Wirkung des Einbaus von Kupfer- und Zink-Nanopartikeln in Dentaladhäsive (1170575)

Allgemeines Ziel Bewertung des Einflusses der Einarbeitung von Kupfer- oder Zink-Nanopartikeln in ein Dentaladhäsiv auf dessen antimikrobielle Wirkung und deren Einfluss auf die Aktivität der Dentinmatrix-Metalloproteasen. Analyse der mechanischen Eigenschaften und der Biokompatibilität von Klebstoffen. Spezifische Ziele

1. Entwicklung und strukturelle Charakterisierung eines mit Kupfer- oder Zink-Nanopartikeln dotierten Dentaladhäsivs.

   1.1. Herstellung von haftenden Nanokompositen; 1.2. Strukturelle Charakterisierung von adhäsiven Nanokompositen.

2. Bewertung der mechanischen, biochemischen und funktionellen Wirkungen von adhäsiven Nanokompositen in vitro. Es werden Assays behandelt, bei denen die Zugabe von Kontrolladhäsiv oder das mit Kupfer oder Zink dotierte Adhäsiv auf frisch extrahierten Zähnen verglichen wird (z vivo-Phase) 2.1. Testen der antimikrobiellen Aktivität von Klebstoffen; 2. 2. Untersuchung des Einflusses von adhäsiven Nanokompositen auf den Gehalt und/oder die Aktivität von Matrix-Metalloproteasen;2.3. Bewertung der mechanischen Eigenschaften des Klebstoffs;2.4. Zur Beurteilung der Biokompatibilität. Viabilitätsassays in primär kultivierten gingivalen Fibroblasten werden behandelt.
3. Bewertung der antimikrobiellen Eigenschaften von In-vivo-Modellen (klinische Phase), Matrix-Metalloproteasen und Cathepsin-B-Spiegel und/oder -Aktivität, Biokompatibilität von adhäsiven Nanokompositen in vivo und mechanischen Eigenschaften. Zur Extraktion indizierte Prämolaren werden entweder mit herkömmlichem Adhäsiv oder dem adhäsiven Nanokomposit wiederhergestellt. Nach einem Monat werden die Prämolaren wie beschrieben extrahiert und analysiert.

3.1. Bestimmung der antimikrobiellen Oberflächeneigenschaften von haftenden Nanokompositen; 3.2. Um Matrix-Metalloproteasen und Cathepsin B-Spiegel und/oder -Aktivität in mazeriertem Dentingewebe zu bewerten;3.3 Zur Bestimmung der Biokompatibilität. Zahnpulpa wird aus extrahierten Prämolaren gewonnen, und molekulare Marker der Zelllebensfähigkeit oder Zellschädigung werden von adhäsiven Nanokomposite adressiert;3.4 Bewertung der mechanischen Eigenschaften von Klebstoffen.

METHODEN

1. Entwicklung eines mit Kupfer- oder Zink-Nanopartikeln dotierten Dentalklebers. 1.1. Herstellung von adhäsiven Nanokompositen (1): CuNP/adhäsive Nanokomposite werden unter Verwendung des Einflaschen-Adhäsivsystems Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE) hergestellt. Dieser Klebstoff auf Acetonbasis enthält eine Mischung aus Urethandimethacrylat und dem sauren Monomer Dipentaerythritolpentaacrylatmonophosphat. Zur Herstellung der haftenden Nanokomposite werden geeignete Mengen an Nanopartikelpulver (CuNp und ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chile) abgewogen und unter konstantem magnetischem Rühren direkt in die Klebstoffflasche gegeben. Die Suspension wird dann in einem Ultraschallbad bei 37°C für 10 Minuten weiter dispergiert. Adhäsive Nanokomposite werden gemäß früheren Daten aus unseren Labors mit einem CuNP-Gehalt im Bereich von 0,015 bis 0,045 Gew.-% hergestellt. Die fünf Konzentrationen von Cu- und Zn-dotierten Klebstoffen betragen 0,0150 %, 0,0075 % und 0,00038 % (Konzentrationen mit antibakteriell wirksamen Eigenschaften basierend auf unseren früheren Daten (Cu 1-2-3 und Zn 1-2-3).

   1.2. Strukturelle Charakterisierung von haftenden Nanokompositen (1): Morphologie und Zusammensetzung der haftenden Nanokompositmaterialien werden durch SEM-EDX im Rückstreuelektronenmodus zur Erzeugung von Phasenkontrast und AFM-Mikroskopie charakterisiert. Die chemische Struktur der Polymermatrix und Restmonomergehalte werden durch abgeschwächte Totalreflexions-Fourier-Transformations-Infrarot- und Raman-Spektroskopie analysiert. Das Restmonomer wird unter Berücksichtigung der Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Doppelbindungsschwingung des Acrylmonomers im Bereich von 1684 - 1636 cm-1 analysiert.

2. Bewertung der antibakteriellen, mechanischen, biochemischen und funktionellen Wirkungen von adhäsiven Nanokompositen in vitro und ex vivo. Es werden Assays behandelt, bei denen die Zugabe von regulärem Klebstoff oder dem mit Kupfer oder Zink dotierten Klebstoff verglichen wird.

   2.1. Untersuchung der antimikrobiellen Eigenschaften von Klebstoff-Nanokompositen (2) 2.1.1 Antibakterielle Aktivität: Kurz gesagt, 10-mm-Scheiben mit einer Dicke von 2 mm werden unter Verwendung eines Harzverbundstoffs (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) hergestellt und entweder unbeschichtet belassen (Kontrolle) oder mit dem Klebstoff Prime&Bond 2.1 und einem gleichwertigen Experiment beschichtet Adhäsivmischungen aus zwölf Gruppen gemischt und gemäß den Empfehlungen des Herstellers für 10 Sekunden unter Verwendung eines LED-Lichthärtungsgeräts (Radii Cal, SDI, AU) bei einer Leistungsdichte von 1000 mW/cm2 polymerisiert. Amalgamscheiben (Contour; Kerr, Orange, CA) werden wie zuvor beschrieben hergestellt und als zusätzliche positive Kontrolle verwendet. Insgesamt vierzehn Studiengruppen mit acht Proben pro Gruppe werden in diesem Teil des Experiments bewertet: (1) Kontrolle; (2) Amalgam (metallisches Material, das als positive Kontrolle verwendet wird) und 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3, 6) Zn1, 7) Zn2 und 8) Zn3. Um sicherzustellen, dass unpolymerisiertes Monomer entfernt wird, werden die Scheiben in 10 ml steriles entionisiertes Wasser getaucht und 2 Stunden lang bei 200 U/min und 37,8 °C geschüttelt, wonach die Scheiben bei Raumtemperatur mindestens 24 Stunden lang trocknen gelassen werden. Die Blättchen werden durch 10-minütige Inkubation in 70 % Ethanol sterilisiert und anschließend mindestens 48 Stunden lang aseptisch getrocknet. Die Oberfläche jeder Scheibe wird mit 100 ml einer definierten lebensfähigen Konzentration von 1 108 Zellen/ml anaerob gezüchtetem Streptococcus mutans, ATCC1 25175 in Hirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) inokuliert . Um die Konzentration lebensfähiger Zellen für jede Behandlungsgruppe in koloniebildenden Einheiten pro ml (CFU/ml) zu bestimmen, werden die inokulierten Scheiben anaerob behandelt, wonach die Gesamtzahl der gewonnenen CFUs bestimmt wird.

   2.2. In-vitro- und ex-vivo-Evaluierung der MMP-Aktivität (1-2) 2.2.1 MMP-Aktivitätsinhibitionsassay (in vitro): Die quantitative MMP-2-, MMP-8- und MMP-9-Aktivität in vitro wird durch einen kommerziellen MMP-Fluorometrischen Assay bestimmt Kits (SensoLyte Assay Kits; AnaSpec, San Jose, CA, USA) zum Screenen der Anti-MMP-Aktivität. Cu- und ZnNP-dotierte Klebstoffe in unterschiedlichen Konzentrationen und Kontrollen ohne Cu- oder ZnNP-Kleber werden dem Reaktionspuffer zugesetzt, und der Assay wird gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Nach Spaltung in 2 getrennte Fragmente durch MMP wird die Fluoreszenz von 5-FAM durch ein fluoreszierendes Mikroplatten-Lesegerät (Sinergy TM ) überwacht.

   2.2.2 Bestimmung der MMP-Aktivität und -Spiegel (Ex-vivo-Dentinproben mit Proben von restaurierten Zähnen mit dotierten Adhäsiven und Kontrolle): Fünfundzwanzig (n=5) extrahierte kariesfreie menschliche dritte Molaren werden nach Aufklärung der Patienten entnommen Zustimmung. Die Zähne werden mit 0,5 % Chloramin desinfiziert, in destilliertem Wasser gelagert und innerhalb von sechs Monaten nach der Extraktion verwendet. Eine kleine okklusale Präparation mit standardisierten Abmessungen von 3 x 3 x 5 mm wird von einem kalibrierten Bediener in der Mitte des Zahns mit einem zylindrischen Diamantbohrer (109/018, mittlere Körnung (60730025), Dentsply, NY, USA) und einer Hochgeschwindigkeitsschleifmaschine durchgeführt Handstück, während Luft-Wasser-Spray bereitgestellt wird. Nach Abschluss der Kavitätenpräparation wird diese mit Kunststoffkomposit (Filtek Supreme; 3M ESPE) gefüllt. Die mit Cu und Zn dotierten experimentellen Adhäsive werden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, und das nicht dotierte Adhäsiv wird als Kontrolle an einem homologen oberen Prämolaren verwendet. Das Harzkomposit (Filtek Supreme; 3M ESPE) wird in der Inkrementtechnik aufgetragen. Der Zahnschmelz wird mit einer langsam laufenden Diamantsäge (Remet, Bologna, Italien) unter Kochsalzspülung vollständig entfernt, und die Zähne werden zerschnitten, um 1 mm dicke koronale Dentinwafer zu erhalten, die anschließend mit a zu Pulver pulverisiert werden Stahlhammer. Das Dentinpulver wird dann in einer der folgenden Wasserlösungen gleichmäßig verteilt und demineralisiert (bei 4°C für 24 Stunden unter Rühren): (1) 0,87 M Essigsäure, pH = 2,3; (2) 0,26 M Citronensäure, pH = 2,3; oder (3) 0,5 M EDTA, pH = 6,4; oder (4) 0,5 M EGTA, pH = 6,4. Die Enzymextraktion des demineralisierten Dentinpulvers wird in Extraktionspuffer suspendiert (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, enthält 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2, 0,02 % NaN3) und EDTA-freiem Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Die Proben werden dann bei 40 W Ausgangsleistung für 3 Bursts von jeweils 10 Sekunden bei 4°C ultraschallbehandelt (Ultraschall-Flüssigkeitsprozessor Sonicator, Modell W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA). Die Fläschchen werden bei 18.000 U/min für 30 min bei 4°C zentrifugiert und die Überstände werden gesammelt. Alle in den Überständen vorhandenen Proteine ​​werden bei 4°C durch Zugabe von pulverförmigem Ammoniumsulfat (w/v) ausgefällt, um eine Endkonzentration von 85 % und einen pH-Wert von 7,0 zu erreichen. Das Präzipitat wird durch 30-minütige Zentrifugation bei 24.000 U/min bei 4 °C gesammelt, in einer 10-fachen Verdünnung in Extraktionspuffer wieder aufgelöst, über Nacht durch eine 30-kDa-Membran gegen Extraktionspuffer dialysiert und bis zur Analyse bei 4 °C gelagert. Danach wird das Dentinpulver analysiert, um die Aktivitätsniveaus von MMP-2, MMP-9 und Cathepsin B, gemessen durch Gelatine-Zymographie, und MMP-8 durch Kollagen-Zymographie, wie zuvor beschrieben, zu bestimmen.56 Densitometrie wird als du ausgedrückt (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA). Kurz gesagt werden Dentinpulverproben einer Elektrophorese unter nicht reduzierenden denaturierenden Bedingungen in SDS/PAGE-Gelen unterzogen, die 1 mg/ml Gelatine oder 0,1 mg/ml Kollagen als Substrate enthalten. Sie werden dann zweimal in 2,5 % Triton X-100 eingeweicht und für 17 h in Entwicklungspuffer (20 mM Tris pH 7,4 und 5 mM CaCl2) inkubiert, mit Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt und mit 10 % Essigsäure entfärbt 20%ige Methanollösung. Die Spiegel von MMP-2, MMP-8, MMP-9, Cathepsin B und ICTP (als Marker für die Hydrolyse von Dentinkollagen) werden entweder mit einem kommerziellen ELISA-Kit oder Multiplex-Immunoassays (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, für Luminex-Technologie) gemäß den Empfehlungen des Herstellers.

   2.3. Prüfung der mechanischen Eigenschaften von adhäsiven Nanokompositen (1-2) Haftfestigkeit 2.3.1 Zahnauswahl und Präparation: Siebzig extrahierte kariesfreie menschliche dritte Molaren werden gesammelt, nachdem die Einwilligung der Patienten von der Zahnklinik der Universität von Chile (≈2000 3 Molarenextraktionen pro Jahr, um die Verfügbarkeit dieser Zähne zu gewährleisten, die normalerweise entsorgt werden). Die Zähne werden mit 0,5 % Chloramin desinfiziert, in destilliertem Wasser gelagert und innerhalb von sechs Monaten nach der Extraktion verwendet. Nach dem Nassschleifen des okklusalen Schmelzes mit einem #180 SiC-Papier wird eine flache Dentinoberfläche freigelegt. Die freigelegten Dentinoberflächen werden mit einem nassen #600 SiC-Papier 60 Sekunden lang weiter poliert, um die Schmierschicht zu standardisieren.

   2.3.2 Experimentelles Design: Die Zähne werden zufällig in zwölf Fünfergruppen (6 Gruppen pro Adhäsiv) eingeteilt, die jeweils mit einer unterschiedlichen Konzentration an dotiertem Adhäsiv behandelt werden. Als Kontrolle ohne NPs des Systems Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE) verwendet werden.

   2.3.3. Restauratives Vorgehen und Probenpräparation: Die Adhäsivsysteme werden streng nach den Angaben des jeweiligen Herstellers appliziert.

   2.3.4 Nach dem Klebeverfahren: Alle Zähne erhalten eine Mikro-Hybrid-Kompositrestauration in zwei Inkrementen von 2 mm. Jedes Inkrement wird 40 Sekunden lang mit einem LED-Lichthärtungsgerät bei einer Einstellung von 1200 mW/cm2 (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australien) lichtpolymerisiert. Restaurierte Zähne werden 24 Stunden lang in destilliertem Wasser bei 37 °C gelagert und dann mit einer langsam laufenden Diamantsäge (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL), um 15 bis 20 Harz-Dentin-Stäbe zu erhalten, jeder mit einer Querschnittsfläche von etwa 0,8 mm2, gemessen mit einem digitalen Messschieber (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokio, Japan). Jede Probe von jedem Zahn wird auf Mikrozugfestigkeit bewertet Festigkeit (mTBS) mit Ausnahme von sechs zufällig ausgewählten Harz-Dentin-gebundenen Proben, die zur Messung des In-situ-Umwandlungsgrads (DC) und der Nanoleakage (NL) geteilt werden.

   2.3.5. Mikrozug-Haftfestigkeitstest: Harz-Dentin-gebundene Stifte werden mit Cyanacrylat-Klebstoff an einer Geraldeli-Halterung befestigt und unter Zug (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brasilien) bei 0,5 mm/min bis zum Versagen getestet. Die mTBS-Werte werden berechnet, indem die Bruchlast durch die Querschnittsverbindungsfläche dividiert wird. Der Versagensmodus der Proben wird als kohäsiv (Versagen ausschließlich innerhalb des Dentins oder Harzverbundstoffs), adhäsiv (Versagen an der Grenzfläche Harz/Dentin) oder gemischt (Versagen an der Grenzfläche Harz/Dentin einschließlich kohäsives Versagen der benachbarten Substrate) klassifiziert ). Die Klassifizierung wird unter einem Stereomikroskop (SZ40; Olympus, Tokio, Japan) bei 100-facher Vergrößerung durchgeführt. Proben mit vorzeitigem Versagen (PFs) werden in den Mittelwert aufgenommen.

   2.3.6. Umwandlungsgrad in situ: Drei kunstharz-dentingebundene Sticks von jedem Zahn werden mit #1500, #2000 und #2500 SiC-Papier nass poliert. Sie werden dann 20 Minuten lang mit Ultraschall gereinigt und 24 Stunden lang in Wasser bei 37,8 °C gelagert, bevor DC gemessen wird. Die Mikro-Raman-Spektroskopie-Analyse wird mit Geräten von Senterra (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Württemberg, Deutschland) durchgeführt. Die Kalibrierung des Mikro-Raman-Spektrometers wird durchgeführt, indem es auf Null zurückgesetzt wird und dann der Koeffizient einer Siliziumprobe gemessen wird. Die Proben werden unter Verwendung der folgenden Mikro-Raman-Parameter analysiert: 20 mW Neonlaser bei 532 nm, räumliche Auflösung bei 3 mm, spektrale Auflösung bei 5 cm-1, Anreicherungszeit bei 30 Sekunden mit 6 Co-Zugaben und Vergrößerung bei 110x ( Olympus UK, London, UK) auf einen Strahldurchmesser von 1 mm. Spektren werden an der Dentin-Adhäsiv-Grenzfläche an drei verschiedenen Stellen innerhalb des intertubulären Dentins für jeden harz-dentingebundenen Stick aufgenommen. Als Referenzen werden Spektren unpolymerisierter Klebstoffe verwendet. Die Nachbearbeitung der Spektren erfolgt mit der dedizierten Opus Spectroscopy Software Version 6.5. Das Verhältnis des Doppelbindungsgehalts von Monomer zu Polymer im Klebstoff wird berechnet: wobei „R“ das Verhältnis der aliphatischen und aromatischen Peakflächen bei 1639 cm-1 und 1609 cm-1 in polymerisierten und unpolymerisierten Klebstoffen ist. Für statistische Zwecke wird der in situ DC aller Kunststoff-Dentin-Stifte desselben Zahns gemittelt.

   2.3.7. Bewertung der Nanoleakage: Drei harzgebundene Stäbchen von jedem Zahn werden in ammoniakalisches Silbernitrat gelegt, das gemäß dem von Tay et al.57 beschriebenen Protokoll hergestellt wurde, und 24 Stunden lang im Dunkeln gelagert. Sie werden dann gründlich mit destilliertem Wasser gespült und 8 Stunden lang unter fluoreszierendem Licht in eine Fotoentwicklungslösung getaucht, um Silberionen in den Hohlräumen entlang der gebondeten Grenzfläche zu metallischen Silberkörnern zu reduzieren. Die Proben werden mit SiC-Papier Nr. 600, Nr. 1000, Nr. 1200, Nr. 1500, Nr. 2000 und Nr. 2500 und mit 1- und 0,25-mm-Diamantpaste (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) unter Verwendung von a Poliertuch. Sie werden ultraschallgereinigt, luftgetrocknet, auf Stubs montiert und mit Karbongold beschichtet (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). Harz-Dentin-Grenzflächen werden in einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop analysiert, das im Rückstreumodus betrieben wird (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, UK). Von jedem Harz-Dentin-Bonding-Stick werden drei Bilder aufgenommen. Der relative NL-Anteil in den Klebstoff- und Hybridschichten in jeder Probe wird in allen Bildern unter Verwendung der Image J-Software58 von einem verblindeten Forscher gemessen. Die Werte derselben Probe werden gemittelt, und der mittlere NL aller Stäbchen desselben Zahns ist durchschnittlich.

   2.4 Bewertung der Biokompatibilität, Lebensfähigkeitsassays in primär kultivierten gingivalen Fibroblasten 2.4.1 Zellkulturen: Primärkulturen menschlicher Fibroblasten werden durch die Explantationsmethode aus dem retromolaren Gewebe der dritten Molaren von drei männlichen erwachsenen Individuen erhalten.

   Die humane Saos-2-Osteosarkom-Zelllinie, die üblicherweise zur Beurteilung der Biokompatibilität zwischen Osteoblasten und Biomaterialien verwendet wird, wird wie von Alcaide et al.60 beschrieben kultiviert.

   Die Zellen werden in einer Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 3000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach 24 h wird das Kontrollkulturmedium durch 100 µl verschiedener Verdünnungen des richtigen Klebstoffs (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %) ersetzt °C Inkubator (5 % CO2) vor Lebensfähigkeits- oder Zelltod-Assays.

   2.4.2 Zellviabilitäts- und Zellzyklusanalyse: Primärkulturen menschlicher Fibroblasten werden durch die Explantatmethode aus dem retromolaren Gewebe der dritten Backenzähne von drei männlichen erwachsenen Individuen gewonnen.

   Die humane Saos-2-Osteosarkom-Zelllinie, die üblicherweise zur Beurteilung der Biokompatibilität zwischen Osteoblasten und Biomaterialien verwendet wird, wird wie von Alcaide et al.60 beschrieben kultiviert.

   Die Zellen werden in einer Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 3000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach 24 h wird das Kontrollkulturmedium durch 100 µl verschiedener Verdünnungen des richtigen Klebstoffs (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %) ersetzt °C Inkubator (5 % CO2) vor Lebensfähigkeits- oder Zelltod-Assays.

   2.4.3 Quantifizierung lebensfähiger, früh apoptotischer, spät apoptotischer und nekrotischer Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie: Es wird das von Kasibhatla et al. beschriebene Protokoll verwendet 61. Die Zellen werden mit einer Acridinorange/Ethidiumbromid-Lösung (AO/EB) gefärbt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht. AO färbt sowohl lebende als auch tote Zellen. EB färbt nur Zellen, die die Membranintegrität verloren haben. Lebende Zellen erscheinen einheitlich grün. Frühe apoptotische Zellen färben sich grün und enthalten hellgrüne Punkte in den Kernen als Folge von Chromatinkondensation und Kernfragmentierung. Spät apoptotische Zellen enthalten auch Ethidiumbromid und färben sich daher orange, aber im Gegensatz zu nekrotischen Zellen zeigen die spät apoptotischen Zellen kondensierte und oft fragmentierte Kerne. Nekrotische Zellen färben sich orange, haben aber eine Kernmorphologie, die der von lebensfähigen Zellen ähnelt, ohne kondensiertes Chromatin61.

   2.4.4 Nachweis von Apoptose durch Phosphatidylserin-Exposition, DNA-Laddering und apoptotische mRNA- und Proteinquantifizierung: Die Exposition von Phosphatidylserin auf der äußeren Oberfläche der Plasmamembran wird als frühes Signal der Apoptose durch Färbung mit Annexin V (A5)-Allophycocyanin (APC) analysiert. wie in Alcaide et al.60 beschrieben. Die Fluoreszenz der Sonden-APC wird durch Durchflusszytometrie analysiert.

   Der apoptotische DNA-Leiter-Assay wird unter Verwendung eines DNA-Leiter-Kits (Roche, Deutschland) durchgeführt.

   mRNA- und Proteinspiegel für Tumorsuppressor- (p53), pro-apoptotische (bax, caspase 3) und anti-apoptotische (bcl-2) Mediatoren werden mittels quantitativer PCR und Immunoblot untersucht.

   2.4.5 Bewertung der Autophagie: Um mutmaßliche Effekte von Metall-NPs auf die Zellautophagie zu testen, werden verschiedene Autophagiemarker untersucht. Autophagischer Fluss und p62-Spiegel werden durch Western Blot nachgewiesen, und Autophagosomen werden durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, indem LC3-positive Puncta63 gezählt werden.

3. Bewertung von Metalloproteasespiegeln und/oder Aktivität und Biokompatibilität von adhäsiven Nanokomposite in vivo.

   Zur Extraktion indizierte Prämolaren werden entweder mit herkömmlichem Adhäsiv oder dem adhäsiven Nanokomposit wiederhergestellt. Nach einem Monat (Rückruf durch telefonischen Kontakt und nach der klinischen Untersuchung) werden die Patienten untersucht und die Prämolaren werden extrahiert und von blinden Gutachtern (codiert durch Nummern) in allen Stadien wie beschrieben analysiert. Extraktionen von Prämolaren werden von Zahnmedizinlehrern durchgeführt, alle Auswirkungen nach dem Eingriff werden vom Forschungsteam übernommen und gelöst, Verfahren für Patienten sind kostenlos und alles wird streng nach den Empfehlungen der Ethikkommission der Fakultät befolgt der Zahnmedizin der Universität von Chile.

   3.1 In-vivo-Bewertung von adhäsiven Nanokompositen: Siebzig Freiwillige, die aus kieferorthopädischen Gründen eine Extraktion des oberen rechten und linken ersten Prämolaren (n = 35 pro Gruppe) benötigen, werden aus dem kieferorthopädischen Spezialisierungsprogramm in der Klinik der Universität von Chile ausgewählt (dort wird ein Rekrutierungszeitraum von 3 Monaten mit einem für die Überwachung verantwortlichen Prüfarzt (CB) sein). Einschlusskriterien sind (1) Behandlungspläne, die Prämolarenextraktionen aus kieferorthopädischen Gründen angeben, (2) Vorhandensein gesunder, intakter, nicht kariöser, nicht restaurierter und vollständig durchgebrochener Behandlungszähne und (3) Patienten mit gut kontrolliertem Gesundheitszustand die es ermöglichen, alle Eingriffe in der Forschung mit minimalem Risiko durchzuführen. Ausschlusskriterien sind (1) Patienten, die der Teilnahme an der Studie nicht zustimmen, und (2) Patienten, die nicht alle Einschlusskriterien erfüllen. Eine kleine okklusale Präparation wird von einem kalibrierten Bediener in der Mitte des Zahns mit einem Zylinderdiamanten vorgenommen Bohrer (.63109/018, mittlere Körnung (60730025), Dentsply, NY, USA) und ein Hochgeschwindigkeits-Handstück, während ein Luft-Wasser-Spray mit standardisierten Abmessungen von 3 x 3 x 5 mm bereitgestellt wird. Nach Abschluss der Kavitätenpräparation wird diese mit Kunststoffkomposit (Filtek Supreme; 3M ESPE) gefüllt. Die mit Cu und Zn dotierten experimentellen Adhäsive werden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, und das nicht dotierte Adhäsiv wird als Kontrolle auf dem homologen oberen Prämolaren und Design durch einfache Randomisierung paralleler Gruppen verwendet. Das Harzkomposit (Filtek Supreme; 3M ESPE) wird mit der inkrementellen Technik aufgetragen, und schließlich wird eine Adhäsivschicht als Oberfläche der Kompositrestauration aufgetragen und 10 Sekunden lang polymerisiert. Die Okklusion wird überprüft und die Restaurationen werden nach Herstellerangaben ausgearbeitet und poliert. Anschließend wird durch Polieren und Endfinish eine Adhäsivschicht auf die endgültige Restauration aufgetragen, die 10 Sekunden lang polymerisiert wird (Raddi Cal, SDI, AU). Einen Monat nach der Herstellung der Restaurationen wird jeweils ein Zahn extrahiert. Der Patient erhält eine infiltrative und intraligamentäre Anästhesie (ca. 1,8 ml 2 % Mepivacain (36 mg)) mit Epinephrin in einem Verhältnis von 1:100.000 (18 mg). Dann werden die Zähne Tests unterzogen.

   3.2 Bestimmung der antimikrobiellen Oberflächeneigenschaften von Adhäsiv-Nanokompositen: Um die antibakteriellen Oberflächeneigenschaften von dotierten Adhäsiven zu bewerten, wird eine letzte Adhäsivschicht über die endgültige Oberfläche von Restaurationen in einem In-vivo-Modell aufgetragen. Das Verfahren wird verwendet, um die Anzahl der CFU von S.Mutans auf zusammengesetzten Oberflächen zu bestimmen (Hauptergebnis). Vor der Probenahme des Biofilms werden Schalen vorbereitet, um den Biofilm über die Restaurationen zu drucken. Für diese Anwendung verwenden wir Einweg-Fluoridgel-Auftragsschalen (Deepak Products Inc., Miami, USA), die jeweils 30 Minuten lang in einer Biosicherheitshaube (Esco Technologies Inc., Harboro, USA) unter UV-Licht sterilisiert werden. Jede Platte wird dann mit 7,5 ml TYCSB-Agar (Casein, Hefeextrakt, L-Cystein, Saccharose, Bacitracin) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) beschickt, das ein selektives Medium für S. mutans ist. Anschließend werden die Löffel zur Individualisierung der Probenentnahmetechnik auf maximal 3 Zähne zugeschnitten. Unmittelbar danach werden die Schalen in sterile Petrischalen gestellt und in verschlossenen Plastikbeuteln im Kühlschrank gelagert. Zur Qualitätskontrolle werden die Schalen vor der Verwendung für 24 h bei 37 °C in einen Inkubator/Ofen (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Korea) gestellt. Der dritte und vierte Bediener führen die Probenahme durch, die zwischen 11:00 und 13:00 Uhr durchgeführt wird, um eine Reorganisation des Biofilms nach dem morgendlichen Bürsten zu ermöglichen. Die Probenahme wird von einem blinden Bediener durchgeführt, der den Löffel 20 Sekunden lang sanft über die RC-Restauration drückt, gefolgt von einer homologen RC-Restauration mit und ohne Cu- oder Zn-dotiertem Adhäsiv.

   Nachdem die Probenschalen in sterilen Petrischalen gelagert wurden, werden sie bei 4 °C transportiert und dann bei 37 °C in einem Mikroaerophilen (Glaskerze CO2 10%) für 48 h inkubiert. Die Zählung von S. mutans wird vom vierten Bediener durchgeführt, der nicht weiß, dass das Tablett zum Drucken der RC-Restaurationen verwendet wurde. Später wird eine Gram-Färbung durchgeführt, um die Mikromorphologie der Kolonien zu bestimmen. Die S.mutans-Zählung wird in koloniebildenden Einheiten (CFU) von S.mutans von den Platten und Schalen mit dem TYCSB-Agar ausgedrückt. Ausgewählte Kolonien, die mit der Adhäsion und den morphologischen Merkmalen von S. mutans kompatibel sind, werden in Todd-Hewitt-Bouillon (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) suspendiert und 48 h bei 37 °C inkubiert. Die Kolonien werden dann biochemischen Tests unterzogen, um die Spezies von S. mutans zu identifizieren und sie von S. sobrinus zu unterscheiden. Die biochemischen Tests umfassen Raffinose-Fermentation, Melibiose-Fermentation und Esculin-Hydrolyse-Tests. Ein positives Ergebnis für alle drei Tests weist auf das Vorhandensein von S. mutans hin.

   3.3 Zur Bewertung der Metalloproteasespiegel und/oder -aktivität in mazeriertem Dentingewebe wird eine ähnliche Methodik wie in 2.4.2 verwendet. 3.3.1 Zymographie zur In-situ-Bewertung der Aktivitäten der MMPs 2 und 9 (Ergebnis): Eine von Mazzoni et al .65 wird an 20 (n=5 pro Gruppe) frisch extrahierten, nicht kariösen menschlichen oberen Prämolaren verwendet, die durch ein vorheriges Verfahren wiederhergestellt wurden. Nach Entfernung von Schmelz und Zement erhält man 1 mm dicke Scheiben aus mittlerem/tiefem koronalen Dentin. Eine 1,0-mg/ml-Stammlösung von Fluorescein-markierter Gelatine wurde hergestellt, indem 1,0 ml Wasser zu den das lyophilisierte Substrat enthaltenden Fläschchen gegeben und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert wurde. Die Gelatine-Stammlösung wird 1:8 mit dem Verdünnungspuffer (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) verdünnt und mit einem Antifadingmittel versetzt (Mounting Medium mit Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, Vereinigtes Königreich). Eine 50-μl-Menge der fluoreszierenden Gelatinemischung wird oben auf jede Platte gegeben und mit einem Deckglas bedeckt. Objektträger werden lichtgeschützt und in befeuchteten Kammern bei 37°C inkubiert. Zur Identifizierung der optimalen Inkubationszeit werden Fluoreszenzbilder von 1 Stunde bis 7 Tagen aufgenommen. Ausführliche Beschreibung der 3D-Analyse der In-situ-Zymographie mit konfokaler Mikroskopie. Kurz gesagt, die Hydrolyse von gequenchtem Fluorescein-konjugiertem Gelatinesubstrat, die auf eine endogene gelatinolytische Enzymaktivität hinweist, wurde durch Untersuchung unter einem konfokalen Mehrphotonenmikroskop (ex: 488 nm und em: 1p530 nm; Zeiss, LSM 780, Carl Zeiss, Oberkochen) bewertet , Deutschland). Optische Schnitte mit einer Dicke von 85 μm wurden aus verschiedenen Fokusebenen aufgenommen, und die gestapelten Bilder wurden mit der ZEN 2010-Software (Carl Zeiss) analysiert, quantifiziert und verarbeitet.

   3.4. Bestimmung der Biokompatibilität. Zahnpulpa wird aus extrahierten Prämolaren gewonnen, und molekulare Marker der Zelllebensfähigkeit (Ergebnisse) oder Zellschädigung durch adhäsive Nanokomposite werden untersucht.

   Zahnpulpa wird, wie von Vaseemuddin66 beschrieben, aus extrahierten Prämolaren gewonnen. Die Gesamt-RNA wird getrennt und die mRNA-Spiegel spezifischer Apoptose- und Autophagie-Marker werden durch qPCR gemessen, wie zuvor beschrieben (2.4.4-2.4.5).

   3.5 Die Bewertung der mechanischen Eigenschaften (Nanoleckage- und Gradumwandlungsanalyse zur Bewertung der Bindungsstabilitäten (Ergebnis)) entspricht den Methoden in 2.1

4. Statistische Analyse: Die statistische Analyse wird mit der Software SPSS 23.0 (IBM, New York, NY, USA) durchgeführt. Vergleiche zwischen quantitativen Variablen (Mikrozugfestigkeit, Nanoleakage, Umwandlungsgrad, CFU-Zahl) zwischen zwei unabhängigen Gruppen werden durch ungepaarten t-Test, ANOVA und Pots-hoc-Test (oder entsprechende nicht-parametrische Tests nach Shapiro-Wilk) analysiert Testen der Datenverteilung). Assoziationen zwischen Probenbestimmungen werden durch Korrelation nach Pearson oder Spearman berechnet. Anhand von Daten aus einer früheren Studie67 wurde eine Leistungsberechnung durchgeführt. Eine Stichprobengröße von mindestens 35 Patienten pro Gruppe und pro Studienarm war erforderlich, um einen Unterschied mit statistischer Signifikanz in einer endgültigen CFU-Zählung (Hauptergebnis) zu finden, unter Berücksichtigung einer statistischen Aussagekraft von 0,8, basierend auf einer Studie von Vildosola et al -β). Signifikanz wird berücksichtigt, wenn der p-Wert ist