구리 및 아연 나노입자의 치과용 접착제 내 혼입 효과 (1170575)

일반 목적 구리 또는 아연 나노입자를 치과용 접착제에 혼입하여 항균 작용에 미치는 영향과 상아질 매트릭스 메탈로프로테아제 활성에 미치는 영향을 평가합니다. 접착 기계적 특성 및 생체 적합성 분석 세부 목표

1. 구리 또는 아연 나노입자로 도핑된 치과용 접착제를 개발하고 구조적으로 특성화합니다.

   1.1. 접착성 나노복합체의 제조; 1.2. 접착성 나노복합체의 구조적 특성.

2. 시험관 내 접착성 나노복합체의 기계적, 생화학적 및 기능적 효과를 평가합니다. 제어 접착제의 추가 또는 최근에 뽑은 신선한 치아에 구리 또는 아연이 도핑된 접착제를 비교하는 분석이 다루어질 것입니다.(예: 생체 단계) 2.1. 접착제의 항균 활성을 테스트하기 위해; 2. 2. 매트릭스 메탈로프로테아제 수준 및/또는 활성에 대한 접착성 나노복합체의 영향 연구;2.3. 접착제의 기계적 성질 평가2.4. 생체 적합성을 평가합니다. 1차 배양 치은 섬유아세포의 생존력 분석이 다루어질 것입니다.
3. 생체 내 모델(임상 단계) 항균 특성, 매트릭스 메탈로프로테아제 및 카텝신 B 수준 및/또는 활성, 생체 내 접착 나노복합체의 생체 적합성 및 기계적 특성을 평가합니다. 발치를 위해 지정된 소구치는 기존 접착제 또는 접착성 나노복합재를 사용하여 복원됩니다. 한 달 후 소구치를 추출하고 설명된 대로 분석합니다.

3.1. 접착성 나노복합체의 표면 항균 특성을 결정하기 위해; 3.2. 매트릭스 메탈로프로테아제 및 카텝신 B 수준 및/또는 침연된 상아질 조직의 활성을 평가하기 위해 3.3 생체 적합성을 결정합니다. 치아 치수는 발치된 소구치에서 얻어지며 세포 생존력 또는 세포 손상의 분자 마커는 접착성 나노복합체에서 다루어질 것입니다.3.4 접착제의 기계적 성질을 평가합니다.

행동 양식

1. 구리 또는 아연 나노입자가 도핑된 치과용 접착제 개발. 1.1. 접착성 나노복합체의 제조(1): CuNP/접착성 나노복합체는 1병 접착 시스템 Prime & Bond 2.1(Dentsply Caulk, Milford, DE)을 사용하여 제조될 것이다. 이 아세톤 기반 접착제는 우레탄 디메타크릴레이트와 산성 모노머 디펜타에리트리톨펜타아크릴레이트모노포스페이트의 혼합물을 포함합니다. 접착제 나노복합체를 준비하기 위해 적절한 양의 나노입자 분말(CuNp 및 ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, 칠레)의 무게를 측정하고 일정한 자기 교반 하에 접착제 병에 직접 첨가합니다. 그런 다음 현탁액을 37°C에서 10분 동안 초음파 수조에서 추가로 분산시킵니다. 우리 실험실의 이전 데이터에 따르면 0.015~0.045wt.% 범위의 CuNP 함량으로 접착성 나노복합물이 준비될 것입니다. Cu 및 Zn 도핑된 접착제의 5가지 농도는 0.0150%, 0.0075% 및 0.00038%입니다(이전 데이터(Cu 1-2-3 및 Zn 1-2-3)에 기반한 항균 활성 특성을 가진 농도).

   1.2. 접착성 나노복합재의 구조적 특성화(1): 나노복합재 접착재의 형태 및 구성은 위상차 및 AFM 현미경을 생성하기 위해 후방 산란 전자 모드에서 SEM-EDX로 특성화됩니다. 폴리머 매트릭스의 화학 구조와 잔류 모노머 함량은 감쇠된 전반사 푸리에 변환 적외선 및 라만 분광기로 분석됩니다. 1684 - 1636 cm-1 범위에서 아크릴 모노머의 탄소-탄소 이중 결합 진동을 고려하여 잔류 모노머를 분석합니다.

2. 접착성 나노복합체의 항균, 기계적, 생화학적 및 기능적 효과를 시험관 내 및 생체 외에서 평가합니다. 일반 접착제 또는 구리 또는 아연으로 도핑된 접착제의 추가를 비교하는 분석이 다루어질 것입니다.

   2.1. 접착성 나노복합체의 항균성 분석(2) 2.1.1 항균 활성: 간략하게, 2mm 두께의 10mm 디스크는 수지 복합재(Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN)를 사용하여 제작되고 코팅되지 않은 상태로 두거나(대조군) 접착제 Prime&Bond 2.1로 코팅되고 동등한 실험을 수행합니다. 12개 그룹의 접착제 블렌드를 제조하고 1000mW/cm2의 전력 밀도에서 LED 광 경화 장치(Radii Cal,SDI,AU)를 사용하여 10초 동안 제조업체 권장 사항에 따라 중합했습니다. 아말감 디스크(Contour; Kerr, Orange, CA)는 이전에 설명한 대로 제작되어 추가 양성 대조군으로 사용됩니다. 그룹당 8개의 표본이 있는 총 14개의 연구 그룹이 실험의 이 부분에서 평가됩니다: (1) 대조군; (2) 아말감(양성 대조군처럼 사용되는 금속 물질) 및 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 및 8) Zn3. 중합되지 않은 모노머를 확실히 제거하기 위해 디스크를 10mL 멸균 탈이온수에 담그고 200rpm 및 37.8°C에서 2시간 동안 교반한 다음 디스크를 실온에서 최소 24시간 동안 건조시킵니다. 디스크는 70% 에탄올에서 10분 동안 배양하여 멸균한 다음 최소 48시간 동안 무균 건조합니다. 각 디스크의 표면은 뇌 심장 주입액(BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) 국물에서 혐기성으로 성장한 Streptococcus mutans, ATCC1 25175 mL의 정의된 실행 가능한 농도 100 mL로 접종됩니다. . mL당 콜로니 형성 단위(CFU/ml)로 각 처리 그룹에 대한 생존 세포 농도를 결정하기 위해 접종된 디스크는 회수된 CFU의 총 수가 결정된 후 혐기성으로 처리됩니다.

   2.2. MMP의 활성에 대한 시험관 내 및 생체 외 평가(1-2) 2.2.1 MMP 활성 억제 분석(시험관 내): 정량적 MMP-2, MMP-8 및 MMP-9 활성은 시험관 내 상업적 MMP 형광 측정 분석으로 결정됩니다. 항-MMP 활성을 스크리닝하기 위한 키트(SensoLyte 분석 키트, AnaSpec, San Jose, CA, USA). 다른 농도의 Cu 및 ZnNP 도핑된 접착제와 Cu 또는 ZnNP 접착제가 없는 컨트롤이 반응 버퍼에 추가되고 분석이 제조업체의 권장 사항에 따라 수행됩니다. MMP에 의해 2개의 개별 단편으로 절단되면 5-FAM의 형광이 형광 마이크로플레이트 판독기(Sinergy TM)에 의해 모니터링됩니다.

   2.2.2 MMP 활성 및 수준 결정(도핑된 접착제 및 대조군을 사용하여 수복된 치아에서 얻은 샘플을 사용한 체외 상아질 샘플): 25개(n=5)개의 추출된 우식이 없는 인간 제3대구치가 환자의 정보를 얻은 후 수집됩니다. 동의. 치아는 0.5% 클로라민으로 소독하고 증류수에 보관하며 발치 후 6개월 이내에 사용합니다. 실린더 다이아몬드 버(109/018, Medium Grit(60730025), Dentsply, NY, USA)와 고속 스캐닝 장치를 사용하여 교정된 작업자가 치아 중앙에 3x3x5mm의 표준화된 치수를 가진 작은 교합 프렙을 만듭니다. 공기 물 스프레이를 제공하면서 핸드 피스. 와동 준비가 완료되면 레진 컴포지트(Filtek Supreme; 3M ESPE)로 채워집니다. Cu 및 Zn으로 도핑된 실험 접착제는 제조업체 지침에 따라 사용되며 도핑되지 않은 접착제는 상동 상악 소구치에 대한 대조군으로 사용됩니다. 합성수지(Filtek Supreme; 3M ESPE)는 증분 기법을 사용하여 적용됩니다. 법랑질은 저속 다이아몬드 톱(Remet, Bologna, Italy)으로 식염수 관개 하에 완전히 제거되고 치아는 1mm 두께의 Coronal Dentin wafer를 얻기 위해 절단되며 이후에 분말로 분쇄됩니다. 강철 망치. 상아질 분말은 다음 수용액 중 하나에서 균일하게 분할되고 탈염됩니다(4°C에서 24시간 동안 교반). (1) 0.87M 아세트산, pH = 2.3; (2) 0.26M 시트르산, pH = 2.3; 또는 (3) 0.5M EDTA, pH = 6.4; 또는 (4) 0.5M EGTA, pH = 6.4. 탈회 상아질 분말의 효소 추출은 추출 완충액(5mM CaCl2, 100mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.1% NONIDET P-40, 0.1mM ZnCl2, 0.02% NaN3) 및 EDTA-프리 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). 그런 다음 샘플을 4°C(Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA)에서 각각 10초씩 3회 버스트 동안 40W 출력에서 ​​초음파 처리합니다. 바이알을 4°C에서 30분 동안 18,000rpm에서 원심분리하고 상청액을 수집합니다. 상청액에 존재하는 모든 단백질은 최종 농도 85% 및 pH 7.0을 달성하기 위해 분말형 황산암모늄(w/v)을 첨가하여 4°C에서 침전됩니다. 침전물은 4°C에서 30분 동안 24,000 rpm으로 원심분리하여 수집하고, 추출 버퍼에 10배 희석하여 재용해하고, 추출 버퍼에 대해 밤새 30-kDa 멤브레인을 통해 투석하고, 분석할 때까지 4°C에 보관합니다. 그 후 상아질 분말을 분석하여 젤라틴 자이모그래피로 측정한 MMP-2, MMP-9 및 카텝신 B 활성 수준을 평가하고 이전에 설명한 대로 콜라겐 자이모그래피로 MMP-8을 평가합니다.56 Densitometry는 du(Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA)로 표현됩니다. 간단히 말해서, 상아질 분말 샘플은 1mg/mL의 젤라틴 또는 0.1mg/mL의 콜라겐을 기질로 포함하는 SDS/PAGE 겔에서 비환원 변성 조건 하에서 전기영동됩니다. 그런 다음 2.5% Triton X-100에 두 번 담그고 전개 완충액(20mM Tris pH 7.4 및 5mM CaCl2)에서 17시간 동안 배양하고 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색하고 10% 아세트산 및 20% 메탄올 용액. MMP-2, MMP-8, MMP-9, 카텝신 B 및 ICTP(상아질 콜라겐 가수분해의 마커) 수준은 상업용 ELISA 키트 또는 다중 면역분석법(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, Luminex 기술의 경우) 제조업체의 권장 사항에 따릅니다.

   2.3. 접착성 나노복합체의 기계적 특성 시험(1-2) 결합 강도 2.3.1 치아 선택 및 준비: 우식증이 없는 인간 제3대구치 70개를 추출하여 칠레 대학 치과 진료소의 환자 동의를 얻은 후 수집합니다(≈2000년 3번째). 연간 어금니 추출, 일반적으로 폐기되는 이러한 치아의 가용성 보장). 치아는 0.5% 클로라민으로 소독하고 증류수에 보관하며 발치 후 6개월 이내에 사용합니다. #180 SiC 페이퍼로 교합 법랑질을 습식 연마한 후 평평한 상아질 표면이 노출됩니다. 노출된 상아질 표면은 스미어 레이어를 표준화하기 위해 젖은 #600 SiC 페이퍼로 60초 동안 추가로 연마됩니다.

   2.3.2 실험 설계: 치아를 무작위로 5개의 12개 그룹(접착제당 6개 그룹)으로 할당하고, 각각 다른 농도의 도핑된 접착제로 처리합니다. Prime & Bond 2.1 시스템의 NP가 없는 대조군(Dentsply Caulk, Milford) , DE)가 사용됩니다.

   2.3.3. 수복 절차 및 표본 준비: 접착 시스템은 해당 제조업체의 지침에 따라 엄격하게 적용됩니다.

   2.3.4 본딩 절차 후: 모든 치아는 2mm씩 두 번 증가하는 마이크로 하이브리드 복합 수복물을 받게 됩니다. 각 증분은 1200 mW/cm2 설정(Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australia)에서 LED 광중합 장치를 사용하여 40초 동안 광중합됩니다. 복원된 치아는 24시간 동안 37°C의 증류수에 보관한 다음 저속 다이아몬드 톱(Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) 디지털 캘리퍼(Digimatic Caliper, Mitutoyo, Tokyo, Japan)로 측정할 때 각각 단면적이 약 0.8mm2인 15~20개의 레진-상아질 스틱을 얻습니다. 각 치아의 각 시편은 미세 인장 결합에 대해 평가됩니다. 무작위로 선택된 6개의 레진-상아질 결합 시편을 제외한 강도(mTBS)는 현장 전환율(DC) 및 나노누출(NL) 측정을 위해 나누어질 것입니다.

   2.3.5. Microtensile bond strength test: 레진-상아질 접착 스틱은 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 Geraldeli's jig에 부착되고 실패할 때까지 0.5mm/min의 장력(Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brazil)에서 테스트됩니다. mTBS 값은 파손 시 하중을 단면 접착 면적으로 나누어 계산합니다. 시편의 파손 모드는 응집성(상아질 또는 레진 복합재 내에서만 파손), 접착성(레진/상아질 계면에서의 파손) 또는 혼합(인접 기질의 응집성 파손을 포함한 레진/상아질 계면에서의 파손)으로 분류됩니다. ). 분류는 입체현미경(SZ40; Olympus, Tokyo, Japan)에서 100배 배율로 수행됩니다. 조기 실패(PF)가 있는 표본은 평균에 포함됩니다.

   2.3.6. 현장 변환 정도: 각 치아의 3개의 레진-상아질 접착 스틱을 #1500, #2000 및 #2500 SiC 페이퍼로 습식 연마합니다. 그런 다음 20분 동안 초음파로 세척하고 DC를 측정하기 전에 24시간 동안 37.8°C의 물에 보관합니다. Micro-Raman 분광법 분석은 Senterra 장비(Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Wu¨rttemberg, Germany)를 사용하여 수행됩니다. 마이크로 라만 분광계의 보정은 이를 0으로 재설정한 다음 실리콘 시편의 계수를 측정하여 수행됩니다. 표본은 다음과 같은 마이크로 라만 매개변수를 사용하여 분석됩니다: 532nm에서 20mW 네온 레이저, 3mm에서 공간 분해능, 5cm-1에서 스펙트럼 분해능, 6개의 공동 추가로 30초에서 축적 시간, 110x에서 배율( Olympus UK, London, UK)를 1mm 빔 직경으로 변환합니다. Spectra는 각각의 resin-dentine bonded stick에 대한 intertubular dentine 내의 3개의 다른 위치에서 dentine-adhesive interface에서 측정될 것입니다. 중합되지 않은 접착제의 스펙트럼은 참조로 사용됩니다. 스펙트럼의 후처리는 전용 Opus Spectroscopy 소프트웨어 버전 6.5를 사용하여 수행됩니다. 접착제에서 단량체 대 중합체의 이중 결합 함량 비율이 계산됩니다. 여기서 ''R''은 중합 및 중합되지 않은 접착제에서 1639cm-1 및 1609cm-1에서의 지방족 및 방향족 피크 영역의 비율입니다. 동일한 치아의 모든 레진-상아질 결합 스틱의 제자리 DC는 통계 목적을 위해 평균화됩니다.

   2.3.7. Nanoleakage 평가: 각 치아에서 3개의 레진 결합 스틱을 Tay et al.57이 설명한 프로토콜에 따라 준비된 암모니아 질산은에 넣고 24시간 동안 어두운 곳에 보관합니다. 그런 다음 증류수로 철저히 헹구고 형광등 아래에서 8시간 동안 광 현상 용액에 담가 결합된 계면을 따라 보이드 내에서 은 이온을 금속성 은 입자로 환원시킵니다. 시편은 #600, #1000, #1200, #1500, #2000 및 #2500 SiC 종이와 1mm 및 0.25mm 다이아몬드 페이스트(Buehler Ltd., Lake Bluff, IL)를 사용하여 습식 연마됩니다. 연마 천. 그들은 초음파 세척, 공기 건조, 스터브에 장착되고 탄소-금(MED 010; Balzers Union, Balzers, 리히텐슈타인)으로 코팅됩니다. 레진-상아질 인터페이스는 후방 산란 모드(LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, UK)에서 작동하는 전계 방출 주사 전자 현미경에서 분석됩니다. 각각의 레진-상아질 결합 스틱에 대해 3개의 이미지가 캡처됩니다. 블라인드 연구원이 Image J 소프트웨어58를 사용하여 모든 이미지에서 각 시편의 접착제 및 하이브리드 층 내 NL의 상대적 백분율을 측정합니다. 동일한 시편의 값은 평균화되며 동일한 치아의 모든 스틱의 평균 NL은 평균이 됩니다.

   2.4 1차 배양 치은 섬유아세포의 생체 적합성, 생존력 분석 평가 2.4.1 세포 배양: 인간 섬유아세포의 1차 배양은 체외 이식 방법으로 세 명의 남성 성인 개인의 세 번째 어금니 후구 조직에서 얻습니다.

   조골 세포와 생체 재료 사이의 생체 적합성을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 Saos-2 인간 골육종 세포주는 Alcaide et al.60에 설명된 대로 배양됩니다.

   세포는 웰당 3000개의 세포 밀도로 96웰 플레이트에 시드됩니다. 24시간 후, 대조군 배양 배지는 적절한 접착제(10%, 0.1%, 1%, 0.01%, 0%)의 다른 희석액 100μl로 대체됩니다. 플레이트는 37시간 동안 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양됩니다. °C 인큐베이터(5% CO2) 생존 또는 세포 사멸 분석 이전.

   2.4.2 세포 생존력 및 세포 주기 분석: 인간 섬유아세포의 1차 배양은 3명의 남성 성인 개인의 제3대구치 후구치 조직으로부터 체외이식법에 의해 얻어질 것입니다.

   조골 세포와 생체 재료 사이의 생체 적합성을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 Saos-2 인간 골육종 세포주는 Alcaide et al.60에 설명된 대로 배양됩니다.

   세포는 웰당 3000개의 세포 밀도로 96웰 플레이트에 시드됩니다. 24시간 후, 대조군 배양 배지는 적절한 접착제(10%, 0.1%, 1%, 0.01%, 0%)의 다른 희석액 100μl로 대체됩니다. 플레이트는 37시간 동안 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양됩니다. °C 인큐베이터(5% CO2) 생존 또는 세포 사멸 분석 이전.

   2.4.3 형광 현미경에 의한 생존 가능한 초기 세포사멸, 후기 세포사멸 및 괴사 세포의 정량화: Kasibhatla et al에 의해 기술된 프로토콜이 사용될 것이다 61. 세포는 Acridine Orange/Ethidium Bromide 용액(AO/EB)으로 염색되고 형광 현미경으로 검사됩니다. AO는 살아있는 세포와 죽은 세포를 모두 염색합니다. EB는 막 무결성을 잃은 세포만 염색합니다. 살아있는 세포는 균일하게 녹색으로 나타납니다. 초기 세포 사멸 세포는 염색질 응축 및 핵 분열의 결과로 녹색으로 염색되고 핵에 밝은 녹색 점을 포함합니다. 늦은 세포 사멸 세포는 또한 브롬화 에티 디움을 포함하므로 주황색으로 염색되지만 괴사 세포와 달리 후기 세포 사멸 세포는 응축되고 종종 조각난 핵을 나타냅니다. 괴사 세포는 주황색으로 염색되지만 응축된 염색질이 없는 살아있는 세포와 유사한 핵 형태를 가지고 있습니다.

   2.4.4 포스파티딜세린 노출, DNA 래더링 및 세포사멸 mRNA 및 단백질 정량에 의한 세포사멸의 검출: 원형질막의 외부 표면에 대한 포스파티딜세린의 노출은 아넥신 V(A5)-알로피코시아닌(APC)으로 염색함으로써 세포사멸의 초기 신호로 분석될 것이며, Alcaide et al60에 기술된 바와 같이. 탐침 APC의 형광은 유동 세포측정법으로 분석됩니다.

   아폽토시스 DNA 사다리 분석은 DNA 사다리 키트(Roche, Germany)를 사용하여 수행될 것이다.

   종양 억제인자(p53), 프로-아폽토시스(bax, caspase 3) 및 항-아폽토시스(bcl-2) 매개체에 대한 mRNA 및 단백질 수준은 정량적 PCR 및 면역블롯을 사용하여 해결될 것입니다.

   2.4.5 자가포식 평가: 세포 자가포식에 대한 금속 나노입자의 추정 효과를 테스트하기 위해 다양한 자가포식 마커를 다룰 것입니다. Autophagic 플럭스와 p62 수준은 웨스턴 블롯에 의해 감지되고 autophagosomes는 LC3 양성 puncta63을 계산하여 형광 현미경으로 시각화됩니다.

3. 메탈로프로테아제 수준 및/또는 활성 및 생체 내 접착성 나노복합체의 생체적합성 평가.

   발치를 위해 지정된 소구치는 기존 접착제 또는 접착성 나노복합재를 사용하여 복원됩니다. 한 달 후(전화 연락 및 임상 검사 후), 환자를 검사하고 설명된 모든 단계에서 블라인드 평가자(번호로 코드화됨)가 소구치를 추출하고 분석합니다. 소구치 발치는 치의학 교원이 진행하며, 시술 후 발생하는 모든 영향은 연구팀이 책임지고 해결하며, 환자 시술은 무료이며, 모든 것은 교수진 윤리위원회의 권고를 엄격히 준수합니다. 칠레대학교 치의학박사.

   3.1 접착성 나노복합체의 생체 내 평가: 치아교정을 위해 상악 우측 및 좌측 제1소구치 발치를 필요로 하는 70명의 지원자(그룹당 n = 35명)는 칠레 대학 클리닉의 교정 전문화 프로그램에서 선발됩니다. 모니터링(CB)을 담당하는 공동 연구자와 함께 3개월의 모집 기간이어야 합니다. 포함 기준은 (1) 치열 교정을 위한 소구치 발치를 나타내는 치료 계획, (2) 건강하고 온전하며 충치가 없고 복원되지 않고 완전히 맹출된 치료 치아의 존재 및 (3) 건강 상태가 잘 조절된 환자입니다. 최소한의 위험으로 연구에서 모든 절차를 수행할 수 있습니다. 제외 기준은 (1) 연구 지원에 동의하지 않는 환자 및 (2) 모든 포함 기준을 충족하지 않는 환자입니다. 작은 교합 프렙은 실린더 다이아몬드를 사용하여 치아 중앙에서 보정된 작업자에 의해 이루어집니다. bur(.63109/018,Medium Grit(60730025), Dentsply,NY,USA) 및 고속 핸드피스를 사용하여 3x3x5mm의 표준화된 치수로 공기-물 스프레이를 제공합니다. 와동 준비가 완료되면 레진 컴포지트(Filtek Supreme; 3M ESPE)로 채워집니다. Cu 및 Zn으로 도핑된 실험 접착제는 제조사 지침에 따라 사용될 것이며, 도핑되지 않은 접착제는 평행 그룹의 단순한 무작위화에 의해 동종 상악 소구치 및 디자인에 대한 대조군으로 사용될 것입니다. 레진 컴포지트(Filtek Supreme; 3M ESPE)는 증분 기법을 사용하여 적용되며, 마지막으로 레진 컴포지트 수복물의 표면으로 한 번의 접착제 코팅이 적용되고 10초 동안 중합됩니다. 교합을 확인하고 수복물을 제조업체의 지침에 따라 마무리하고 연마합니다. 그 후, 폴리싱 및 최종 마감 처리를 통해 최종 수복물에 접착제 층을 적용하고 10초 동안 중합합니다(Raddi Cal, SDI, AU). 수복물을 만든 후 한 달 후에 한 번에 하나의 치아를 발치합니다. 환자는 1:100,000(18mg)의 비율로 에피네프린과 함께 침윤성 및 인대내 마취(약 1.8mL 2% 메피바카인(36mg))를 받게 됩니다. 그런 다음 치아에 대한 테스트를 받게 됩니다.

   3.2 접착성 나노복합재의 표면 항균 특성 결정: 도핑된 접착제의 항균 표면 특성을 평가하기 위해 접착제의 최종 층 하나가 생체 내 모델에서 수복물의 최종 표면에 적용됩니다. 이 절차는 복합재 표면에서 S.Mutans의 CFU 수를 평가하는 데 사용됩니다(주요 결과). 생물막을 샘플링하기 전에 수복물 위에 생물막을 인쇄할 수 있는 트레이가 준비됩니다. 이 적용을 위해 우리는 일회용 불소 겔 적용 트레이(Deepak Products Inc., Miami, USA)를 사용할 것이며, 각 트레이는 생물학적 안전 후드(Esco Technologies Inc., Harboro, USA)에서 자외선 아래에서 30분 동안 멸균됩니다. 그런 다음 각 트레이에 S. mutans의 선택 배지인 TYCSB 한천(카제인, 효모 추출물, L-시스테인, 수크로스, 바시트라신)(Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) 7.5ml를 채웁니다. 그 후 샘플 수집 기술을 개별화하기 위해 트레이를 치아 3개 이하에 맞게 절단합니다. 그 직후 트레이를 멸균 페트리 플레이트에 놓고 밀봉된 비닐 백에 담아 냉장고에 보관합니다. 사용 전 트레이는 품질 관리 조치로 37°C에서 24시간 동안 인큐베이터/스토브(ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Korea)에 배치됩니다. 세 번째와 네 번째 작업자는 아침 양치 후 생물막 재구성을 위해 11:00-13:00 사이에 샘플링을 수행합니다. 샘플링은 맹인 작업자가 RC 복원 위에 트레이를 20초 동안 부드럽게 누른 다음 Cu 또는 Zn 도핑 접착제가 있거나 없는 상동 RC 복원에 의해 수행됩니다.

   샘플 트레이를 멸균 페트리 플레이트에 보관한 후 4°C에서 운반한 다음 37°C에서 미호기성(단지 양초 CO2 10%)에서 48시간 동안 배양합니다. S.mutans의 수는 RC 수복물을 인쇄하는 데 사용된 트레이에 눈이 먼 네 번째 작업자가 수행합니다. 나중에 그람 염색을 수행하여 콜로니의 미세 형태를 결정합니다. S.mutans 수는 TYCSB 한천이 있는 플레이트 및 트레이에서 S.mutans의 콜로니 형성 단위(CFU)로 표시됩니다. S.mutans 부착 및 형태학적 특성과 호환되는 콜로니를 선택하여 Todd-Hewitt 국물(Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA)에 현탁시키고 37°C에서 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음 콜로니는 S. mutans 종을 식별하고 S. sobrinus와 구별하기 위해 생화학 테스트를 받게 됩니다. 생화학 시험에는 라피노스 발효, 멜리비오스 발효 및 에스쿨린 가수분해 시험이 포함됩니다. 세 가지 테스트 모두에서 양성 결과는 S. mutans의 존재를 나타냅니다.

   3.3 침연된 상아질 조직에서 메탈로프로테아제 수준 및/또는 활성의 평가는 2.4.2에서와 유사한 방법론을 사용합니다. .65는 이전 절차로 수복된 20개(그룹당 n=5)의 신선하게 발치된 비 우식 인간 상악 소구치에 사용됩니다. 법랑질과 백악질을 제거한 후, 1mm 두께의 중간/깊은 치관 상아질 디스크를 얻을 수 있습니다. 1.0mg/mL의 플루오레세인-표지 젤라틴 스톡 용액은 동결건조된 기질을 함유하는 바이알에 1.0mL의 물을 첨가하고 사용하기 전까지 -20℃에서 보관함으로써 제조되었다. 젤라틴 스톡 용액을 희석 완충액(NaCl 150mM, CaCl2 5mM, Tris-HCl 50mM, pH 8.0)으로 1:8로 희석하고 변색 방지제를 첨가한다(Mounting Medium with Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, 영국 케임브리지셔). 50μL 양의 형광 젤라틴 혼합물을 각 슬래브 위에 놓고 커버슬립으로 덮습니다. 슬라이드는 빛으로 보호되며 37°C의 가습 챔버에서 배양됩니다. 최적의 잠복기 확인을 위해 1시간에서 7일까지 형광 이미지를 촬영합니다. 공초점 현미경을 사용한 현장 자이모그래피의 3D 분석에 대한 자세한 설명. 간략하게, 내인성 젤라틴 분해 효소 활성을 나타내는 켄칭된 플루오레세인-접합 젤라틴 기질의 가수분해를 다광자 공초점 현미경(예: 488nm 및 em: lp530nm; Zeiss, LSM 780, Carl Zeiss, Oberkochen)으로 검사하여 평가했습니다. , 독일). 85μm 두께의 광학 섹션은 서로 다른 초점면에서 획득되었으며, 스택 이미지는 ZEN 2010 소프트웨어(Carl Zeiss)로 분석, 정량화 및 처리되었습니다.

   3.4. 생체 적합성 결정. 발치된 소구치로부터 치수를 얻고 접착성 나노복합체에 의한 세포 생존력(결과) 또는 세포 손상의 분자 마커를 다룰 것입니다.

   Vaseemuddin66에 설명된 대로 발치된 소구치에서 치아 치수를 얻습니다. 전체 RNA가 분리되고 특정 세포사멸 및 autophagy 마커의 mRNA 수준이 이전에 설명한 대로 qPCR에 의해 측정됩니다(2.4.4-2.4.5).

   3.5 기계적 특성의 평가(결합 안정성(결과)를 평가하기 위한 나노 누출 및 정도 변환 분석)는 2.1의 방법과 동일합니다.

4. 통계 분석: 통계 분석은 SPSS 23.0 소프트웨어(IBM, New York, NY, USA)를 사용하여 수행됩니다. 두 독립 그룹 간의 정량적 변수(마이크로인장 결합 강도, 나노누설, 전환 정도, CFU 수) 간의 비교는 unpaired t 테스트, ANOVA 및 pots-hoc 테스트(또는 Shapiro-Wilk에 따른 각각의 비모수 테스트)로 분석됩니다. 데이터 분포 테스트). 샘플 측정 간의 연관성은 Pearson 또는 Spearman의 상관 관계로 계산됩니다. 전력 계산은 이전 연구67의 데이터를 사용하여 수행되었습니다. Vildosola 등의 연구64(1 -β). p 값이 다음과 같은 경우 유의성이 고려됩니다.