Effetto dell'incorporazione di nanoparticelle di rame e zinco negli adesivi dentali (1170575)

Obiettivo generale Valutare l'influenza dell'incorporazione di nanoparticelle di rame o zinco in un adesivo dentale sulla sua azione antimicrobica e la loro influenza sull'attività delle metalloproteasi della matrice dentinale. Analizzare le proprietà meccaniche e la biocompatibilità degli adesivi Obiettivi specifici

1. Sviluppare e caratterizzare strutturalmente un adesivo dentale drogato con nanoparticelle di rame o zinco.

   1.1. Preparazione di nanocompositi adesivi; 1.2. Caratterizzazione strutturale di nanocompositi adesivi.

2. Valutare gli effetti meccanici, biochimici e funzionali dei nanocompositi adesivi in ​​vitro. Saranno affrontati i test confrontando l'aggiunta dell'adesivo di controllo o l'adesivo drogato con rame o zinco su denti freschi estratti di recente. (es. fase vivo) 2.1. Testare l'attività antimicrobica dell'adesivo; 2. 2. Studiare l'influenza dei nanocompositi adesivi sui livelli e/o sull'attività delle metalloproteasi di matrice; 2.3. Valutare le proprietà meccaniche dell'adesivo;2.4. Per valutare la biocompatibilità. Saranno affrontati i saggi di vitalità in fibroblasti gengivali coltivati ​​primari.
3. Valutare le proprietà antimicrobiche del modello in vivo (fase clinica), i livelli e/o l'attività delle metalloproteasi di matrice e della catepsina B, la biocompatibilità dei nanocompositi adesivi in ​​vivo e le proprietà meccaniche. I premolari indicati per l'estrazione saranno restaurati utilizzando l'adesivo tradizionale o il nanocomposito adesivo. Dopo un mese, i premolari verranno estratti e analizzati come descritto.

3.1. Determinare le proprietà antimicrobiche superficiali dei nanocompositi adesivi; 3.2. Valutare i livelli e/o l'attività delle metalloproteasi della matrice e della catepsina B nel tessuto dentinale macerato;3.3 Per determinare la biocompatibilità. La polpa dentale sarà ottenuta dai premolari estratti e verranno affrontati i marcatori molecolari della vitalità cellulare o del danno cellulare dei nanocompositi adesivi;3.4 Valutare le proprietà meccaniche dell'adesivo.

METODI

1. Sviluppare un adesivo dentale drogato con nanoparticelle di rame o zinco. 1.1. Preparazione di nanocompositi adesivi (1): CuNP/nanocompositi adesivi saranno preparati utilizzando il sistema adesivo a una bottiglia Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Questo adesivo a base di acetone contiene una miscela di uretano dimetacrilato e monomero acido dipentaeritritolpentaacrilatomonofosfato. Per preparare i nanocompositi adesivi, quantità adeguate di polvere di nanoparticelle (CuNp e ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Cile) saranno pesate e aggiunte direttamente alla bottiglia di adesivo sotto costante agitazione magnetica. La sospensione sarà poi ulteriormente dispersa in un bagno ad ultrasuoni a 37°C per 10 minuti. I nanocompositi adesivi saranno preparati con un contenuto di CuNP compreso tra 0,015 e 0,045% in peso in base ai dati precedenti dei nostri laboratori. Le cinque concentrazioni di adesivi drogati con Cu e Zn saranno 0,0150%, 0,0075% e 0,00038% (concentrazioni con proprietà attive antibatteriche basate sui nostri dati precedenti (Cu 1-2-3 e Zn 1-2-3).

   1.2. Caratterizzazione strutturale di nanocompositi adesivi (1): La morfologia e la composizione dei materiali adesivi nanocompositi saranno caratterizzate mediante SEM-EDX in modalità elettronica retrodiffusa per produrre contrasto di fase e microscopia AFM. La struttura chimica della matrice polimerica e il contenuto monomerico residuo saranno analizzati mediante spettroscopie infrarosse in trasformata di Fourier attenuata e spettroscopie Raman. Il monomero residuo sarà analizzato considerando la vibrazione del doppio legame carbonio-carbonio del monomero acrilico nell'intervallo 1684 - 1636 cm-1.

2. Valutare gli effetti antibatterici, meccanici, biochimici e funzionali dei nanocompositi adesivi in ​​vitro ed ex vivo. Saranno affrontati i saggi confrontando l'aggiunta di adesivo normale o l'adesivo drogato con rame o zinco.

   2.1. Analisi delle proprietà antimicrobiche del nanocomposito adesivo (2) 2.1.1 Attività antibatterica: in breve, i dischi da 10 mm di 2 mm di spessore saranno fabbricati utilizzando un composito di resina (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) e lasciati non rivestiti (controllo) o rivestiti con l'adesivo Prime&Bond 2.1, ed equivalente sperimentale miscele adesive di dodici gruppi e polimerizzate secondo le raccomandazioni del produttore per 10 secondi utilizzando un'unità di fotopolimerizzazione a LED (Radii Cal, SDI, AU) a una densità di potenza di 1000 mW/cm2. I dischi di amalgama (Contour; Kerr, Orange, CA) saranno fabbricati come precedentemente descritto e utilizzati come ulteriore controllo positivo. In questa parte dell'esperimento verrà valutato un totale di quattordici gruppi di studio con otto campioni per gruppo: (1) controllo; (2) amalgama (materiale metallico usato come controllo positivo) e 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 e 8) Zn3. Per garantire la rimozione del monomero non polimerizzato, i dischi saranno immersi in 10 mL di acqua deionizzata sterile e agitati per 2 ore a 200 rpm e 37,8°C, dopodiché i dischi saranno lasciati asciugare a temperatura ambiente per almeno 24 ore. I dischi saranno sterilizzati mediante incubazione in etanolo al 70% per 10 minuti e poi asciugati asetticamente per un minimo di 48 ore. La superficie di ciascun disco sarà inoculata con 100 mL di una concentrazione vitale definita di 1 108 cellule/mL di Streptococcus mutans, ATCC1 25175 coltivato anaerobicamente in brodo di infusione cuore-cervello (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) . Per determinare la concentrazione di cellule vitali per ciascun gruppo di trattamento in unità formanti colonia per mL (CFU/ml), i dischi inoculati saranno anaerobicamente dopodiché verrà determinato il numero totale di CFU recuperate.

   2.2. Valutazione in vitro ed ex vivo dell'attività delle MMP (1-2) 2.2.1 Saggio di inibizione dell'attività delle MMP (in vitro): l'attività quantitativa di MMP-2, MMP-8 e MMP-9 in vitro sarà determinata mediante saggio fluorometrico MMP commerciale kit (kit di analisi SensoLyte; AnaSpec, San Jose, CA, USA) per lo screening dell'attività anti-MMP. Adesivi drogati con Cu e ZnNP a diverse concentrazioni e controlli senza adesivi con Cu o ZnNP saranno aggiunti al tampone di reazione e il test sarà eseguito secondo le raccomandazioni del produttore. Dopo la scissione in 2 frammenti separati mediante MMP, la fluorescenza di 5-FAM sarà monitorata da un lettore di micropiastre fluorescente (Sinergy TM).

   2.2.2 Determinazione dell'attività e dei livelli di MMP (campioni di dentina ex vivo con campioni ottenuti da denti restaurati con adesivi drogati e controllo): Saranno raccolti venticinque (n=5) terzi molari umani privi di carie dopo aver informato i pazienti consenso. I denti saranno disinfettati in cloramina allo 0,5%, conservati in acqua distillata e utilizzati entro sei mesi dall'estrazione. Una piccola preparazione occlusale con dimensioni standardizzate di 3x3x5 mm verrà eseguita da un operatore calibrato al centro del dente utilizzando una fresa diamantata cilindrica (109/018, grana media (60730025), Dentsply, NY, USA) e una fresa ad alta velocità manipolo erogando getto aria-acqua. Dopo aver completato la preparazione della cavità, questa verrà riempita con resina composita (Filtek Supreme; 3M ESPE). Gli adesivi sperimentali drogati con Cu e Zn saranno usati secondo le istruzioni del produttore, e l'adesivo non drogato sarà usato come controllo su un premolare superiore omologo. La resina composita (Filtek Supreme; 3M ESPE) verrà applicata utilizzando la tecnica incrementale. Lo smalto sarà completamente rimosso con una sega diamantata a bassa velocità (Remet, Bologna, Italia) sotto irrigazione salina, e i denti saranno sezionati per ottenere wafer di dentina coronale dello spessore di 1 mm, che saranno successivamente polverizzati in polvere con un martello d'acciaio. La polvere di dentina sarà quindi equamente suddivisa e demineralizzata (a 4°C per 24 ore sotto agitazione) in una delle seguenti soluzioni acquose: (1) acido acetico 0,87 M, pH = 2,3; (2) acido citrico 0,26 M, pH = 2,3; o (3) EDTA 0,5 M, pH = 6,4; o (4) EGTA 0,5 M, pH = 6,4. L'estrazione enzimatica della polvere di dentina demineralizzata sarà sospesa nel tampone di estrazione (50 mM Tris-HCl, pH 6.0, contenente 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.1% NONIDET P-40, 0.1 mM ZnCl2, 0,02% NaN3) e cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). I campioni verranno quindi trattati ad ultrasuoni a 40 W di uscita per 3 burst di 10 secondi ciascuno a 4°C (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA). Le fiale saranno centrifugate a 18.000 rpm per 30 min a 4°C, ed i supernatanti saranno raccolti. Tutte le proteine ​​presenti nei surnatanti saranno precipitate a 4°C mediante l'aggiunta di solfato di ammonio in polvere (p/v) per ottenere una concentrazione finale dell'85% e pH 7.0. Il precipitato sarà raccolto mediante centrifugazione a 24.000 rpm per 30 minuti a 4°C, ridisciolto in una diluizione 10 volte in tampone di estrazione, dializzato attraverso una membrana da 30 kDa contro tampone di estrazione durante la notte e conservato a 4°C fino all'analisi. Successivamente, la polvere di dentina verrà analizzata per valutare i livelli di attività di MMP-2, MMP-9 e catepsina B misurati mediante zimografia della gelatina e per valutare MMP-8 mediante zimografia del collagene, come descritto in precedenza.56 La densitometria sarà espressa come du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA). In breve, campioni di dentina in polvere saranno sottoposti ad elettroforesi in condizioni denaturanti non riducenti in gel SDS/PAGE contenenti 1 mg/mL di gelatina o 0.1 mg/mL di collagene come substrati. Saranno quindi immersi due volte in Triton X-100 al 2,5% e incubati per 17 ore in tampone di sviluppo (Tris 20 mM pH 7,4 e CaCl2 5 mM), colorati con Coomassie Brilliant Blue R-250 e decolorati con acido acetico al 10% e Soluzione di metanolo al 20%. I livelli di MMP-2, MMP-8, MMP-9, catepsina B e ICTP (come marker dell'idrolisi del collagene dentinale) saranno determinati mediante un kit ELISA commerciale o saggi immunologici multiplex (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, per la tecnologia Luminex) secondo le raccomandazioni del produttore.

   2.3. Test delle proprietà meccaniche dei nanocompositi adesivi (1-2) Forza di adesione 2.3.1 Selezione e preparazione dei denti: Settanta terzi molari umani estratti senza carie saranno raccolti dopo aver ottenuto il consenso informato dei pazienti della clinica odontoiatrica dell'Università del Cile (≈2000 terzi estrazioni molari all'anno, garantendo la disponibilità di questi denti che normalmente vengono scartati). I denti saranno disinfettati in cloramina allo 0,5%, conservati in acqua distillata e utilizzati entro sei mesi dall'estrazione. Una superficie piatta della dentina verrà esposta dopo la molatura a umido dello smalto occlusale con una carta SiC n. 180. Le superfici della dentina esposte verranno ulteriormente lucidate con una carta SiC n. 600 bagnata per 60 secondi per standardizzare lo smear layer.

   2.3.2 Disegno sperimentale: i denti saranno assegnati casualmente in dodici gruppi di cinque (6 gruppi per adesivo), ognuno dei quali sarà trattato con una diversa concentrazione di adesivo drogato. Come controllo senza NP del sistema Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE) verrà utilizzato.

   2.3.3. Procedura di restauro e preparazione del campione: i sistemi adesivi verranno applicati rigorosamente in conformità con le istruzioni del rispettivo produttore.

   2.3.4 Dopo le procedure di bonding: tutti i denti riceveranno un restauro in composito micro ibrido in due incrementi di 2 mm. Ogni incremento verrà fotopolimerizzato per 40 secondi utilizzando un'unità di fotopolimerizzazione a LED con impostazione di 1200 mW/cm2 (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australia). I denti restaurati saranno conservati in acqua distillata a 37°C per 24 ore e quindi sezionati longitudinalmente nelle direzioni mesio-distale e buccale-linguale attraverso l'interfaccia adesiva utilizzando una sega diamantata a bassa velocità (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) per ottenere da 15 a 20 bastoncini resina-dentina, ciascuno con un'area della sezione trasversale di circa 0,8 mm2 misurata con un calibro digitale (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokyo, Giappone). Ogni campione di ciascun dente sarà valutato per il legame microtensile forza (mTBS) ad eccezione di sei campioni di legame resina-dentina selezionati casualmente, che saranno divisi per la misurazione del grado di conversione in situ (DC) e della nanoinfiltrazione (NL).

   2.3.5. Test di forza del legame microtensile: bastoncini legati resina-dentina saranno attaccati a un jig di Geraldeli utilizzando adesivo cianoacrilato e testati sotto tensione (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brasile) a 0,5 mm/min fino al fallimento. I valori mTBS saranno calcolati dividendo il carico a rottura per l'area di incollaggio della sezione trasversale. La modalità di rottura dei campioni sarà classificata come coesiva (rottura esclusivamente all'interno della dentina o del composito di resina), adesiva (rottura all'interfaccia resina/dentina) o mista (rottura all'interfaccia resina/dentina inclusa rottura coesiva dei substrati adiacenti ). La classificazione sarà eseguita con uno stereomicroscopio (SZ40; Olympus, Tokyo, Giappone) a 100 ingrandimenti. I campioni con guasti prematuri (PF) saranno inclusi nella media.

   2.3.6. Grado di conversione in situ: tre bastoncini legati con resina-dentina da ciascun dente saranno lucidati a umido con carta SiC n. 1500, n. 2000 e n. 2500. Saranno quindi puliti a ultrasuoni per 20 minuti e conservati in acqua a 37,8°C per 24 ore prima di misurare la DC. L'analisi della spettroscopia Micro-Raman sarà eseguita utilizzando apparecchiature Senterra (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Wurttemberg, Germania). La calibrazione dello spettrometro micro-Raman sarà eseguita azzerandolo e quindi misurando il coefficiente di un campione di silicio. I campioni saranno analizzati utilizzando i seguenti parametri micro-Raman: laser al neon da 20 mW a 532 nm, risoluzione spaziale a 3 mm, risoluzione spettrale a 5 cm-1, tempo di accumulo a 30 secondi con 6 co-addizioni e ingrandimento a 110x ( Olympus UK, London, UK) a un raggio di 1 mm di diametro. Gli spettri saranno prelevati all'interfaccia dentina-adesivo in tre diversi siti all'interno della dentina intertubulare per ogni stick legato resina-dentina. Spettri di adesivi non polimerizzati saranno utilizzati come riferimento. La post-elaborazione degli spettri sarà eseguita utilizzando il software dedicato Opus Spectroscopy versione 6.5. Verrà calcolato il rapporto tra il contenuto di doppi legami di monomero e polimero nell'adesivo: dove ''R'' è il rapporto tra le aree dei picchi alifatici e aromatici a 1639 cm-1 e 1609 cm-1 negli adesivi polimerizzati e non polimerizzati. La DC in situ di tutti gli stick legati resina-dentina dello stesso dente verrà calcolata come media a fini statistici.

   2.3.7. Valutazione della nanoinfiltrazione: tre bastoncini legati con resina da ciascun dente saranno posti in nitrato d'argento ammoniacale preparato secondo il protocollo descritto da Tay et al.57 e conservati al buio per 24 ore. Saranno quindi risciacquati accuratamente in acqua distillata e immersi in una soluzione di fotosviluppo per 8 ore sotto una luce fluorescente per ridurre gli ioni d'argento in grani d'argento metallico all'interno dei vuoti lungo l'interfaccia legata. I campioni saranno lucidati a umido con carta SiC n. 600, n. 1000, n. 1200, n. 1500, n. 2000 e n. panno per lucidare. Saranno puliti ad ultrasuoni, asciugati all'aria, montati su stub e rivestiti con carbonio-oro (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). Le interfacce resina-dentina saranno analizzate in un microscopio elettronico a scansione ad emissione di campo operato in modalità backscattered (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, UK). Verranno acquisite tre immagini di ciascun bastoncino legato resina-dentina. La percentuale relativa di NL all'interno degli strati adesivo e ibrido in ciascun campione sarà misurata in tutte le immagini utilizzando il software Image J58 da un ricercatore in cieco. Verrà calcolata la media dei valori dello stesso campione e la media NL di tutti i bastoncini dello stesso dente sarà media.

   2.4 Valutazione della biocompatibilità, saggi di vitalità in fibroblasti gengivali in coltura primaria 2.4.1 Colture cellulari: colture primarie di fibroblasti umani saranno ottenute con il metodo dell'espianto, dal tessuto retromolare dei terzi molari di tre individui maschi adulti.

   La linea cellulare di osteosarcoma umano Saos-2, comunemente usata per valutare la biocompatibilità tra osteoblasti e biomateriali, sarà coltivata come descritto da Alcaide et al.60.

   Le cellule saranno seminate in una piastra a 96 pozzetti ad una densità di 3000 cellule per pozzetto. Dopo 24h, il terreno di coltura di controllo sarà sostituito da 100 µl di diverse diluizioni dell'adesivo appropriato (10%, 0.1%, 1%, 0.01%, 0%). Le piastre saranno incubate per 24h, 48h e 72h in un 37 Incubatore °C (5%CO2) prima dei test di vitalità o morte cellulare.

   2.4.2 Vitalità cellulare e analisi del ciclo cellulare: Colture primarie di fibroblasti umani saranno ottenute con il metodo dell'espianto, dal tessuto retromolare dei terzi molari di tre individui maschi adulti.

   La linea cellulare di osteosarcoma umano Saos-2, comunemente usata per valutare la biocompatibilità tra osteoblasti e biomateriali, sarà coltivata come descritto da Alcaide et al.60.

   Le cellule saranno seminate in una piastra a 96 pozzetti ad una densità di 3000 cellule per pozzetto. Dopo 24h, il terreno di coltura di controllo sarà sostituito da 100 µl di diverse diluizioni dell'adesivo appropriato (10%, 0.1%, 1%, 0.01%, 0%). Le piastre saranno incubate per 24h, 48h e 72h in un 37 Incubatore °C (5%CO2) prima dei test di vitalità o morte cellulare.

   2.4.3 Quantificazione di cellule vitali, apoptotiche precoci, apoptotiche tardive e necrotiche mediante microscopia a fluorescenza: verrà utilizzato il protocollo descritto da Kasibhatla et al 61. Le cellule saranno colorate con una soluzione di Arancio di Acridina/Etidio Bromuro (AO/EB) e saranno esaminate mediante microscopia a fluorescenza. L'AO colora sia le cellule vive che quelle morte. EB macchierà solo le cellule che hanno perso l'integrità della membrana. Le cellule vive appariranno uniformemente verdi. Le prime cellule apoptotiche si colorano di verde e contengono punti verde brillante nei nuclei come conseguenza della condensazione della cromatina e della frammentazione nucleare. Le cellule apoptotiche tardive incorporeranno anche il bromuro di etidio e quindi si coloreranno di arancione, ma, a differenza delle cellule necrotiche, le cellule apoptotiche tardive mostreranno nuclei condensati e spesso frammentati. Le cellule necrotiche si colorano di arancione, ma hanno una morfologia nucleare simile a quella delle cellule vitali, senza cromatina condensata61.

   2.4.4 Rilevazione dell'apoptosi mediante esposizione alla fosfatidilserina, DNA laddering e quantificazione di mRNA e proteine ​​apoptotiche: l'esposizione della fosfatidilserina sulla superficie esterna della membrana plasmatica sarà analizzata come segnale precoce di apoptosi mediante colorazione con annessina V (A5)-alloficocianina (APC), come descritto in Alcaide et al60. La fluorescenza della sonda APC sarà analizzata mediante citometria a flusso.

   L'analisi del DNA ladder apoptotico sarà effettuata utilizzando un DNA ladder Kit (Roche, Germania).

   I livelli di mRNA e proteine ​​per i mediatori oncosoppressori (p53), pro-apoptotici (bax, caspase 3) e anti-apoptotici (bcl-2) saranno valutati mediante PCR quantitativa e immunoblot.

   2.4.5 Valutazione dell'autofagia: per testare gli effetti presunti delle NP metalliche sull'autofagia cellulare, verranno affrontati diversi marcatori di autofagia. Il flusso autofagico e il livello di p62 saranno rilevati mediante western blot, e gli autofagosomi saranno visualizzati mediante microscopia a fluorescenza contando puncta63 LC3 positivo.

3. Valutazione dei livelli e/o attività di metalloproteasi e biocompatibilità di nanocompositi adesivi in ​​vivo.

   I premolari indicati per l'estrazione saranno restaurati utilizzando l'adesivo tradizionale o il nanocomposito adesivo. Dopo un mese (richiamo per contatto telefonico e dopo la visita clinica), i pazienti saranno esaminati e i premolari saranno estratti e analizzati da valutatori ciechi (codificati da numeri) in tutte le fasi come descritto. Le estrazioni dei premolari saranno condotte da insegnanti di odontoiatria, qualsiasi effetto post-procedura sarà assunto e risolto dal gruppo di ricerca, le procedure per i pazienti sono gratuite e tutto sarà rigorosamente rispettato le raccomandazioni del comitato etico della facoltà di odontoiatria dell'università del Cile.

   3.1 Valutazione in vivo di nanocompositi adesivi: Settanta volontari che richiedono l'estrazione dei primi premolari superiori destro e sinistro (n = 35 per gruppo) per motivi ortodontici saranno selezionati dal Programma di specializzazione in ortodonzia nella clinica dell'Università del Cile (ci saranno essere un periodo di reclutamento di 3 mesi con un co-ricercatore responsabile del monitoraggio (CB)). I criteri di inclusione saranno (1) piani di trattamento che indichino estrazioni premolari per motivi ortodontici, (2) presenza di denti sani, intatti, non cariati, non restaurati e completamente erotti e (3) pazienti con condizioni di salute ben controllate che consentono di eseguire tutte le procedure nella ricerca con il minimo rischio. I criteri di esclusione saranno (1) i pazienti che non accettano di fare volontariato per lo studio e (2) i pazienti che non soddisfano tutti i criteri di inclusione. Una piccola preparazione occlusale verrà eseguita da un operatore calibrato al centro del dente utilizzando un diamante cilindrico fresa (.63109/018,Medium Grit (60730025), Dentsply,NY,USA) e un manipolo ad alta velocità fornendo allo stesso tempo uno spray aria-acqua con dimensioni standardizzate di 3x3x5 mm. Dopo aver completato la preparazione della cavità, questa verrà riempita con resina composita (Filtek Supreme; 3M ESPE). Gli adesivi sperimentali drogati con Cu e Zn saranno usati secondo le istruzioni del produttore, e l'adesivo non drogato sarà usato come controllo sul premolare superiore omologo e disegnato mediante semplice randomizzazione di gruppi paralleli. La resina composita (Filtek Supreme; 3M ESPE) verrà applicata utilizzando la tecnica incrementale e, infine, uno strato di adesivo verrà applicato come superficie del restauro in composito e polimerizzato per 10 sec. Verrà controllata l'occlusione e i restauri saranno rifiniti e lucidati seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, la lucidatura e la rifinitura finale serviranno per applicare uno strato di adesivo sul restauro finale, che sarà polimerizzato per 10 secondi (Raddi Cal, SDI, AU). Verrà estratto un dente alla volta un mese dopo la realizzazione dei restauri. Il paziente riceverà anestesia infiltrativa e intralegamentosa (circa 1,8 ml di mepivacaina al 2% (36 mg)) con epinefrina in un rapporto di 1:100.000 (18 mg). Quindi, i denti saranno sottoposti a test.

   3.2 Determinazione delle proprietà antimicrobiche della superficie dei nanocompositi adesivi: per valutare le proprietà della superficie antibatterica degli adesivi drogati, uno strato finale di adesivi verrà applicato sulla superficie finale dei restauri in un modello in vivo. La procedura sarà utilizzata per valutare il numero di CFU di S.Mutans su superfici composite (Main Outcome). Prima del campionamento del biofilm, i vassoi saranno preparati per stampare il biofilm sui restauri. Per questa applicazione, utilizzeremo vassoi di applicazione di gel al fluoro usa e getta (Deepak Products Inc., Miami, USA), ognuno dei quali sarà sterilizzato in una cappa di biosicurezza (Esco Technologies Inc., Harboro, USA) sotto luce ultravioletta per 30 minuti. Ciascun vassoio verrà quindi caricato con 7,5 ml di agar TYCSB (caseina, estratto di lievito, L-cisteina, saccarosio, bacitracina) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA), che è un terreno selettivo per S. mutans. Successivamente, per individuare la tecnica di raccolta del campione, i vassoi verranno tagliati per adattarsi a non più di 3 denti. Subito dopo, i vassoi verranno posti in piastre di Petri sterili e conservati in sacchetti di plastica sigillati in frigorifero. Prima dell'uso, i vassoi verranno posti in un'incubatrice/stufa (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Corea) per 24 ore a 37 °C come misura di controllo della qualità. Il terzo e il quarto operatore eseguiranno il campionamento, che sarà condotto tra le 11:00 e le 13:00 per consentire la riorganizzazione del biofilm dopo la spazzolatura mattutina. Il campionamento sarà eseguito da un operatore cieco premendo delicatamente il vassoio per 20 s sopra il restauro in RC, seguito da un restauro in RC omologo con e senza adesivo drogato con Cu o Zn.

   Dopo che i vassoi dei campioni sono stati conservati in piastre di Petri sterili, saranno trasportati a 4 °C e quindi incubati a 37 °C in un microaerofilo (candela in barattolo CO2 10%) per 48 ore. Il conteggio di S.mutans sarà eseguito dal quarto operatore che sarà accecato dal vassoio utilizzato per stampare i restauri RC. Successivamente, verrà eseguita la colorazione di Gram per determinare la micromorfologia delle colonie. La conta di S.mutans sarà espressa in unità formanti colonia (CFU) di S.mutans dalle piastre e dai vassoi con l'agar TYCSB. Le colonie selezionate che saranno compatibili con l'adesione e le caratteristiche morfologiche di S.mutans saranno sospese in brodo Todd-Hewitt (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) e incubate a 37 °C per 48 ore. Le colonie saranno poi sottoposte a test biochimici per identificare la specie di S. mutans e distinguerla da S. sobrinus. I test biochimici includono la fermentazione del raffinosio, la fermentazione del melibiosio e i test di idrolisi dell'esculina. Un risultato positivo per tutti e tre i test indica la presenza di S. mutans.

   3.3 La valutazione dei livelli e/o dell'attività delle metalloproteasi nel tessuto dentinale macerato utilizzerà una metodologia simile a quella in 2.4.2 3.3.1 Zymography per in situ per valutare le attività delle MMP 2 e 9 (risultato): un metodo descritto da Mazzoni et al .65 sarà utilizzato su 20 (n=5 per gruppo) premolari superiori umani non cariati appena estratti restaurati con una precedente procedura. Dopo la rimozione dello smalto e del cemento si otterranno dei dischi di dentina coronale medio/profonda dello spessore di 1 mm. Una soluzione madre da 1,0 mg/mL di gelatina marcata con fluoresceina è stata preparata aggiungendo 1,0 mL di acqua alle fiale contenenti il ​​substrato liofilizzato e conservando a -20°C fino all'uso. La soluzione madre di gelatina viene diluita 1:8 con il tampone di diluizione (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) e viene aggiunto un agente anti-sbiadimento (mezzo di montaggio con Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, Regno Unito). Una quantità di 50 μL della miscela di gelatina fluorescente viene posta sopra ogni lastra e coperta con un coprioggetto. I vetrini sono protetti dalla luce e incubati in camere umidificate a 37°C. Per l'identificazione del periodo di incubazione ottimale, le immagini fluorescenti vengono acquisite da 1 ora a 7 giorni. Descrizione dettagliata dell'analisi 3D della zimografia in situ con microscopia confocale. In breve, l'idrolisi del substrato di gelatina coniugato con fluoresceina spenta, che è indicativa dell'attività enzimatica gelatinolitica endogena, è stata valutata mediante esame al microscopio confocale multi-fotone (es: 488nm, e em: lp530nm; Zeiss, LSM 780, Carl Zeiss, Oberkochen , Germania). Sezioni ottiche di 85 μm di spessore sono state acquisite da diversi piani focali e le immagini impilate sono state analizzate, quantificate ed elaborate con il software ZEN 2010 (Carl Zeiss).

   3.4. Determinazione della biocompatibilità. La polpa dentale sarà ottenuta dai premolari estratti e verranno affrontati i marcatori molecolari della vitalità cellulare (risultati) o del danno cellulare da parte dei nanocompositi adesivi.

   La polpa dentale sarà ottenuta come descritto da Vaseemuddin66, dai premolari estratti. L'RNA totale sarà separato ei livelli di mRNA di marcatori specifici di apoptosi e autofagia saranno misurati mediante qPCR, come precedentemente descritto (2.4.4-2.4.5).

   3.5 La valutazione delle proprietà meccaniche (analisi delle nanoinfiltrazioni e della conversione dei gradi per valutare le stabilità del legame (risultato)) sarà uguale ai metodi in 2.1

4. Analisi statistica: l'analisi statistica verrà eseguita utilizzando il software SPSS 23.0 (IBM, New York, NY, USA). I confronti tra le variabili quantitative (forza di legame microtensile, nanoleakage, grado di conversione, conteggio di CFU) tra due gruppi indipendenti saranno analizzati mediante test t non appaiati, ANOVA e pots-hoc test (o rispettivi test non parametrici secondo Shapiro-Wilk verifica della distribuzione dei dati). Le associazioni tra le determinazioni dei campioni saranno calcolate mediante la correlazione di Pearson o di Spearman. È stato effettuato un calcolo della potenza utilizzando i dati di uno studio precedente67. Era necessaria una dimensione del campione con un minimo di 35 pazienti per gruppo e per ogni braccio di studio per trovare una differenza statisticamente significativa nel conteggio finale delle CFU (risultato principale), considerando una potenza statistica di 0,8 basata su Vildosola et a study64 (1 -β). La significatività sarà considerata se il valore p è