Effekten av inkorporering av kobber og sink nanopartikler i tannlim (1170575)

Generelt mål Å evaluere påvirkningen av inkorporering av kobber- eller sink-nanopartikler i et tannlim på dets antimikrobielle virkning og deres innflytelse på dentinmatrisemetalloproteasers aktivitet. Å analysere limets mekaniske egenskaper og biokompatibilitet Spesifikke mål

1. Å utvikle og strukturelt karakterisere et tannlim dopet med kobber eller sink nanopartikler.

   1.1. Fremstilling av selvklebende nanokompositter; 1.2. Strukturell karakterisering av klebende nanokompositter.

2. For å vurdere mekaniske, biokjemiske og funksjonelle effekter av selvklebende nanokompositter in vitro. Analyser vil bli behandlet som sammenligner tilsetning av kontrolllim, eller limet dopet med enten kobber eller sink på ferske nylig ekstraherte tenner.(eks. vivo fase) 2.1. For å teste den antimikrobielle aktiviteten til lim; 2. 2. Å studere påvirkningen av adhesive nanokompositter på matrisemetalloproteaser nivåer og/eller aktivitet;2.3. For å evaluere limets mekaniske egenskaper;2.4. For å vurdere biokompatibilitet. Viabilitetsanalyser i primær dyrket gingival fibroblast vil bli tatt opp.
3. For å evaluere in vivo modell (klinisk fase) antimikrobielle egenskaper, matrise metalloproteaser og cathepsin B nivåer og/eller aktivitet, biokompatibilitet av adhesive nanokompositter in vivo og mekaniske egenskaper. Premolarer indikert for ekstraksjon vil bli gjenopprettet ved bruk av enten tradisjonelt lim eller det klebende nanokompositt. Etter en måned vil premolarer trekkes ut og analyseres som beskrevet.

3.1. For å bestemme overflateantimikrobielle egenskaper til klebende nanokompositter; 3.2. For å vurdere matrisemetalloproteaser og cathepsin B-nivåer og/eller aktivitet i dentinvev maserert;3.3 For å bestemme biokompatibilitet. Tannmasse vil bli hentet fra ekstraherte premolarer, og molekylære markører for cellelevedyktighet eller celleskade vil bli adressert av adhesive nanokompositter;3.4 For å evaluere limets mekaniske egenskaper.

METODER

1. Å utvikle et tannlim dopet med kobber eller sink nanopartikler. 1.1. Klargjøring av klebende nanokompositter (1): CuNP/adhesive nanokompositter vil bli tilberedt ved bruk av en-flaske limsystemet Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE). Dette acetonbaserte limet inneholder en blanding av uretandimetakrylat og sur monomer dipentaerytritolpentaakrylatmonofosfat. For å klargjøre de selvklebende nanokomposittene, vil passende mengder nanopartikkelpulver (CuNp og ZnNp, Sigma Aldrich, Santiago, Chile) veies og legges direkte til limflasken under konstant magnetisk omrøring. Suspensjonen vil deretter dispergeres videre i et ultralydbad ved 37°C i 10 minutter. Selvklebende nanokompositter vil bli tilberedt med CuNP-innhold i området 0,015 til 0,045 vekt% i henhold til tidligere data fra våre laboratorier. De fem konsentrasjonene av Cu- og Zn-dopet lim vil være 0,0150 %, 0,0075 % og 0,00038 % (konsentrasjoner med antibakterielle aktive egenskaper basert på våre tidligere data (Cu 1-2-3 og Zn 1-2-3).

   1.2. Strukturell karakterisering av adhesive nanokompositter (1): Morfologi og sammensetning av nanocomposite adhesive materialer vil bli karakterisert av SEM-EDX i tilbakespredt elektronmodus for å produsere fasekontrast og AFM-mikroskopi. Den kjemiske strukturen til polymermatrisen og gjenværende monomerinnhold vil bli analysert ved svekket totalrefleksjon Fourier-transformasjon infrarød og Raman-spektroskopi. Den gjenværende monomeren vil bli analysert med tanke på karbon-til-karbon dobbeltbindingsvibrasjonen til akrylmonomeren i området 1684 - 1636 cm-1.

2. For å vurdere antibakterielle, mekaniske, biokjemiske og funksjonelle effekter av adhesive nanokompositter in vitro og ex vivo. Analyser vil bli behandlet som sammenligner tilsetning av vanlig lim, eller limet dopet med enten kobber eller sink.

   2.1. Analyse av antimikrobielle egenskaper til adhesiv nanokompositt (2) 2.1.1 Antibakteriell aktivitet: Kort fortalt vil 10 mm skiver med en tykkelse på 2 mm bli fremstilt ved bruk av harpikskompositt (Filtek Supreme Ultra; 3M, St. Paul, MN) og enten stå ubelagt (kontroll) eller belagt med limet Prime&Bond 2.1, og tilsvarende eksperimentell limblandinger av tolv grupper og polymerisert i henhold til produsentens anbefalinger i 10 sekunder ved bruk av en LED-lysherdeenhet (Radii Cal, SDI, AU) med en effekttetthet på 1000 mW/cm2. Amalgamskiver (Contour; Kerr, Orange, CA) vil bli fremstilt som tidligere beskrevet og brukt som en ekstra positiv kontroll. Totalt fjorten studiegrupper med åtte prøver per gruppe vil bli evaluert i denne delen av eksperimentet: (1) kontroll; (2) amalgam (metallisk materiale brukt som positiv kontroll) og 3) Cu 1, 4) Cu 2, 5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 og 8) Zn3. For å sikre fjerning av upolymerisert monomer, vil skivene nedsenkes i 10 mL sterilt avionisert vann og omrøres i 2 timer ved 200 rpm og 37,8°C, hvoretter skivene får tørke ved romtemperatur i minst 24 timer. Platene steriliseres ved inkubering i 70 % etanol i 10 minutter og tørkes deretter aseptisk i minimum 48 timer. Overflaten på hver skive vil bli inokulert med 100 ml av en definert levedyktig konsentrasjon på 1 108 celler/ml anaerobt dyrket Streptococcus mutans, ATCC1 25175 i hjernehjerteinfusjon (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) broth. . For å bestemme den levedyktige cellekonsentrasjonen for hver behandlingsgruppe i kolonidannende enheter per ml (CFU/ml), vil de inokulerte skivene være anaerobt, hvoretter det totale antallet gjenvunnede CFUer vil bli bestemt.

   2.2. In vitro og ex vivo evaluering av MMPs aktivitet (1-2) 2.2.1 MMP aktivitetshemmingsanalyse (in vitro): Kvantitativ MMP-2, MMP-8 og MMP-9 aktivitet in vitro vil bli bestemt ved kommersiell MMP fluorometrisk analyse sett (SensoLyte-analysesett; AnaSpec, San Jose, CA, USA) for screening av anti-MMP-aktiviteten. Cu- og ZnNP-dopet lim i forskjellige konsentrasjoner og kontroller uten Cu- eller ZnNP-lim vil bli tilsatt reaksjonsbufferen, og analysen vil bli utført i henhold til produsentens anbefalinger. Ved spaltning til 2 separate fragmenter med MMP, vil fluorescensen til 5-FAM overvåkes av en fluorescerende mikroplateleser (Sinergy TM).

   2.2.2 Bestemmelse av MMP-aktivitet og -nivåer (ex vivo dentinprøver med prøver hentet fra gjenopprettede tenner med dopet lim og kontroll): 25 (n=5) ekstraherte kariesfrie humane tredje jeksler vil bli samlet inn etter å ha innhentet pasientens informasjon samtykke. Tennene vil bli desinfisert i 0,5 % kloramin, lagret i destillert vann og brukt innen seks måneder etter ekstraksjon. Et lite okklusalt preparat med standardiserte dimensjoner på 3x3x5 mm vil bli laget av en kalibrert operatør i midten av tannen ved hjelp av en sylinderdiamantbor (109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) og en høyhastighets håndstykke mens du gir luft-vannspray. Etter å ha fullført hulromsforberedelsen, vil den fylles med harpikskompositt (Filtek Supreme; 3M ESPE). De eksperimentelle limene dopet med Cu og Zn vil bli brukt i henhold til produsentens instruksjoner, og det ikke-dopete limet vil bli brukt som en kontroll på en homolog øvre premolar. Harpikskompositten (Filtek Supreme; 3M ESPE) vil påføres ved bruk av inkrementell teknikk. Emaljen vil bli fullstendig fjernet med en saktehastighets diamantsag (Remet, Bologna, Italia) under saltvannsvann, og tennene vil bli seksjonert for å oppnå 1 mm tykke koronale dentinskiver, som deretter vil bli pulverisert til pulver med en stål hammer. Dentinpulver vil deretter deles likt og demineraliseres (ved 4°C i 24 timer under omrøring) i en av følgende vannløsninger: (1) 0,87 M eddiksyre, pH = 2,3; (2) 0,26 M sitronsyre, pH = 2,3; eller (3) 0,5 M EDTA, pH = 6,4; eller (4) 0,5 M EGTA, pH = 6,4. Enzymekstraksjon av det demineraliserte dentinpulveret vil bli suspendert i ekstraksjonsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,0, inneholdende 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % NONIDET P-40, 0,1 mM ZnCl2, 0,02 % NaN3) og EDTA-fri proteasehemmercocktail (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Prøvene vil deretter bli behandlet med ultralyd ved 40 W effekt i 3 støt på 10 sekunder hver ved 4 °C (Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385, Heat Systems-Ultrasonic Inc., Farmingdale, NY, USA). Hetteglassene vil bli sentrifugert ved 18 000 rpm i 30 minutter ved 4 °C, og supernatantene vil bli samlet. Alle proteinene som er tilstede i supernatantene vil bli utfelt ved 4°C ved tilsetning av pulverisert ammoniumsulfat (vekt/volum) for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 85 % og pH 7,0. Bunnfallet vil bli samlet opp ved sentrifugering ved 24 000 rpm i 30 minutter ved 4°C, oppløst i en 10 gangers fortynning i ekstraksjonsbuffer, dialysert gjennom en 30 kDa membran mot ekstraksjonsbuffer over natten, og lagret ved 4°C inntil analysert. Etter dette vil dentinpulveret bli analysert for å vurdere MMP-2, MMP-9 og cathepsin B aktivitetsnivåer målt ved gelatin zymografi og for å vurdere MMP-8 ved kollagen zymografi, som tidligere beskrevet.56 Densitometri vil bli uttrykt som du (Gel Logic 2200 pro Imaging System, Carestream Health, USA). Kort fortalt vil dentinpulverprøver bli utsatt for elektroforese under ikke-reduserende denaturerende forhold i SDS/PAGE-geler som inneholder 1 mg/mL gelatin eller 0,1 mg/mL kollagen som underlag. De vil deretter bli bløtlagt to ganger i 2,5 % Triton X-100 og inkubert i 17 timer i utviklingsbuffer (20 mM Tris pH 7,4 og 5 mM CaCl2), farget med Coomassie Brilliant Blue R-250, og avfarget med 10 % eddiksyre og 20 % metanolløsning. Nivåer av MMP-2, MMP-8, MMP-9, cathepsin B og ICTP (som en markør for dentinkollagenhydrolyse) vil bli bestemt enten ved et kommersielt ELISA-sett eller multiplekse immunoassays (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, for Luminex-teknologi) i henhold til produsentens anbefalinger.

   2.3. Testing av mekaniske egenskaper av klebende nanokompositter (1-2) Bindingsstyrke 2.3.1 Tannvalg og klargjøring: Sytti ekstraherte kariesfrie mennesketredje jeksler vil bli samlet inn etter å ha innhentet pasientenes informerte samtykke fra tannklinikken ved University of Chile (≈2000 tredjedel) molare ekstraksjoner per år, for å sikre tilgjengeligheten av disse tennene som normalt kasseres). Tennene vil bli desinfisert i 0,5 % kloramin, lagret i destillert vann og brukt innen seks måneder etter ekstraksjon. En flat dentinoverflate vil bli eksponert etter våtsliping av den okklusale emaljen med et #180 SiC-papir. De eksponerte dentinoverflatene vil bli ytterligere polert med et vått #600 SiC-papir i 60 sekunder for å standardisere smørelaget.

   2.3.2 Eksperimentell design: Tennene vil bli tilfeldig tildelt i tolv grupper på fem (6 grupper per lim), som hver vil bli behandlet med en annen konsentrasjon av dopet lim. Som kontroll uten NP-er av systemet Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford , DE) vil bli brukt.

   2.3.3. Gjenopprettingsprosedyre og forberedelse av prøven: Limsystemene påføres strengt i henhold til den respektive produsentens instruksjoner.

   2.3.4 Etter bindingsprosedyrer: Alle tenner vil motta en mikrohybridkomposittrestaurering i to trinn på 2 mm. Hvert trinn vil bli lyspolymerisert i 40 sekunder ved bruk av en LED-lysherdeenhet ved 1200 mW/cm2-innstillingen (Radii-cal; SDI Limited, Bayswater, Victoria, Australia). Gjenopprettede tenner vil bli lagret i destillert vann ved 37 °C i 24 timer og deretter seksjonert langsgående i mesio-distal og bukkal-lingual retning på tvers av det bundne grensesnittet ved hjelp av en saktehastighets diamantsag (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) for å oppnå 15 til 20 harpiks-dentin-pinner, hver med et tverrsnittsareal på ca. 0,8 mm2 målt med en digital skyvelære (Digimatic Caliper; Mitutoyo, Tokyo, Japan). Hver prøve fra hver tann vil bli evaluert for mikrostrekkbinding styrke (mTBS) bortsett fra seks tilfeldig utvalgte harpiks-dentinbundne prøver, som vil bli delt for måling av in situ grad av konvertering (DC) og nanolekkasje (NL).

   2.3.5. Test av mikrostrekkbindingsstyrke: Harpiks-dentin-bundne pinner vil festes til en Geraldeli-jigg med cyanoakrylat-lim og testes under spenning (Kratos Dinamometros, Cotia, SP, Brasil) ved 0,5 mm/min til feil. mTBS-verdiene vil bli beregnet ved å dele belastningen ved brudd med tverrsnittsbindingsområdet. Feilmodusen til prøvene vil bli klassifisert som kohesiv (svikt utelukkende i dentinet eller harpikskompositten), lim (svikt ved harpiks/dentingrensesnittet), eller blandet (svikt ved harpiks/dentingrensesnitt inkludert kohesiv svikt i nabosubstratene) ). Klassifisering vil bli utført under et stereomikroskop (SZ40; Olympus, Tokyo, Japan) ved 100x forstørrelse. Prøver med premature feil (PF) vil bli inkludert i gjennomsnittet.

   2.3.6. Konverteringsgrad in situ: Tre harpiks-dentin-bundne pinner fra hver tann vil bli våtpolert med #1500, #2000 og #2500 SiC-papir. De vil deretter bli renset med ultralyd i 20 minutter og lagret i vann ved 37,8 °C i 24 timer før måling av DC. Mikro-Raman-spektroskopianalyse vil bli utført ved bruk av Sentera-utstyr (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Baden-Wu¨rttemberg, Tyskland). Kalibrering av mikro-Raman-spektrometeret vil bli utført ved å tilbakestille det til null og deretter måle koeffisienten til en silisiumprøve. Prøver vil bli analysert ved å bruke følgende mikro-Raman-parametere: 20 mW neonlaser ved 532 nm, romlig oppløsning ved 3 mm, spektral oppløsning ved 5 cm-1, akkumuleringstid ved 30 sekunder med 6 co-addisjoner, og forstørrelse ved 110x ( Olympus UK, London, UK) til en strålediameter på 1 mm. Spektra vil bli tatt ved dentin-adhesiv-grensesnittet på tre forskjellige steder i det intertubulære dentinet for hver harpiks-dentin-bundet pinne. Spektra av upolymeriserte lim vil bli brukt som referanser. Etterbehandling av spektre vil bli utført ved å bruke den dedikerte Opus Spectroscopy Software versjon 6.5. Forholdet mellom dobbeltbindingsinnhold av monomer og polymer i limet vil bli beregnet: der ''R'' er forholdet mellom alifatiske og aromatiske topparealer ved 1639 cm-1 og 1609 cm-1 i polymeriserte og upolymeriserte lim. In situ DC for alle harpiks-dentin-bundne pinner fra samme tann vil bli beregnet som gjennomsnitt for statistiske formål.

   2.3.7. Evaluering av nanolekkasje: Tre harpiksbundne pinner fra hver tann vil bli plassert i ammoniakksølvnitrat fremstilt i henhold til protokollen beskrevet av Tay et al.57 og lagret i mørke i 24 timer. De vil deretter skylles grundig i destillert vann og senkes i fotofremkallingsløsning i 8 timer under et fluorescerende lys for å redusere sølvioner til metalliske sølvkorn i hulrommene langs den sammenbundne grenseflaten. Prøver vil bli våtpolert med #600, #1000, #1200, #1500, #2000 og #2500 SiC-papir og med 1- og 0,25 mm diamantpasta (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) med en poleringsklut. De vil bli renset med ultralyd, lufttørket, montert på stubber og belagt med karbon-gull (MED 010; Balzers Union, Balzers, Liechtenstein). Harpiks-dentin-grensesnitt vil bli analysert i et felt-emisjon skanningselektronmikroskop operert i tilbakespredt modus (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd., Cambridge, Storbritannia). Tre bilder vil bli tatt av hver harpiks-dentin-bundet pinne. Den relative prosentandelen NL i klebemiddel- og hybridlagene i hver prøve vil bli målt i alle bilder ved hjelp av Image J-programvaren58 av en blindet forsker. Verdier fra samme prøve vil bli beregnet som gjennomsnitt, og gjennomsnittlig NL for alle pinner fra samme tann vil være gjennomsnittlig.

   2.4 Vurder biokompatibilitet, levedyktighetsanalyser i primærdyrket gingival fibroblast 2.4.1 Cellekulturer: Primærkulturer av humane fibroblaster vil bli oppnådd ved eksplantasjonsmetoden, fra det retromolare vevet til tredje molarer av tre mannlige voksne individer.

   Saos-2 human osteosarkomcellelinje, vanligvis brukt for å vurdere biokompatibilitet mellom osteoblast og biomaterialer, vil bli dyrket som beskrevet av Alcaide et al.60.

   Celler vil bli sådd i en 96-brønners plate med en tetthet på 3000 celler per brønn. Etter 24 timer vil kontrollkulturmediet erstattes med 100 µl forskjellige fortynninger av det riktige limet (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %). Platene vil bli inkubert i 24 timer, 48 timer og 72 timer i en 37 timer. °C inkubator (5 % CO2) før levedyktighets- eller celledødsanalyser.

   2.4.2 Cellelevedyktighet og cellesyklusanalyse: Primærkulturer av humane fibroblaster vil bli oppnådd ved eksplantasjonsmetoden, fra det retromolare vevet til tredje molarer av tre mannlige voksne individer.

   Saos-2 human osteosarkomcellelinje, vanligvis brukt for å vurdere biokompatibilitet mellom osteoblast og biomaterialer, vil bli dyrket som beskrevet av Alcaide et al.60.

   Celler vil bli sådd i en 96-brønners plate med en tetthet på 3000 celler per brønn. Etter 24 timer vil kontrollkulturmediet erstattes med 100 µl forskjellige fortynninger av det riktige limet (10 %, 0,1 %, 1 %, 0,01 %, 0 %). Platene vil bli inkubert i 24 timer, 48 timer og 72 timer i en 37 timer. °C inkubator (5 % CO2) før levedyktighets- eller celledødsanalyser.

   2.4.3 Kvantifisering av levedyktige, tidlig apoptotiske, sen apoptotiske og nekrotiske celler ved fluorescensmikroskopi: Protokoll beskrevet av Kasibhatla et al vil bli brukt 61. Celler vil bli farget med en Acridine Orange/Ethidium Bromide-løsning (AO/EB) og vil bli undersøkt med fluorescensmikroskopi. AO vil farge både levende og døde celler. EB vil bare farge celler som har mistet membranintegritet. Levende celler vil vises jevnt grønne. Tidlige apoptotiske celler vil farge grønt og inneholde lyse grønne prikker i kjernene som en konsekvens av kromatinkondensering og kjernefysisk fragmentering. Sene apoptotiske celler vil også inkorporere etidiumbromid og farges derfor oransje, men i motsetning til nekrotiske celler vil de sene apoptotiske cellene vise kondenserte og ofte fragmenterte kjerner. Nekrotiske celler farger oransje, men har en kjernemorfologi som ligner den til levedyktige celler, uten kondensert kromatin61.

   2.4.4 Påvisning av apoptose ved fosfatidylserineksponering, DNA-laddering og apoptotisk mRNA og proteinkvantifisering: Eksponeringen av fosfatidylserin på utsiden av plasmamembranen vil bli analysert som tidlig signal om apoptose ved farging med annexin V (A5)-allophycocyan, som beskrevet i Alcaide et al.60. Fluorescens av probe APC vil bli analysert ved hjelp av flowcytometri.

   Den apoptotiske DNA-stigeanalysen vil bli utført ved bruk av et DNA-stigesett (Roche, Tyskland).

   mRNA og proteinnivåer for tumorsuppressor (p53), pro-apoptotiske (bax, caspase 3) og anti-apoptotiske (bcl-2) mediatorer vil bli adressert ved bruk av kvantitativ PCR og immunoblot.

   2.4.5 Evaluering av autofagi: For å teste antatte effekter av metall-NPer på celleautofagi, vil ulike autofagimarkører bli adressert. Autofagisk fluks og p62-nivå vil bli detektert ved western blot, og autofagosomer vil bli visualisert ved fluorescensmikroskopi ved å telle LC3 positive puncta63.

3. Evaluering av metalloproteasenivåer og/eller aktivitet og biokompatibilitet av adhesive nanokompositter in vivo.

   Premolarer indikert for ekstraksjon vil bli gjenopprettet ved bruk av enten tradisjonelt lim eller det klebende nanokompositt. Etter en måned (tilbakekalling ved telefonisk kontakt og etter klinikkundersøkelse), vil pasientene bli undersøkt og premolarer vil bli ekstrahert og analysert av blinde-evaluatorer (kodifisert med tall) på alle stadier som beskrevet. Ekstraksjoner av premolarer vil bli utført av lærere i odontologi, enhver effekt etter prosedyre vil bli antatt og løst av forskerteamet, prosedyrer for pasienter er gratis, og alt vil bli strengt overholdt til anbefalingene fra fakultetets etiske komité odontologi ved universitetet i Chile.

   3.1 In vivo-evaluering av adhesive nanokompositter: Sytti frivillige som trenger ekstraksjon av øvre høyre og venstre første premolar (n = 35 per gruppe) av kjeveortopedisk årsaker vil bli valgt fra Ortodontisk spesialiseringsprogram i klinikken ved University of Chile (det vil være en rekrutteringsperiode på 3 måneder med en medetterforsker ansvarlig for overvåking (CB)). Inklusjonskriterier vil være (1) behandlingsplaner som indikerer premolare ekstraksjoner av kjeveortopedisk årsaker, (2) tilstedeværelse av friske, intakte, ikke-karious, ikke-restaurerte og fullt utbrutte behandlingstenner, og (3) pasienter som har godt kontrollerte helsetilstander som gjør at alle prosedyrer kan utføres i forskningen med minimal risiko. Eksklusjonskriterier vil være (1) pasienter som ikke godtar å delta frivillig i studien og (2) pasienter som ikke oppfyller alle inklusjonskriteriene. En liten okklusal forberedelse vil gjøres av en kalibrert operatør i midten av tannen ved hjelp av en sylinderdiamant bur (.63109/018, Medium Grit (60730025), Dentsply, NY, USA) og et høyhastighets håndstykke samtidig som det gir luft-vannspray med standardiserte dimensjoner på 3x3x5 mm. Etter å ha fullført hulromsforberedelsen, vil den fylles med harpikskompositt (Filtek Supreme; 3M ESPE). De eksperimentelle limene dopet med Cu og Zn vil bli brukt i henhold til produsentens instruksjoner, og det ikke-dopete limet vil bli brukt som en kontroll på den homologe øvre premolaren og design ved enkel randomisering av parallelle grupper. Harpikskompositten (Filtek Supreme; 3M ESPE) vil påføres ved bruk av inkrementell teknikk, og til slutt vil ett lag med lim påføres som en overflate av komposittrestaurering og polymeriseres i 10 sek. Okklusjonen vil bli kontrollert, og restaureringene vil bli ferdigstilt og polert etter produsentens instruksjoner. Deretter vil polering og sluttbehandling brukes til å påføre et lag med lim på den endelige restaureringen, som skal polymeriseres i 10 sekunder (Raddi Cal, SDI, AU). Én tann om gangen trekkes ut én måned etter at restaureringene er utført. Pasienten vil motta infiltrativ og intraligamental anestesi (ca. 1,8 ml 2 % Mepivacaine (36 mg)) med epinefrin i forholdet 1:100 000 (18 mg). Deretter vil tennene bli utsatt for tester.

   3.2 Bestem overflateantimikrobielle egenskaper til adhesive nanokompositter: For å vurdere de antibakterielle overflateegenskapene til dopede lim, vil ett siste lag med lim påføres over den endelige overflaten av restaureringer i en in vivo-modell. Prosedyren vil bli brukt til å vurdere antall CFU av S.Mutans på komposittoverflater (Hovedutfall). Før prøvetaking av biofilmen, vil brett klargjøres for å trykke biofilmen over restaureringene. For denne applikasjonen vil vi bruke engangsbrett for påføring av fluoridgel (Deepak Products Inc., Miami, USA), som hver vil bli sterilisert i en biosikkerhetshette (Esco Technologies Inc., Harboro, USA) under ultrafiolett lys i 30 minutter. Hvert brett vil deretter bli fylt med 7,5 ml TYCSB-agar (kasein, gjærekstrakt, L-cystein, sukrose, bacitracin) (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA), som er et selektivt medium for S. mutans. Deretter, for å individualisere prøvesamlingsteknikken, kuttes skuffene slik at de ikke passer til mer enn 3 tenner. Umiddelbart etter dette vil brettene legges i sterile petriplater og oppbevares i forseglede plastposer i kjøleskap. Før bruk vil brettene plasseres i en inkubator/komfyr (ZDP-A2080, LabTech Co., Namyangiu, Korea) i 24 timer ved 37 °C som et kvalitetskontrolltiltak. Den tredje og fjerde operatøren vil utføre prøvetakingen, som vil bli utført mellom 11:00-13:00 for å tillate omorganisering av biofilm etter morgenpuss. Prøvetakingen vil bli utført av en blind operatør som forsiktig trykker brettet i 20 s over RC-restaureringen, etterfulgt av homolog RC-restaurering med og uten Cu- eller Zn-dopet lim.

   Etter at prøvebrettene er lagret i sterile petriplater, vil de bli transportert ved 4 °C og deretter inkubert ved 37 °C i en mikroaerofil (krukkelys CO2 10%) i 48 timer. Tellingen av S.mutans vil bli utført av den fjerde operatøren som vil bli blendet til brettet ble brukt til å skrive ut RC-restaureringene. Senere vil det bli utført Gram-farging for å bestemme mikromorfologien til koloniene. Antallet S. mutans vil bli uttrykt i kolonidannende enheter (CFU) av S. mutans fra platene og brettene med TYCSB-agaren. Utvalgte kolonier som vil være kompatible med S.mutans-adhesjon og morfologiske egenskaper vil bli suspendert i Todd-Hewitt-buljong (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) og inkubert ved 37 °C i 48 timer. Koloniene vil deretter bli utsatt for biokjemiske tester for å identifisere arten av S. mutans og for å skille den fra S. sobrinus. De biokjemiske testene inkluderer raffinosefermentering, melibiosegjæring og esculinhydrolysetester. Et positivt resultat for alle tre testene indikerer tilstedeværelsen av S. mutans.

   3.3 Vurdering av metalloproteasenivåer og/eller aktivitet i maserert dentinvev vil bruke en lignende metodikk som den i 2.4.2 3.3.1 Zymografi for in situ for å vurdere aktivitetene til MMPs 2 og 9 (utfall): En metode beskrevet av Mazzoni et al. .65 vil bli brukt på 20 (n=5 per gruppe) nyekstraherte ikke-kariose øvre premolarer fra mennesker restaurert ved en tidligere prosedyre. Etter fjerning av emaljen og sementen vil det fås 1 mm tykke skiver av middels/dyp koronalt dentin. En 1,0 mg/ml stamløsning av fluorescein-merket gelatin ble fremstilt ved å tilsette 1,0 ml vann til hetteglassene som inneholdt det lyofiliserte substratet og oppbevaring ved -20°C frem til bruk. Gelatinstamløsningen fortynnes 1:8 med fortynningsbufferen (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0), og et anti-fading middel tilsettes (monteringsmedium med Dapi H-1200, Vectashield , Vector Laboratories LTD, Cambridgeshire, Storbritannia). En 50-μL mengde av den fluorescerende gelatinblandingen legges på toppen av hver plate og dekkes med et dekkglass. Objektglassene er lysbeskyttet og inkubert i fuktige kamre ved 37 °C. For å identifisere den optimale inkubasjonsperioden, tas fluorescerende bilder fra 1 time til 7 dager. Detaljert beskrivelse av 3D-analyse av in situ zymografi med konfokalmikroskopi. Kort fortalt ble hydrolyse av quenched fluorescein-konjugert gelatinsubstrat, som er indikativ for endogen gelatinolytisk enzymaktivitet, vurdert ved undersøkelse under et multi-foton konfokalt mikroskop (eks: 488nm, og em: lp530nm; Zeiss, LSM 780, Oberchen, Oberchen , Tyskland). Optiske seksjoner på 85 μm tykke ble hentet fra forskjellige fokalplan, og de stablede bildene ble analysert, kvantifisert og behandlet med ZEN 2010-programvare (Carl Zeiss).

   3.4. Bestemmelse av biokompatibilitet. Tannmasse vil bli hentet fra ekstraherte premolarer, og molekylære markører for cellelevedyktighet (utfall) eller celleskade ved selvklebende nanokompositter vil bli adressert.

   Tannmasse vil bli oppnådd som beskrevet av Vaseemuddin66, fra ekstraherte premolarer. Totalt RNA vil bli separert og mRNA-nivåer av spesifikke apoptose- og autofagimarkører vil bli målt ved qPCR, som tidligere beskrevet (2.4.4-2.4.5).

   3.5 Vurdering av mekaniske egenskaper (nanolekkasje- og gradkonverteringsanalyse for å vurdere bindingsstabilitetene (utfall)) vil være lik metoder i 2.1

4. Statistisk analyse: Statistisk analyse vil bli utført med SPSS 23.0-programvare (IBM, New York, NY, USA). Sammenligninger mellom kvantitative variabler (mikrotensilbindingsstyrke, nanolekkasje, konverteringsgrad, telling av CFU) mellom to uavhengige grupper vil bli analysert ved uparet t-test, ANOVA og pots-hoc-test (eller respektive ikke-parametriske tester i henhold til Shapiro-Wilk testing av datadistribusjon). Assosiasjoner mellom prøvebestemmelser vil bli beregnet ved Pearsons eller Spearmans korrelasjon. En effektberegning ble utført ved bruk av data fra en tidligere studie67. En prøvestørrelse med minimum 35 pasienter per gruppe og hver studiegren var nødvendig for å finne en forskjell med statistisk signifikans i en endelig telling av CFU (hovedutfall), tatt i betraktning en statistisk styrke på 0,8 basert på Vildosola et en studie64 (1 -β). Signifikans vil bli vurdert hvis p-verdien er