Efeito da Incorporação de Nanopartículas de Cobre e Zinco em Adesivos Dentários (1170575)

Objetivo Geral Avaliar a influência da incorporação de nanopartículas de cobre ou zinco em um adesivo odontológico sobre sua ação antimicrobiana e sua influência na atividade das metaloproteases da matriz dentinária. Analisar propriedades mecânicas adesivas e biocompatibilidade Objetivos Específicos

1. Desenvolver e caracterizar estruturalmente um adesivo dentário dopado com nanopartículas de cobre ou zinco.

   1.1. Preparação de nanocompósitos adesivos; 1.2. Caracterização estrutural de nanocompósitos adesivos.

2. Avaliar efeitos mecânicos, bioquímicos e funcionais de nanocompósitos adesivos in vitro. Os ensaios serão abordados comparando a adição de adesivo de controle ou o adesivo dopado com cobre ou zinco em dentes frescos extraídos recentemente. (ex. fase viva) 2.1. Testar a atividade antimicrobiana do adesivo; 2. 2. Estudar a influência de nanocompósitos adesivos nos níveis e/ou atividade das metaloproteases da matriz;2.3. Avaliar as propriedades mecânicas do adesivo;2.4. Para avaliar a biocompatibilidade. Ensaios de viabilidade em fibroblastos gengivais em cultura primária serão abordados.
3. Avaliar as propriedades antimicrobianas do modelo in vivo (fase clínica), os níveis e/ou atividade das metaloproteases da matriz e catepsina B, a biocompatibilidade de nanocompósitos adesivos in vivo e as propriedades mecânicas. Os pré-molares indicados para extração serão restaurados com adesivo tradicional ou nanocompósito adesivo. Após um mês, os pré-molares serão extraídos e analisados ​​conforme descrito.

3.1. Determinar propriedades antimicrobianas de superfície de nanocompósitos adesivos; 3.2. Avaliar os níveis e/ou atividade das metaloproteases da matriz e catepsina B em tecido dentinário macerado;3.3 Para determinar a biocompatibilidade. A polpa dentária será obtida a partir de pré-molares extraídos, e serão abordados marcadores moleculares de viabilidade celular ou dano celular de nanocompósitos adesivos;3.4 Avaliar as propriedades mecânicas do adesivo.

MÉTODOS

1. Desenvolver um adesivo odontológico dopado com nanopartículas de cobre ou zinco. 1.1. Preparação de nanocompósitos adesivos (1): Os nanocompósitos CuNP/adesivos serão preparados usando o sistema adesivo de frasco único Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Este adesivo à base de acetona contém uma mistura de uretano dimetacrilato e monômero ácido dipentaeritritolpentaacrilatomonofosfato. Para preparar os nanocompósitos adesivos, quantidades apropriadas de pó de nanopartículas (CuNp e ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chile) serão pesadas e adicionadas diretamente ao frasco do adesivo sob agitação magnética constante. A suspensão será então dispersada em um banho ultrassônico a 37°C por 10 minutos. Nanocompósitos adesivos serão preparados com teores de CuNP na faixa de 0,015 a 0,045% em peso de acordo com dados anteriores de nossos laboratórios. As cinco concentrações de adesivos dopados com Cu e Zn serão 0,0150%, 0,0075% e 0,00038% (concentrações com propriedades ativas antibacterianas baseadas em nossos dados anteriores (Cu 1-2-3 e Zn 1-2-3).

   1.2. Caracterização estrutural de nanocompósitos adesivos (1): A morfologia e composição dos materiais adesivos nanocompósitos serão caracterizadas por SEM-EDX no modo elétron retroespalhado para produção de contraste de fase e microscopia AFM. A estrutura química da matriz polimérica e o teor de monômeros residuais serão analisados ​​por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier atenuada e espectroscopia de Raman. O monômero residual será analisado considerando a vibração da dupla ligação carbono-carbono do monômero acrílico na faixa de 1684 - 1636 cm-1.

2. Avaliar os efeitos antibacterianos, mecânicos, bioquímicos e funcionais de nanocompósitos adesivos in vitro e ex vivo. Ensaios serão abordados comparando a adição de adesivo comum, ou o adesivo dopado com cobre ou zinco.

   2.1. Avaliação das propriedades antimicrobianas do nanocompósito adesivo (2) 2.1.1 Atividade antibacteriana: Resumidamente, discos de 10 mm de espessura de 2 mm serão fabricados usando resina composta (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) e deixados sem revestimento (controle) ou revestidos com o adesivo Prime&Bond 2.1, e experimental equivalente misturas adesivas de doze grupos e polimerizadas de acordo com as recomendações dos fabricantes por 10 segundos usando uma unidade de fotopolimerização LED (Radii Cal,SDI,AU) a uma densidade de potência de 1000 mW/cm2. Discos de amálgama (Contour; Kerr, Orange, CA) serão fabricados conforme descrito anteriormente e usados ​​como um controle positivo adicional. Um total de quatorze grupos de estudo com oito espécimes por grupo serão avaliados nesta parte do experimento: (1) controle; (2) amálgama (material metálico utilizado como controle positivo) e 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 e 8) Zn3. Para garantir a remoção do monômero não polimerizado, os discos serão imersos em 10 mL de água deionizada estéril e agitados por 2 horas a 200 rpm e 37,8°C, após o que os discos serão deixados para secar em temperatura ambiente por pelo menos 24 horas. Os discos serão esterilizados por incubação em etanol 70% por 10 minutos e posteriormente secos assepticamente por no mínimo 48 horas. A superfície de cada disco será inoculada com 100 mL de uma concentração viável definida de 1 108 células/mL Streptococcus mutans cultivados anaerobicamente, ATCC1 25175 em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). . Para determinar a concentração de células viáveis ​​para cada grupo de tratamento em unidades formadoras de colônias por mL (CFU/ml), os discos inoculados serão anaerobicamente, após o que o número total de UFCs recuperados será determinado.

   2.2. Avaliação in vitro e ex vivo da atividade de MMPs (1-2) 2.2.1 Ensaio de inibição da atividade de MMP (in vitro): A atividade quantitativa de MMP-2, MMP-8 e MMP-9 in vitro será determinada por ensaio fluorométrico de MMP comercial kits (kits de ensaio SensoLyte; AnaSpec, San Jose, CA, EUA) para triagem da atividade anti-MMP. Adesivos dopados com Cu e ZnNP em diferentes concentrações e controles sem adesivos Cu ou ZnNP serão adicionados ao tampão de reação, e o ensaio será realizado de acordo com as recomendações do fabricante. Após a clivagem em 2 fragmentos separados por MMP, a fluorescência do 5-FAM será monitorada por um leitor de microplacas fluorescente (Sinergy TM).

   2.2.2 Determinação da atividade e dos níveis de MMP (amostras de dentina ex vivo com amostras obtidas de dentes restaurados com adesivos dopados e controle): Vinte e cinco (n=5) terceiros molares humanos livres de cárie extraídos serão coletados após a obtenção de informações informadas pelos pacientes consentimento. Os dentes serão desinfetados em cloramina a 0,5%, armazenados em água destilada e utilizados até seis meses após a extração. Um pequeno preparo oclusal com dimensões padronizadas de 3x3x5 mm será feito por um operador calibrado no centro do dente usando uma broca diamantada cilíndrica (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, EUA) e uma broca de alta velocidade peça de mão enquanto fornece spray de ar-água. Após o término do preparo cavitário, a mesma será preenchida com resina composta (Filtek Supreme; 3M ESPE). Os adesivos experimentais dopados com Cu e Zn serão usados ​​de acordo com as instruções do fabricante, e o adesivo não dopado será usado como controle em um pré-molar superior homólogo. A resina composta (Filtek Supreme; 3M ESPE) será aplicada pela técnica incremental. O esmalte será completamente removido com uma serra diamantada de baixa velocidade (Remet, Bologna, Itália) sob irrigação salina, e os dentes serão seccionados para obtenção de lâminas de dentina coronal de 1 mm de espessura, que serão posteriormente pulverizadas em pó com um martelo de aço. O pó de dentina será então dividido igualmente e desmineralizado (a 4°C por 24 horas sob agitação) em uma das seguintes soluções aquosas: (1) ácido acético 0,87 M, pH = 2,3; (2) ácido cítrico 0,26 M, pH = 2,3; ou (3) EDTA 0,5 M, pH = 6,4; ou (4) 0,5 M EGTA, pH = 6,4. A extração enzimática do pó de dentina desmineralizada será suspensa em tampão de extração (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, contendo 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,1% NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2, 0,02% NaN3) e coquetel de inibidores de protease sem EDTA (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA). As amostras serão então tratadas com ultrassom a 40 W de saída por 3 rajadas de 10 segundos cada a 4°C (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Modelo W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, EUA). Os frascos serão centrifugados a 18.000 rpm por 30 min a 4°C, e os sobrenadantes serão coletados. Todas as proteínas presentes nos sobrenadantes serão precipitadas a 4°C pela adição de sulfato de amônio em pó (p/v) para atingir uma concentração final de 85% e pH 7,0. O precipitado será coletado por centrifugação a 24.000 rpm por 30 min a 4°C, redissolvido em uma diluição de 10 vezes em tampão de extração, dialisado através de uma membrana de 30 kDa contra tampão de extração durante a noite e armazenado a 4°C até ser analisado. Depois disso, o pó de dentina será analisado para avaliar os níveis de atividade de MMP-2, MMP-9 e catepsina B medidos por zimografia de gelatina e para avaliar MMP-8 por zimografia de colágeno, conforme descrito anteriormente.56 A densitometria será expressa como du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, EUA). Resumidamente, amostras de pó de dentina serão submetidas à eletroforese sob condições desnaturantes não redutoras em géis SDS/PAGE contendo 1 mg/mL de gelatina ou 0,1 mg/mL de colágeno como substratos. Em seguida, serão embebidos duas vezes em 2,5% Triton X-100 e incubados por 17 h em tampão revelador (20 mM Tris pH 7,4 e 5 mM CaCl2), corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e descorados com ácido acético 10% e solução de metanol a 20%. Os níveis de MMP-2, MMP-8, MMP-9, catepsina B e ICTP (como um marcador da hidrólise do colágeno dentinário) serão determinados por um kit ELISA comercial ou imunoensaios multiplex (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA, para tecnologia Luminex) de acordo com as recomendações do fabricante.

   2.3. Teste de propriedades mecânicas de nanocompósitos adesivos (1-2) Resistência de união 2.3.1 Seleção e preparação do dente: Setenta terceiros molares humanos livres de cárie extraídos serão coletados após a obtenção do consentimento informado dos pacientes da clínica odontológica da Universidade do Chile (≈2000 terceiros extrações molares por ano, garantindo a disponibilidade desses dentes que normalmente são descartados). Os dentes serão desinfetados em cloramina a 0,5%, armazenados em água destilada e utilizados até seis meses após a extração. Uma superfície plana de dentina será exposta após lixamento úmido do esmalte oclusal com papel #180 SiC. As superfícies de dentina expostas serão posteriormente polidas com papel de SiC nº 600 úmido por 60 segundos para padronizar a smear layer.

   2.3.2 Desenho experimental: Os dentes serão distribuídos aleatoriamente em doze grupos de cinco (6 grupos por adesivo), cada um dos quais será tratado com uma concentração diferente de adesivo dopado. Como controle sem NPs do sistema Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE) será utilizado.

   2.3.3. Procedimento restaurador e preparação da amostra: Os sistemas adesivos serão aplicados estritamente de acordo com as instruções dos respectivos fabricantes.

   2.3.4 Após os procedimentos de colagem: Todos os dentes receberão uma restauração composta micro híbrida em dois incrementos de 2 mm. Cada incremento será fotopolimerizado por 40 segundos usando uma unidade de fotopolimerização LED na configuração de 1200 mW/cm2 (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Austrália). Os dentes restaurados serão armazenados em água destilada a 37°C por 24 horas e então seccionados longitudinalmente nas direções mésio-distal e vestíbulo-lingual através da interface colada usando uma serra diamantada de baixa velocidade (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) para obtenção de 15 a 20 bastões de resina-dentina, cada um com uma área de seção transversal de aproximadamente 0,8 mm2 quando medido com um paquímetro digital (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tóquio, Japão). Cada espécime de cada dente será avaliado para ligação por microtração resistência (mTBS), exceto para seis espécimes de resina-dentina selecionados aleatoriamente, que serão divididos para medição do grau de conversão in situ (DC) e nanoinfiltração (NL).

   2.3.5. Teste de resistência de união à microtração: Bastões de união resina-dentina serão fixados em gabarito de Geraldeli com adesivo de cianoacrilato e testados sob tensão (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brasil) a 0,5 mm/min até a falha. Os valores de mTBS serão calculados dividindo a carga na falha pela área de colagem da seção transversal. O modo de falha dos espécimes será classificado como coesivo (falha exclusivamente dentro da dentina ou resina composta), adesivo (falha na interface resina/dentina) ou misto (falha na interface resina/dentina incluindo falha coesiva dos substratos vizinhos ). A classificação será realizada em estereomicroscópio (SZ40; Olympus, Tóquio, Japão) com aumento de 100x. Amostras com falhas prematuras (PFs) serão incluídas na média.

   2.3.6. Grau de conversão in situ: Três bastões de resina-dentina de cada dente serão polidos a úmido com papel SiC #1500, #2000 e #2500. Eles serão então limpos por ultrassom por 20 minutos e armazenados em água a 37,8°C por 24 horas antes de medir DC. A análise por espectroscopia Micro-Raman será realizada em equipamento Senterra (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Württemberg, Alemanha). A calibração do espectrômetro micro-Raman será realizada redefinindo-o para zero e medindo o coeficiente de uma amostra de silício. As amostras serão analisadas usando os seguintes parâmetros micro-Raman: Laser Neon de 20 mW em 532 nm, resolução espacial em 3 mm, resolução espectral em 5 cm-1, tempo de acumulação em 30 segundos com 6 co-adições e ampliação em 110x ( Olympus UK, London, UK) para um diâmetro de feixe de 1 mm. Os espectros serão obtidos na interface dentina-adesivo em três locais diferentes dentro da dentina intertubular para cada bastão de resina-dentina. Espectros de adesivos não polimerizados serão usados ​​como referência. O pós-processamento dos espectros será realizado usando o software dedicado Opus Spectroscopy versão 6.5. Será calculada a razão do conteúdo de dupla ligação de monômero para polímero no adesivo: onde ''R'' é a razão das áreas dos picos alifáticos e aromáticos em 1639 cm-1 e 1609 cm-1 em adesivos polimerizados e não polimerizados. O CD in situ de todos os palitos de resina-dentina do mesmo dente será calculado para fins estatísticos.

   2.3.7. Avaliação da nanoinfiltração: Três bastões de resina de cada dente serão colocados em nitrato de prata amoniacal preparados de acordo com o protocolo descrito por Tay et al.57 e armazenados no escuro por 24 horas. Eles serão então enxaguados completamente em água destilada e imersos em solução de fotorrevelação por 8 horas sob uma luz fluorescente para reduzir os íons de prata a grãos metálicos de prata dentro dos vazios ao longo da interface ligada. As amostras serão polidas a úmido com papel SiC #600, #1000, #1200, #1500, #2000 e #2500 e com pasta diamantada de 1 e 0,25 mm (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) usando um pano de polimento. Eles serão limpos por ultrassom, secos ao ar, montados em stubs e revestidos com ouro-carbono (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). As interfaces resina-dentina serão analisadas em um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo operado no modo retroespalhamento (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, Reino Unido). Três imagens serão capturadas de cada stick colado em resina-dentina. A porcentagem relativa de NL dentro das camadas adesiva e híbrida em cada espécime será medida em todas as imagens usando o software Image J58 por um pesquisador cego. Os valores do mesmo espécime serão calculados e a média NL de todos os palitos do mesmo dente será a média.

   2.4 Avaliar ensaios de biocompatibilidade e viabilidade em cultura primária de fibroblastos gengivais 2.4.1 Culturas celulares: Culturas primárias de fibroblastos humanos serão obtidas pelo método de explante, a partir do tecido retromolar de terceiros molares de três indivíduos adultos do sexo masculino.

   A linha celular de osteossarcoma humano Saos-2, comumente utilizada para avaliar a biocompatibilidade entre osteoblastos e biomateriais, será cultivada conforme descrito por Alcaide et al.60.

   As células serão semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 3.000 células por poço. Após 24h, o meio de cultura controle será substituído por 100 µl de diferentes diluições do adesivo adequado (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). As placas serão incubadas por 24h, 48h e 72h em 37 °C incubadora (5%CO2) antes dos ensaios de viabilidade ou morte celular.

   2.4.2 Viabilidade celular e análise do ciclo celular: Culturas primárias de fibroblastos humanos serão obtidas pelo método de explante, a partir do tecido retromolar de terceiros molares de três indivíduos adultos do sexo masculino.

   A linha celular de osteossarcoma humano Saos-2, comumente utilizada para avaliar a biocompatibilidade entre osteoblastos e biomateriais, será cultivada conforme descrito por Alcaide et al.60.

   As células serão semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 3.000 células por poço. Após 24h, o meio de cultura controle será substituído por 100 µl de diferentes diluições do adesivo adequado (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). As placas serão incubadas por 24h, 48h e 72h em 37 °C incubadora (5%CO2) antes dos ensaios de viabilidade ou morte celular.

   2.4.3 Quantificação de células viáveis, apoptóticas iniciais, apoptóticas tardias e necróticas por microscopia de fluorescência: Será usado o protocolo descrito por Kasibhatla et al 61. As células serão coradas com solução de Acridine Orange/Ethidium Brometo (AO/EB) e serão examinadas por microscopia de fluorescência. AO irá manchar células vivas e mortas. EB irá manchar apenas as células que perderam a integridade da membrana. As células vivas aparecerão uniformemente verdes. As primeiras células apoptóticas se coram de verde e contêm pontos verdes brilhantes nos núcleos como consequência da condensação da cromatina e da fragmentação nuclear. As células apoptóticas tardias também incorporarão brometo de etídio e, portanto, coram-se de laranja, mas, em contraste com as células necróticas, as células apoptóticas tardias apresentarão núcleos condensados ​​e muitas vezes fragmentados. As células necróticas coram-se de laranja, mas apresentam morfologia nuclear semelhante à das células viáveis, sem cromatina condensada61.

   2.4.4 Detecção de apoptose por exposição de fosfatidilserina, DNA laddering e mRNA apoptótico e quantificação de proteínas: A exposição de fosfatidilserina na superfície externa da membrana plasmática será analisada como sinal precoce de apoptose por coloração com anexina V (A5)- aloficocianina (APC), conforme descrito em Alcaide e cols.60. A fluorescência da sonda APC será analisada por citometria de fluxo.

   O ensaio de DNA apoptótico em escada será realizado usando um Kit de DNA Ladder (Roche, Alemanha).

   Os níveis de mRNA e proteínas para mediadores supressores de tumor (p53), pró-apoptóticos (bax, caspase 3) e anti-apoptóticos (bcl-2) serão abordados usando PCR quantitativo e imunoblot.

   2.4.5 Avaliação da autofagia: Para testar efeitos putativos de NPs de metal na autofagia celular, diferentes marcadores de autofagia serão abordados. O fluxo autofágico e o nível de p62 serão detectados por western blot, e os autofagossomos serão visualizados por microscopia de fluorescência por contagem de LC3 positivo puncta63.

3. Avaliação dos níveis e/ou atividade e biocompatibilidade de metaloproteases de nanocompósitos adesivos in vivo.

   Os pré-molares indicados para extração serão restaurados com adesivo tradicional ou nanocompósito adesivo. Após um mês (chamada por contato telefônico e após o exame clínico), os pacientes serão examinados e os pré-molares serão extraídos e analisados ​​por avaliadores cegos (codificados por números) em todas as etapas conforme descrito. As extrações de pré-molares serão realizadas por professores de odontologia, qualquer efeito pós-procedimento será assumido e resolvido pela equipe de pesquisa, os procedimentos para os pacientes são gratuitos e tudo será seguido rigorosamente pelas recomendações do comitê de ética da faculdade de odontologia da universidade do Chile.

   3.1 Avaliação in vivo de nanocompósitos adesivos: Setenta voluntários que necessitam de extração dos primeiros pré-molares superiores direito e esquerdo (n = 35 por grupo) por motivos ortodônticos serão selecionados do Programa de Especialização em Ortodontia na clínica da Universidade do Chile (haverá ser um período de recrutamento de 3 meses com um co-investigador responsável pela monitorização (CB)). Os critérios de inclusão serão (1) planos de tratamento indicando extrações de pré-molares por razões ortodônticas, (2) presença de dentes de tratamento saudáveis, intactos, não cariados, não restaurados e totalmente erupcionados e (3) pacientes com condições de saúde bem controladas que permitem que todos os procedimentos sejam realizados na pesquisa com risco mínimo. Os critérios de exclusão serão (1) pacientes que não concordam em se voluntariar para o estudo e (2) pacientes que não atendem a todos os critérios de inclusão. Uma pequena preparação oclusal será feita por um operador calibrado no centro do dente usando um cilindro de diamante broca (.63109/018,Grão Médio (60730025), Dentsply,NY,EUA) e uma peça de mão de alta velocidade enquanto fornece spray de ar-água com dimensões padronizadas de 3x3x5 mm. Após o término do preparo cavitário, a mesma será preenchida com resina composta (Filtek Supreme; 3M ESPE). Os adesivos experimentais dopados com Cu e Zn serão usados ​​de acordo com as instruções do fabricante, e o adesivo não dopado será usado como controle no pré-molar superior homólogo e delineado por randomização simples de grupos paralelos. A resina composta (Filtek Supreme; 3M ESPE) será aplicada pela técnica incremental e, por fim, uma demão de adesivo será aplicada como superfície da restauração composta e polimerizada por 10 seg. A oclusão será verificada e as restaurações serão finalizadas e polidas seguindo as instruções do fabricante. Posteriormente, polimento e acabamento final serão utilizados para aplicar uma camada de adesivo na restauração final, que será polimerizada por 10 segundos (Raddi Cal, SDI, AU). Um dente de cada vez será extraído um mês após as restaurações serem feitas. O paciente receberá anestesia infiltrativa e intraligamentar (aproximadamente 1,8 mL de Mepivacaína a 2% (36 mg)) com epinefrina na proporção de 1:100.000 (18 mg). Em seguida, os dentes serão submetidos a testes.

   3.2 Determinar as propriedades antimicrobianas de superfície de nanocompósitos adesivos: Para avaliar as propriedades antibacterianas de superfície de adesivos dopados, uma camada final de adesivos será aplicada sobre a superfície final de restaurações em um modelo in vivo. O procedimento será usado para avaliar o número de CFU de S.Mutans em superfícies compostas (resultado principal). Antes da amostragem do biofilme, as bandejas serão preparadas para imprimir o biofilme sobre as restaurações. Para esta aplicação, utilizaremos bandejas de aplicação de gel de flúor descartáveis ​​(Deepak Products Inc., Miami, EUA), cada uma das quais será esterilizada em capela de biossegurança (Esco Technologies Inc., Harboro, EUA) sob luz ultravioleta por 30 minutos. Cada bandeja será então carregada com 7,5 ml de ágar TYCSB (Caseína, extrato de levedura, L-cisteína, sacarose, bacitracina) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, EUA), que é um meio seletivo para S. mutans. Posteriormente, para individualizar a técnica de coleta de amostra, as moldeiras serão cortadas para caber no máximo 3 dentes. Imediatamente após isso, as bandejas serão colocadas em placas de Petri estéreis e armazenadas em sacos plásticos lacrados em geladeira. Antes do uso, as bandejas serão colocadas em incubadora/fogão (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Coréia) por 24 horas a 37°C como medida de controle de qualidade. O terceiro e o quarto operadores realizarão a amostragem, que será realizada entre 11h00 e 13h00 para permitir a reorganização do biofilme após a escovação matinal. A amostragem será realizada por um operador cego pressionando suavemente a moldeira por 20 s sobre a restauração RC, seguida de restauração RC homóloga com e sem adesivo dopado com Cu ou Zn.

   Após as bandejas de amostra serem armazenadas em placas de petri estéreis, elas serão transportadas a 4 °C e então incubadas a 37 °C em microaerófilo (jar vela CO2 10%) por 48 h. A contagem de S.mutans será realizada pelo quarto operador que será cegado para a moldeira usada para imprimir as restaurações RC. Posteriormente, será realizada a coloração de Gram para determinar a micromorfologia das colônias. A contagem de S.mutans será expressa em unidades formadoras de colônias (UFC) de S.mutans provenientes das placas e bandejas com ágar TYCSB. Colônias selecionadas que serão compatíveis com adesão e características morfológicas de S.mutans serão suspensas em caldo Todd-Hewitt (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, EUA) e incubadas a 37 °C por 48 h. As colônias serão então submetidas a testes bioquímicos para identificar a espécie de S. mutans e distingui-la de S. sobrinus. Os testes bioquímicos incluem testes de fermentação de rafinose, fermentação de melibiose e hidrólise de esculina. Um resultado positivo para todos os três testes indica a presença de S. mutans.

   3.3 A avaliação dos níveis de metaloprotease e/ou atividade no tecido dentinário macerado usará uma metodologia semelhante à de 2.4.2 3.3.1 Zimografia in situ para avaliar as atividades das MMPs 2 e 9 (resultado): Um método descrito por Mazzoni et al 0,65 será usado em 20 (n=5 por grupo) pré-molares superiores humanos não cariados recém-extraídos e restaurados por um procedimento anterior. Após a remoção do esmalte e do cemento, discos de 1 mm de espessura de dentina coronal média/profunda serão obtidos. Uma solução estoque de 1,0 mg/mL de gelatina marcada com fluoresceína foi preparada adicionando 1,0 mL de água aos frascos contendo o substrato liofilizado e armazenando a -20°C até o uso. A solução estoque de gelatina é diluída 1:8 com o tampão de diluição (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) e um agente antidesbotamento é adicionado (Meio de montagem com Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, Reino Unido). Uma quantidade de 50 μL da mistura de gelatina fluorescente é colocada no topo de cada laje e coberta com uma lamínula. As lâminas são protegidas da luz e incubadas em câmaras umidificadas a 37°C. Para identificação do período de incubação ideal, as imagens fluorescentes são tiradas de 1 hora a 7 dias. Descrição detalhada da análise 3D da zimografia in situ com microscopia confocal. Resumidamente, a hidrólise do substrato de gelatina conjugada com fluoresceína extinta, que é indicativa da atividade da enzima gelatinolítica endógena, foi avaliada por exame sob um microscópio confocal multifóton (ex: 488nm e em: lp530nm; Zeiss, LSM 780, Carl Zeiss, Oberkochen , Alemanha). Seções ópticas de 85 μm de espessura foram adquiridas de diferentes planos focais, e as imagens empilhadas foram analisadas, quantificadas e processadas com o software ZEN 2010 (Carl Zeiss).

   3.4. Determinação da biocompatibilidade. A polpa dentária será obtida a partir de pré-molares extraídos, e serão abordados marcadores moleculares de viabilidade celular (resultados) ou dano celular por nanocompósitos adesivos.

   A polpa dentária será obtida conforme descrito por Vaseemuddin66, a partir de pré-molares extraídos. O RNA total será separado e os níveis de mRNA de marcadores específicos de apoptose e autofagia serão medidos por qPCR, conforme descrito anteriormente (2.4.4-2.4.5).

   3.5 A avaliação das propriedades mecânicas (nanoinfiltração e análise de conversão de grau para avaliar as estabilidades de ligação (resultado)) será igual aos métodos em 2.1

4. Análise estatística: A análise estatística será realizada com o software SPSS 23.0 (IBM, New York, NY, EUA). Comparações entre variáveis ​​quantitativas (resistência à microtração, nanoinfiltração, grau de conversão, contagem de UFC) entre dois grupos independentes serão analisadas por teste t não pareado, ANOVA e teste pots-hoc (ou respectivos testes não paramétricos de acordo com Shapiro-Wilk teste de distribuição de dados). As associações entre as determinações das amostras serão calculadas pela correlação de Pearson ou Spearman. Um cálculo de poder foi realizado usando dados de um estudo anterior67. Um tamanho de amostra com um mínimo de 35 pacientes por grupo e por cada braço de estudo foi necessário para encontrar uma diferença com significância estatística em uma contagem final de UFC (desfecho principal), considerando um poder estatístico de 0,8 baseado em Vildosola et a study64 (1 -β). A significância será considerada se o valor de p for