Effect van de opname van koper- en zinknanodeeltjes in tandkleefstoffen (1170575)

Algemene doelstelling Het evalueren van de invloed van de incorporatie van koper- of zinknanodeeltjes in een tandadhesief op de antimicrobiële werking ervan en hun invloed op de activiteit van dentinematrixmetalloproteasen. Analyseren van adhesieve mechanische eigenschappen en biocompatibiliteit Bijzonderheden Doelstellingen

1. Ontwikkelen en structureel karakteriseren van een tandheelkundige lijm gedoteerd met koper- of zinknanodeeltjes.

   1.1. Bereiding van zelfklevende nanocomposieten; 1.2. Structurele karakterisering van zelfklevende nanocomposieten.

2. Om mechanische, biochemische en functionele effecten van hechtende nanocomposieten in vitro te beoordelen. Assays zullen worden behandeld waarbij de toevoeging van controlelijm wordt vergeleken, of de lijm die is gedoteerd met koper of zink op verse, recent geëxtraheerde tanden. vivo-fase) 2.1. Om de antimicrobiële activiteit van kleefstof te testen; 2. 2. De invloed bestuderen van adhesieve nanocomposieten op niveaus en/of activiteit van matrix metalloproteasen;2.3. De mechanische eigenschappen van lijm beoordelen; 2.4. Biocompatibiliteit beoordelen. Levensvatbaarheidstesten in primaire gekweekte gingivale fibroblasten zullen worden behandeld.
3. Om in vivo model (klinische fase) antimicrobiële eigenschappen, matrix metalloproteasen en cathepsine B niveaus en/of activiteit, biocompatibiliteit van adhesieve nanocomposieten in vivo en mechanische eigenschappen te evalueren. Premolaren geïndiceerd voor extractie zullen worden hersteld met behulp van traditionele lijm of de zelfklevende nanocomposiet. Na een maand worden premolaren getrokken en geanalyseerd zoals beschreven.

3.1. Antimicrobiële eigenschappen van hechtende nanocomposieten aan het oppervlak bepalen; 3.2. Om matrixmetalloproteasen en cathepsine B-niveaus en/of activiteit in verweekt dentineweefsel te beoordelen; 3.3 Biocompatibiliteit bepalen. Tandpulp zal worden verkregen uit geëxtraheerde premolaren, en moleculaire markers van cellevensvatbaarheid of celbeschadiging zullen worden aangepakt van hechtende nanocomposieten;3.4 De mechanische eigenschappen van lijm evalueren.

METHODEN

1. Een tandheelkundige lijm ontwikkelen die is gedoteerd met koper- of zinknanodeeltjes. 1.1. Bereiding van zelfklevende nanocomposieten (1): CuNP/adhesieve nanocomposieten zullen worden bereid met behulp van het één-fles lijmsysteem Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Deze lijm op basis van aceton bevat een mengsel van urethaandimethacrylaat en zuur monomeer dipentaerythritolpentaacrylaatmonofosfaat. Om de zelfklevende nanocomposieten te bereiden, zullen geschikte hoeveelheden nanodeeltjespoeder (CuNp en ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chili) worden afgewogen en onder constant magnetisch roeren rechtstreeks aan de lijmfles worden toegevoegd. De suspensie wordt vervolgens gedurende 10 minuten verder gedispergeerd in een ultrasoon bad bij 37°C. Zelfklevende nanocomposieten zullen worden bereid met een CuNP-gehalte in het bereik van 0,015 tot 0,045 gew.% volgens eerdere gegevens van onze laboratoria. De vijf concentraties van met Cu en Zn gedoteerde kleefstoffen zijn 0,0150%, 0,0075% en 0,00038% (concentraties met antibacteriële actieve eigenschappen op basis van onze eerdere gegevens (Cu 1-2-3 en Zn 1-2-3).

   1.2. Structurele karakterisering van adhesieve nanocomposieten (1): Morfologie en samenstelling van de nanocomposiet-adhesieve materialen zullen worden gekarakteriseerd door SEM-EDX in terugverstrooide elektronenmodus om fasecontrast en AFM-microscopie te produceren. De chemische structuur van de polymeermatrix en de restmonomeerinhoud zullen worden geanalyseerd door middel van verzwakte totale reflectie Fourier-transformatie-infrarood- en Raman-spectroscopieën. Het resterende monomeer zal worden geanalyseerd rekening houdend met de koolstof-koolstof dubbele bindingstrilling van het acrylmonomeer in het bereik van 1684 - 1636 cm-1.

2. Antibacteriële, mechanische, biochemische en functionele effecten van zelfklevende nanocomposieten in vitro en ex vivo beoordelen. Assays zullen worden behandeld waarbij de toevoeging van gewone lijm wordt vergeleken, of de lijm die is gedoteerd met koper of zink.

   2.1. Bepaling van antimicrobiële eigenschappen van hechtend nanocomposiet (2) 2.1.1 Antibacteriële activiteit: In het kort, schijven van 10 mm met een dikte van 2 mm zullen worden vervaardigd met behulp van harscomposiet (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) en ofwel ongecoat gelaten (controle) of gecoat met de lijm Prime&Bond 2.1, en gelijkwaardige experimentele lijmmengsels van twaalf groepen en gepolymeriseerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant gedurende 10 seconden met behulp van een LED-lichtuithardingseenheid (Radii Cal, SDI, AU) bij een vermogensdichtheid van 1000 mW/cm2. Amalgaamschijven (Contour; Kerr, Orange, CA) worden vervaardigd zoals eerder beschreven en gebruikt als een extra positieve controle. In dit deel van het experiment zullen in totaal veertien studiegroepen met acht exemplaren per groep worden geëvalueerd: (1) controle; (2) amalgaam (metalen materiaal gebruikt als positieve controle) en 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 en 8) Zn3. Om ervoor te zorgen dat niet-gepolymeriseerd monomeer wordt verwijderd, worden de schijven ondergedompeld in 10 ml steriel gedeïoniseerd water en gedurende 2 uur geroerd bij 200 rpm en 37,8 °C, waarna de schijven ten minste 24 uur bij kamertemperatuur worden gedroogd. De schijven worden gesteriliseerd door incubatie in 70% ethanol gedurende 10 minuten en vervolgens aseptisch gedroogd gedurende minimaal 48 uur. Het oppervlak van elke schijf wordt geïnoculeerd met 100 ml van een gedefinieerde levensvatbare concentratie van 1 108 cellen/ml anaëroob gekweekte Streptococcus mutans, ATCC1 25175 in hersenhartinfusie (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) bouillon . Om de levensvatbare celconcentratie voor elke behandelingsgroep in kolonievormende eenheden per ml (CFU/ml) te bepalen, worden de geïnoculeerde schijven anaëroob gemaakt, waarna het totale aantal teruggevonden CFU's wordt bepaald.

   2.2. In vitro en ex vivo evaluatie van de activiteit van MMP's (1-2) 2.2.1 MMP-activiteitsremmingsassay (in vitro): Kwantitatieve MMP-2-, MMP-8- en MMP-9-activiteit in vitro zal worden bepaald met commerciële MMP-fluorometrische assay kits (SensoLyte-assaykits; AnaSpec, San Jose, CA, VS) voor screening van de anti-MMP-activiteit. Met Cu en ZnNP gedoteerde kleefstoffen in verschillende concentraties en controles zonder Cu- of ZnNP-kleefstoffen worden aan de reactiebuffer toegevoegd en de test wordt uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Na splitsing in 2 afzonderlijke fragmenten door MMP, zal de fluorescentie van 5-FAM worden gevolgd door een fluorescerende microplaatlezer (Sinergy TM).

   2.2.2 Bepaling van MMP-activiteit en -niveaus (ex vivo dentinemonsters met monsters verkregen uit herstelde tanden met gedoteerde adhesieven en controle): Vijfentwintig (n=5) geëxtraheerde cariësvrije menselijke derde molaren zullen worden verzameld na het verkrijgen van de informatie van de patiënt. toestemming. De tanden worden gedesinfecteerd in 0,5% chlooramine, bewaard in gedestilleerd water en binnen zes maanden na extractie gebruikt. Een kleine occlusale preparatie met gestandaardiseerde afmetingen van 3x3x5 mm wordt gemaakt door een gekalibreerde operator in het midden van de tand met behulp van een cilinderdiamantboor (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, VS) en een high-speed handstuk terwijl het lucht-waternevel verstrekt. Nadat de preparatie van de caviteit is voltooid, wordt deze gevuld met harscomposiet (Filtek Supreme; 3M ESPE). De experimentele adhesieven gedoteerd met Cu en Zn zullen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant, en de niet-gedoteerde adhesieven zullen worden gebruikt als controle op een homologe bovenste premolaar. De harscomposiet (Filtek Supreme; 3M ESPE) wordt aangebracht met behulp van de incrementele techniek. Het glazuur zal volledig worden verwijderd met een diamantzaag met lage snelheid (Remet, Bologna, Italië) onder irrigatie met zoutoplossing, en de tanden zullen worden doorgesneden om 1 mm dikke coronale dentinewafers te verkrijgen, die vervolgens tot poeder zullen worden verpulverd met een stalen hamer. Dentinepoeder wordt vervolgens gelijkmatig verdeeld en gedemineraliseerd (bij 4°C gedurende 24 uur onder roeren) in een van de volgende wateroplossingen: (1) 0,87 M azijnzuur, pH = 2,3; (2) 0,26 M citroenzuur, pH = 2,3; of (3) 0,5 M EDTA, pH = 6,4; of (4) 0,5 M EGTA, pH = 6,4. Enzymextractie van het gedemineraliseerd dentinepoeder wordt gesuspendeerd in extractiebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, met 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,1% NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2, 0,02% NaN3) en EDTA-vrije proteaseremmercocktail (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS). De monsters worden vervolgens ultrasoon behandeld bij een vermogen van 40 W gedurende 3 bursts van elk 10 seconden bij 4°C (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, VS). De flesjes worden gecentrifugeerd bij 18.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4°C, en de supernatanten worden verzameld. Alle eiwitten die aanwezig zijn in de supernatanten zullen worden geprecipiteerd bij 4°C door toevoeging van poedervormig ammoniumsulfaat (w/v) om een ​​eindconcentratie van 85% en pH 7,0 te bereiken. Het precipitaat wordt verzameld door centrifugatie bij 24.000 rpm gedurende 30 min bij 4°C, opnieuw opgelost in een 10-voudige verdunning in extractiebuffer, gedialyseerd door een membraan van 30 kDa tegen extractiebuffer gedurende de nacht, en bewaard bij 4°C tot analyse. Hierna zal het dentinepoeder worden geanalyseerd om de activiteitsniveaus van MMP-2, MMP-9 en cathepsine B te beoordelen, gemeten door gelatinezymografie, en om MMP-8 te beoordelen door middel van collageenzymografie, zoals eerder beschreven.56 Densitometrie wordt uitgedrukt als du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, VS). In het kort zullen dentinepoedermonsters worden onderworpen aan elektroforese onder niet-reducerende denaturerende omstandigheden in SDS/PAGE-gels die 1 mg/ml gelatine of 0,1 mg/ml collageen als substraat bevatten. Vervolgens worden ze tweemaal geweekt in 2,5% Triton X-100 en gedurende 17 uur geïncubeerd in ontwikkelbuffer (20 mM Tris pH 7,4 en 5 mM CaCl2), gekleurd met Coomassie Brilliant Blue R-250 en ontkleurd met 10% azijnzuur en 20% methanoloplossing. Niveaus van MMP-2, MMP-8, MMP-9, cathepsine B en ICTP (als marker van dentinecollageenhydrolyse) zullen worden bepaald door middel van een commerciële ELISA-kit of multiplex-immunoassays (R&D Systems, Minneapolis, MN, VS, voor Luminex-technologie) volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

   2.3. Testen van mechanische eigenschappen van adhesieve nanocomposieten (1-2) Hechtsterkte 2.3.1 Selectie en preparatie van tanden: Zeventig geëxtraheerde cariësvrije menselijke derde molaren zullen worden verzameld na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming van de patiënt van de tandheelkundige kliniek van de Universiteit van Chili (≈2000 derde kiesextracties per jaar, waardoor de beschikbaarheid van deze tanden die normaal gesproken worden weggegooid, wordt gewaarborgd). De tanden worden gedesinfecteerd in 0,5% chlooramine, bewaard in gedestilleerd water en binnen zes maanden na extractie gebruikt. Na het nat slijpen van het occlusale glazuur met een #180 SiC-papier zal een vlak dentineoppervlak zichtbaar worden. De blootgestelde dentine-oppervlakken worden verder gepolijst met nat #600 SiC-papier gedurende 60 seconden om de smeerlaag te standaardiseren.

   2.3.2 Experimenteel ontwerp: de tanden worden willekeurig ingedeeld in twaalf groepen van vijf (6 groepen per adhesief), die elk worden behandeld met een andere concentratie gedoteerd adhesief. Als controle zonder NP's van systeem Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE) zal worden gebruikt.

   2.3.3. Restauratieve procedure en preparatie van monsters: De adhesieve systemen worden strikt aangebracht in overeenstemming met de instructies van de respectieve fabrikant.

   2.3.4 Na bondingprocedures: Alle tanden krijgen een microhybride composietrestauratie in twee stappen van 2 mm. Elke increment wordt gedurende 40 seconden met licht gepolymeriseerd met behulp van een LED-lichtuithardingseenheid bij de instelling van 1200 mW/cm2 (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australië). Gerestaureerde tanden worden gedurende 24 uur in gedestilleerd water bij 37°C bewaard en vervolgens longitudinaal doorgesneden in de mesio-distale en buccale-linguale richtingen over het gebonden grensvlak met behulp van een langzame diamantzaag (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) om 15 tot 20 hars-dentine sticks te verkrijgen, elk met een dwarsdoorsnede van ongeveer 0,8 mm2 wanneer gemeten met een digitale schuifmaat (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokyo, Japan). Elk exemplaar van elke tand zal worden beoordeeld op hechting op microsterkte sterkte (mTBS), met uitzondering van zes willekeurig geselecteerde hars-dentine gebonden specimens, die zullen worden verdeeld voor meting van de in situ mate van conversie (DC) en nanolekkage (NL).

   2.3.5. Hechtingssterktetest op microtreksterkte: Sticks met hars-dentinebinding worden bevestigd aan een mal van Geraldeli met behulp van cyanoacrylaatlijm en getest onder spanning (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brazilië) bij 0,5 mm/min totdat ze falen. De mTBS-waarden worden berekend door de belasting bij bezwijken te delen door het verbindingsoppervlak in de dwarsdoorsnede. De faalwijze van de samples wordt geclassificeerd als cohesief (falen uitsluitend binnen dentine of harscomposiet), adhesief (falen op het hars/dentine-grensvlak) of gemengd (falen op het hars/dentine-grensvlak inclusief cohesief falen van de naburige substraten ). Classificatie zal worden uitgevoerd onder een stereomicroscoop (SZ40; Olympus, Tokio, Japan) bij een vergroting van 100x. Specimens met premature mislukkingen (PF's) zullen in het gemiddelde worden opgenomen.

   2.3.6. Mate van conversie in situ: drie met hars en dentine verbonden sticks van elke tand worden nat gepolijst met #1500, #2000 en #2500 SiC-papier. Vervolgens worden ze gedurende 20 minuten ultrasoon gereinigd en gedurende 24 uur in water van 37,8 °C bewaard voordat DC wordt gemeten. Micro-Raman spectroscopie-analyse zal worden uitgevoerd met behulp van Senterra-apparatuur (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Württemberg, Duitsland). Kalibratie van de micro-Raman-spectrometer wordt uitgevoerd door deze op nul te zetten en vervolgens de coëfficiënt van een siliciummonster te meten. Specimens zullen worden geanalyseerd met behulp van de volgende micro-Raman-parameters: 20 mW neonlaser bij 532 nm, ruimtelijke resolutie bij 3 mm, spectrale resolutie bij 5 cm-1, accumulatietijd bij 30 seconden met 6 co-addities en vergroting bij 110x ( Olympus UK, London, UK) tot een bundeldiameter van 1 mm. Spectra zullen worden genomen op de dentine-adhesieve interface op drie verschillende plaatsen binnen de intertubulaire dentine voor elke stick met hars-dentinebinding. Spectra van niet-gepolymeriseerde kleefstoffen zullen als referentie worden gebruikt. Nabewerking van spectra zal worden uitgevoerd met behulp van de speciale Opus Spectroscopie Software versie 6.5. De verhouding van het gehalte aan dubbele bindingen van monomeer tot polymeer in de lijm wordt berekend: waarbij ''R'' de verhouding is van alifatische en aromatische piekoppervlakken bij 1639 cm-1 en 1609 cm-1 in gepolymeriseerde en niet-gepolymeriseerde lijmen. De in situ DC van alle met hars en dentine verbonden sticks van dezelfde tand wordt gemiddeld voor statistische doeleinden.

   2.3.7. Evaluatie van nanolekkage: Drie met hars gebonden staafjes van elke tand worden in ammoniakale zilvernitraat geplaatst, bereid volgens het protocol beschreven door Tay et al.57 en gedurende 24 uur in het donker bewaard. Vervolgens worden ze grondig gespoeld in gedestilleerd water en ondergedompeld in een foto-ontwikkeloplossing gedurende 8 uur onder fluorescerend licht om zilverionen te reduceren tot metallische zilverkorrels in de holtes langs het gebonden grensvlak. Monsters worden nat gepolijst met #600, #1000, #1200, #1500, #2000 en #2500 SiC-papier en met 1- en 0,25-mm diamantpasta (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) met behulp van een poetsdoek. Ze worden ultrasoon gereinigd, aan de lucht gedroogd, op stompjes gemonteerd en gecoat met koolstofgoud (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). Hars-dentine-interfaces zullen worden geanalyseerd in een veldemissie scanning-elektronenmicroscoop die werkt in de terugverstrooide modus (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, VK). Van elke met hars en dentine gebonden stick worden drie beelden gemaakt. Het relatieve percentage NL binnen de adhesieve en hybride lagen in elk monster zal in alle afbeeldingen worden gemeten met behulp van de Image J-software58 door een geblindeerde onderzoeker. Waarden van hetzelfde exemplaar worden gemiddeld en het gemiddelde NL van alle stokjes van dezelfde tand wordt gemiddeld.

   2.4 Biocompatibiliteit beoordelen, levensvatbaarheidstesten in primaire gekweekte gingivale fibroblasten 2.4.1 Celculturen: Primaire culturen van menselijke fibroblasten zullen worden verkregen door middel van de explantatiemethode, uit het retromolaire weefsel van derde molaren van drie mannelijke volwassen individuen.

   Saos-2 humane osteosarcoomcellijn, algemeen gebruikt om biocompatibiliteit tussen osteoblast en biomaterialen te beoordelen, zal worden gekweekt zoals beschreven door Alcaide et al.60.

   Cellen worden geënt in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 3000 cellen per putje. Na 24 uur wordt het controlekweekmedium vervangen door 100 µl verschillende verdunningen van de juiste lijm (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). De platen worden gedurende 24 uur, 48 uur en 72 uur geïncubeerd in een 37 °C incubator (5%CO2) voorafgaand aan testen op levensvatbaarheid of celdood.

   2.4.2 Cellevensvatbaarheid en celcyclusanalyse: Primaire culturen van menselijke fibroblasten zullen worden verkregen door middel van de explantatiemethode, uit het retromolaire weefsel van derde molaren van drie mannelijke volwassen individuen.

   Saos-2 humane osteosarcoomcellijn, algemeen gebruikt om biocompatibiliteit tussen osteoblast en biomaterialen te beoordelen, zal worden gekweekt zoals beschreven door Alcaide et al.60.

   Cellen worden geënt in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 3000 cellen per putje. Na 24 uur wordt het controlekweekmedium vervangen door 100 µl verschillende verdunningen van de juiste lijm (10%, 0,1%, 1%, 0,01%, 0%). De platen worden gedurende 24 uur, 48 uur en 72 uur geïncubeerd in een 37 °C incubator (5%CO2) voorafgaand aan testen op levensvatbaarheid of celdood.

   2.4.3 Kwantificering van levensvatbare, vroege apoptotische, late apoptotische en necrotische cellen door middel van fluorescentiemicroscopie: het protocol beschreven door Kasibhatla et al zal worden gebruikt 61. Cellen worden gekleurd met een oplossing van acridine-sinaasappel/ethidiumbromide (AO/EB) en worden onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie. AO kleurt zowel levende als dode cellen. EB kleurt alleen cellen die de membraanintegriteit hebben verloren. Levende cellen verschijnen gelijkmatig groen. Vroege apoptotische cellen kleuren groen en bevatten felgroene stippen in de kernen als gevolg van chromatinecondensatie en nucleaire fragmentatie. Late apoptotische cellen zullen ook ethidiumbromide opnemen en daarom oranje kleuren, maar in tegenstelling tot necrotische cellen zullen de late apoptotische cellen gecondenseerde en vaak gefragmenteerde kernen vertonen. Necrotische cellen kleuren oranje, maar hebben een nucleaire morfologie die lijkt op die van levensvatbare cellen, zonder gecondenseerd chromatine61.

   2.4.4 Detectie van apoptose door fosfatidylserine-blootstelling, DNA-laddervorming en apoptotische mRNA- en eiwitkwantificering: de blootstelling van fosfatidylserine op het buitenoppervlak van het plasmamembraan zal worden geanalyseerd als een vroeg signaal van apoptose door kleuring met annexine V (A5)- allophycocyanine (APC), zoals beschreven in Alcaide et al60. Fluorescentie van de sonde APC zal worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie.

   De apoptotische DNA-laddertest zal worden uitgevoerd met behulp van een DNA-ladderkit (Roche, Duitsland).

   mRNA- en eiwitniveaus voor tumorsuppressor (p53), pro-apoptotische (bax, caspase 3) en anti-apoptotische (bcl-2) mediatoren zullen worden aangepakt met behulp van kwantitatieve PCR en immunoblot.

   2.4.5 Evaluatie van autofagie: Om vermeende effecten van metaal-NP's op celautofagie te testen, zullen verschillende autofagie-markers worden behandeld. Autofagische flux en p62-niveau zullen worden gedetecteerd door Western-blot, en autofagosomen zullen worden gevisualiseerd door fluorescentiemicroscopie door LC3-positieve puncta63 te tellen.

3. Evaluatie van metalloproteaseniveaus en/of activiteit en biocompatibiliteit van adhesieve nanocomposieten in vivo.

   Premolaren geïndiceerd voor extractie zullen worden hersteld met behulp van traditionele lijm of de zelfklevende nanocomposiet. Na een maand (terugroeping via telefonisch contact en na het onderzoek in de kliniek) worden de patiënten onderzocht en worden premolaren getrokken en geanalyseerd door blinde beoordelaars (gecodeerd door nummers) in alle stadia zoals beschreven. Extracties van premolaren worden uitgevoerd door docenten tandheelkunde, elk effect na de procedure wordt aangenomen en opgelost door het onderzoeksteam, procedures voor patiënten zijn gratis en alles wordt strikt nageleefd volgens de aanbevelingen van de ethische commissie van de faculteit van de tandheelkunde van de universiteit van Chili.

   3.1 In vivo evaluatie van adhesieve nanocomposieten: Zeventig vrijwilligers die om orthodontische redenen extractie van de eerste premolaren rechtsboven en links nodig hebben (n = 35 per groep) zullen worden geselecteerd uit het Orthodontische Specialisatieprogramma in de kliniek van de Universiteit van Chili (er zullen een wervingsperiode van 3 maanden zijn met een medeonderzoeker verantwoordelijk voor monitoring (CI)). Inclusiecriteria zijn (1) behandelplannen die wijzen op premolarenextracties om orthodontische redenen, (2) aanwezigheid van gezonde, intacte, niet-carieuze, niet-herstelde en volledig doorgebroken behandeltanden, en (3) patiënten met een goed gecontroleerde gezondheidstoestand waarmee alle procedures in het onderzoek met minimaal risico kunnen worden uitgevoerd. Uitsluitingscriteria zijn (1) patiënten die niet akkoord gaan met vrijwilligerswerk voor de studie en (2) patiënten die niet aan alle inclusiecriteria voldoen. Een kleine occlusale preparatie zal worden gemaakt door een gekalibreerde operator in het midden van de tand met behulp van een cilinderdiamant boor (.63109/018,Medium Grit (60730025), Dentsply,NY,USA) en een hogesnelheidshandstuk, terwijl lucht-waterspray wordt geleverd met gestandaardiseerde afmetingen van 3x3x5 mm. Nadat de preparatie van de caviteit is voltooid, wordt deze gevuld met harscomposiet (Filtek Supreme; 3M ESPE). De experimentele lijmen gedoteerd met Cu en Zn zullen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant, en de niet-gedoteerde lijm zal worden gebruikt als controle op de homologe bovenste premolaar en ontwerp door eenvoudige randomisatie van parallelle groepen. De harscomposiet (Filtek Supreme; 3M ESPE) wordt aangebracht met behulp van de incrementele techniek en ten slotte wordt één laag lijm aangebracht als een oppervlak voor composietrestauratie en gedurende 10 seconden gepolymeriseerd. De occlusie wordt gecontroleerd en de restauraties worden afgewerkt en gepolijst volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens wordt door middel van polijsten en afwerken een lijmlaag op de uiteindelijke restauratie aangebracht, die gedurende 10 seconden wordt gepolymeriseerd (Raddi Cal, SDI, AU). Een maand nadat de restauraties zijn gemaakt, wordt één tand per keer getrokken. De patiënt krijgt infiltratieve en intraligamentale anesthesie (ongeveer 1,8 ml 2% mepivacaïne (36 mg)) met epinefrine in een verhouding van 1:100.000 (18 mg). Vervolgens worden de tanden getest.

   3.2 Bepaling van antimicrobiële oppervlakte-eigenschappen van adhesieve nanocomposieten: Om de antibacteriële oppervlakte-eigenschappen van gedoteerde adhesieven te beoordelen, wordt een laatste laag adhesieven aangebracht over het uiteindelijke oppervlak van restauraties in een in vivo model. De procedure zal worden gebruikt om het aantal CFU van S.Mutans op composietoppervlakken te beoordelen (hoofdresultaat). Voorafgaand aan het bemonsteren van de biofilm worden trays voorbereid om de biofilm over de restauraties te printen. Voor deze toepassing gebruiken we wegwerpbare fluoride-gel-applicatietrays (Deepak Products Inc., Miami, VS), die elk 30 minuten onder ultraviolet licht worden gesteriliseerd in een bioveiligheidskap (Esco Technologies Inc., Harboro, VS). Elke schaal wordt vervolgens gevuld met 7,5 ml TYCSB-agar (caseïne, gistextract, L-cysteïne, sucrose, bacitracine) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, VS), een selectief medium voor S. mutans. Om de monsterafnametechniek te individualiseren, worden de trays vervolgens zo gesneden dat er niet meer dan 3 tanden in passen. Direct daarna worden de trays in steriele petrischaaltjes geplaatst en in afgesloten plastic zakken in de koelkast bewaard. Voor gebruik worden de trays 24 uur bij 37 °C in een incubator/fornuis (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Korea) geplaatst als kwaliteitscontrolemaatregel. De derde en vierde operator zullen de bemonstering uitvoeren, die zal worden uitgevoerd tussen 11:00-13:00 uur om biofilmreorganisatie mogelijk te maken na het poetsen in de ochtend. De bemonstering zal worden uitgevoerd door een blinde operator die gedurende 20 seconden zachtjes op de plaat drukt over de RC-restauratie, gevolgd door een homologe RC-restauratie met en zonder met Cu of Zn gedoteerde lijm.

   Nadat de monsterschalen in steriele petriplaten zijn bewaard, worden ze getransporteerd bij 4 °C en vervolgens 48 uur geïncubeerd bij 37 °C in een micro-aerofiel (potkaars CO2 10%). De telling van S.mutans zal worden uitgevoerd door de vierde operator die blind zal zijn voor de lade die is gebruikt om de RC-restauraties af te drukken. Later zal Gram-kleuring worden uitgevoerd om de micromorfologie van de kolonies te bepalen. Het aantal S.mutans wordt uitgedrukt in kolonievormende eenheden (CFU) van S.mutans van de platen en bakken met de TYCSB-agar. Geselecteerde kolonies die compatibel zijn met S. mutans-adhesie en morfologische kenmerken zullen worden gesuspendeerd in Todd-Hewitt-bouillon (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, VS) en gedurende 48 uur bij 37 ° C worden geïncubeerd. De kolonies zullen vervolgens worden onderworpen aan biochemische tests om de soort van S. mutans te identificeren en te onderscheiden van S. sobrinus. De biochemische tests omvatten raffinosefermentatie, melibiosefermentatie en esculinehydrolysetests. Een positief resultaat voor alle drie de tests wijst op de aanwezigheid van S. mutans.

   3.3 Beoordeling van metalloproteaseniveaus en/of activiteit in gemacereerd dentineweefsel zal een methode gebruiken die vergelijkbaar is met die in 2.4.2 3.3.1 Zymography voor in situ om activiteiten van MMP's 2 en 9 te beoordelen (resultaat): Een methode beschreven door Mazzoni et al .65 zal worden gebruikt op 20 (n=5 per groep) pas geëxtraheerde niet-carieuze menselijke bovenste premolaren die zijn hersteld door een eerdere procedure. Na verwijdering van het glazuur en cement worden schijven van 1 mm dik midden/diep coronaal dentine verkregen. Een voorraadoplossing van 1,0 mg/ml van met fluoresceïne gemerkte gelatine werd bereid door 1,0 ml water toe te voegen aan de flesjes die het gelyofiliseerde substraat bevatten en tot gebruik bij -20°C te bewaren. De gelatinevoorraadoplossing wordt 1:8 verdund met de verdunningsbuffer (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) en er wordt een antivervagingsmiddel toegevoegd (montagemedium met Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, VK). Een hoeveelheid van 50 μL van het fluorescerende gelatinemengsel wordt bovenop elke plaat geplaatst en afgedekt met een dekglaasje. Objectglaasjes zijn tegen licht beschermd en geïncubeerd in bevochtigde kamers bij 37°C. Voor identificatie van de optimale incubatietijd worden fluorescerende beelden genomen van 1 uur tot 7 dagen. Gedetailleerde beschrijving van de 3D-analyse van in situ zymografie met confocale microscopie. In het kort werd hydrolyse van gedoofd fluoresceïne-geconjugeerd gelatinesubstraat, wat indicatief is voor endogene gelatinolytische enzymactiviteit, beoordeeld door onderzoek onder een multi-foton confocale microscoop (ex: 488nm, en em: lp530nm; Zeiss, LSM 780, Carl Zeiss, Oberkochen , Duitsland). Optische secties van 85 μm dik werden verkregen uit verschillende brandvlakken en de gestapelde beelden werden geanalyseerd, gekwantificeerd en verwerkt met ZEN 2010-software (Carl Zeiss).

   3.4. Bepaling van biocompatibiliteit. Tandpulp zal worden verkregen uit geëxtraheerde premolaren, en moleculaire markers van cellevensvatbaarheid (uitkomsten) of celbeschadiging door hechtende nanocomposieten zullen worden aangepakt.

   Tandpulp zal worden verkregen zoals beschreven door Vaseemuddin66, uit geëxtraheerde premolaren. Totaal RNA zal worden gescheiden en mRNA-niveaus van specifieke apoptose- en autofagiemarkers zullen worden gemeten met qPCR, zoals eerder beschreven (2.4.4-2.4.5).

   3.5 Beoordeling van mechanische eigenschappen (analyse van nanolekkage en graadconversie om de bindingsstabiliteiten (uitkomst) te beoordelen) zal gelijk zijn aan de methoden in 2.1

4. Statistische analyse: Statistische analyse zal worden uitgevoerd met behulp van SPSS 23.0-software (IBM, New York, NY, VS). Vergelijkingen tussen kwantitatieve variabelen (microtreksterkte hechtsterkte, nanolekkage, mate van conversie, aantal CFU) tussen twee onafhankelijke groepen zullen worden geanalyseerd door ongepaarde t-test, ANOVA en pots-hoc-test (of respectieve niet-parametrische tests volgens Shapiro-Wilk testen van gegevensdistributie). Associaties tussen monsterbepalingen zullen worden berekend door Pearson's of Spearman's correlatie. Er is een powerberekening uitgevoerd op basis van gegevens uit een eerdere studie67. Er was een steekproefomvang van minimaal 35 patiënten per groep en per studietak nodig om een ​​verschil met statistische significantie te vinden in een CFU-eindtelling (hoofduitkomst), rekening houdend met een statistisch vermogen van 0,8 op basis van Vildosola et a study64 (1 -β). Significantie zal worden overwogen als de p-waarde is