC-реставраций. Позже будет проведено окрашивание по Граму для определения микроморфологии колоний. Количество S.mutans будет выражаться в колониеобразующих единицах (КОЕ) S.mutans из чашек и лотков с агаром TYCSB. Отобранные колонии, которые будут совместимы с адгезией и морфологическими характеристиками S.mutans, будут суспендированы в бульоне Тодда-Хьюитта (Difco Laboratories Inc., Детройт, Мичиган, США) и инкубированы при 37 °C в течение 48 часов. Затем колонии будут подвергнуты биохимическим тестам для идентификации вида S. mutans и отличия его от S. sobrinus. Биохимические тесты включают ферментацию рафинозы, ферментацию мелибиозы и тесты на гидролиз эскулина. Положительный результат всех трех тестов указывает на присутствие S. mutans.

   3.3 Для оценки уровней и/или активности металлопротеаз в мацерированной ткани дентина будет использоваться методология, аналогичная описанной в 2.4.2. 3.3.1 Зимография in situ для оценки активности ММП 2 и 9 (результат): метод, описанный Mazzoni et al. 0,65 будет использоваться на 20 (n=5 в группе) недавно удаленных некариозных верхних премолярах человека, восстановленных предыдущей процедурой. После удаления эмали и цемента получаются диски среднего/глубокого коронкового дентина толщиной 1 мм. Исходный раствор меченого флуоресцеином желатина с концентрацией 1,0 мг/мл готовили путем добавления 1,0 мл воды во флаконы с лиофилизированным субстратом и хранения при -20°C до использования. Исходный раствор желатина разбавляют 1:8 буфером для разбавления (NaCl 150 мМ, CaCl2 5 мМ, Трис-HCl 50 мМ, pH 8,0) и добавляют средство против выцветания (Mounting Medium with Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Кембриджшир, Великобритания). 50 мкл смеси флуоресцентного желатина помещают поверх каждой пластины и накрывают покровным стеклом. Предметные стекла защищают от света и инкубируют во влажных камерах при 37°С. Для определения оптимального периода инкубации делают флуоресцентные изображения от 1 часа до 7 дней. Подробное описание 3D-анализа зимографии in situ с конфокальной микроскопией. Вкратце, гидролиз погашенного желатинового субстрата, конъюгированного с флуоресцеином, который свидетельствует об активности эндогенного желатинолитического фермента, оценивали путем исследования под многофотонным конфокальным микроскопом (пример: 488 нм и em: lp530 нм; Zeiss, LSM 780, Carl Zeiss, Oberkochen). , Германия). Оптические срезы толщиной 85 мкм были получены из разных фокальных плоскостей, а сложенные изображения были проанализированы, количественно оценены и обработаны с помощью программного обеспечения ZEN 2010 (Carl Zeiss).

   3.4. Определение биосовместимости. Зубная пульпа будет получена из извлеченных премоляров, и будут рассмотрены молекулярные маркеры жизнеспособности клеток (исходы) или повреждения клеток адгезивными нанокомпозитами.

   Зубная пульпа будет получена, как описано Vaseemuddin66, из извлеченных премоляров. Общая РНК будет разделена, и уровни мРНК специфических маркеров апоптоза и аутофагии будут измерены с помощью количественной ПЦР, как описано ранее (2.4.4-2.4.5).

   3.5 Оценка механических свойств (анализ наноутечки и степени конверсии для оценки стабильности связи (результат)) будет аналогичен методам, указанным в 2.1.

4. Статистический анализ: Статистический анализ будет проводиться с использованием программного обеспечения SPSS 23.0 (IBM, Нью-Йорк, США). Сравнения между количественными переменными (сила связи при микрорастяжении, наноутечка, степень превращения, количество КОЕ) между двумя независимыми группами будут проанализированы с помощью непарного t-критерия, ANOVA и пот-хок-критерия (или соответствующих непараметрических тестов согласно Шапиро-Уилку). тестирование распределения данных). Связи между определениями образцов будут рассчитываться с помощью корреляции Пирсона или Спирмена. Расчет мощности был проведен с использованием данных предыдущего исследования67. Размер выборки с минимум 35 пациентами в группе и в каждой группе исследования был необходим, чтобы найти статистически значимую разницу в окончательном подсчете КОЕ (основной результат), учитывая статистическую мощность 0,8 на основе исследования Вилдосола и исследования64 (1). -β). Значимость будет учитываться, если значение p равно