口腔マイクロバイオームに対するキシリトールとソルビトールの効果

被験者: 研究プロトコルは、UWI、セント オーガスティンの倫理委員会によって承認されました。 西インド諸島大学 (UWI)、セント オーガスティン、トリニダードから 30 人の健康なボランティアが研究に登録されました。 適格であるためには、被験者は少なくとも 20 本の歯があり、書面によるインフォームド コンセントを提供し、研究手順に従う意思がある必要があります。 全身性、感染性または炎症性疾患を患っている、または先月に薬、抗生物質またはフッ化物を服用している対象者、キシリトール/ソルビトール含有製品および洗口剤を常用している方、唾液の流れに異常がある方（

チューインガム: キシリトール ガム (エピック スペアミント; 1.5g/ペレット) ガム X と指定されたものは、ガムベース、天然香料、大豆レシチン、アラビアゴム、二酸化チタン、カルヌーバ ワックスに加えて、70% のキシリトールを含んでいます。 Gum S (エクリプス スペアミント) は、キシリトールが 63% のソルビトールと 2% のマルチトールに置き換えられ、アスパルテームが含まれていることを除いて同様でした。 ガムは色分けされた容器に詰められていました。 コードは、研究が完了するまで、参加者およびそれらとやり取りした研究者から秘密にされました。

研究デザイン: この前向きクロスオーバー、二重盲検、無作為化研究は 14 週間 (2015 年 3 月 - 6 月) 続きました。 全体を通して、被験者はうがい薬やキシリトール製品を使用しないこと、通常の食事を摂取すること、通常の歯磨きを続けること、抗菌薬の使用を報告するように指示されました. 後者を報告した被験者は落とされました。

被験者は無作為に A と B の 2 つのグループに割り当てられました (図 1 を参照)。 両方のグループは、ガムを噛まない 4 週間の「ウォッシュアウト期間」に入り、その後 3 週間の治療期間 (治療期間 1) に入り、グループ A はガム X を使用し、グループ B はガム S (ガム 2 個、ガム 3 個) を使用しました。食後 6 分間 1 日 1 回）。 両方のグループは、グループ A がガム S を使用し、グループ B がガム X を 3 週間使用する治療期間 2 に入る前に、さらに 4 週間のウォッシュアウト期間を経ました。

サンプル コレクション: 各治療期間の直前と直後に参加者から唾液と歯垢を採取しました (図 1)。 被験者は、サンプル収集の少なくとも 24 時間前から歯を磨いたり、他の口腔衛生処置を使用したりしないように、また、少なくとも 1 時間前から飲食しないように指示されました。 唾液収集のために、被験者は無菌パラフィンワックスを咀嚼し、生成された全唾液を無菌チューブに5分間収集しました。 被検者は、ラベルを付けた 50ml コレクション チューブ (Falcon 無菌、頂部が平らなスクリュー キャップ付きのコニカル ポリプロピレン チューブ) に垂れ流すように求められました。 より大量の唾液 (2 ～ 5 ml) を収集するために、このプロセスを複数回繰り返しました。 唾液を無菌ピペットを介して、使用するまで-70℃で保存されたラベル付き無菌遠心管に移した。

2 つの大臼歯 (#16 と #36)、2 つの前臼歯 (#24 と #44)、および 2 つの切歯 (#21 と #41) から歯肉縁上プラークをキュレットで収集しました。プラーク収集には、グレーシー キュレットを使用して、選択した人差し歯の頬側表面から歯肉縁上のプラークをすべて除去する必要がありました。 キューレットの先端を、遠心管内の無菌の DNase を含まない Tris-EDTA (TE) バッファーに 4 ～ 5 秒間浸しました。 キュレットの面を採取管の内側の端で拭き、次に先端の緩衝液が患者の口に入らないように滅菌ガーゼで拭き取った。 次に、同じ手順を使用して、サイトをすぐに再度サンプリングしました。 試験管のふたを元に戻し、流体中の試料の分散を最大化するために、試験管を 4 ～ 5 秒間振とうしました。 チューブを直ちにジップロックバッグに入れて氷上に置き、使用するまで-70℃で保存した。 サンプルは、グループ (A/B)、治療期間 (1/2)、使用したガム (特定の治療期間の最後に収集されたサンプルの場合は X/S)、およびタイプ (唾液またはプラーク) によってラベル付けされました。 (p))。 サンプル (n = 232) は、DNA の抽出と配列決定のために、ドライアイスで J. Craig Venter Institute (JCVI) 米国のラ ホーヤ キャンパスに発送されました。

DNA 抽出: サンプルを 4℃ で解凍し、500ul の唾液またはプラーク懸濁液からビーズ ビーティング Lysing Matrix B チューブ (MPBio Inc.) を使用して DNA を抽出する前に、十分にボルテックスし、リゾチーム消化、フェノール/クロロホルム イソアミル アルコール抽出、およびエタノール沈殿を行いました。 . 沈殿した DNA を 1x TE バッファーに再懸濁しました。

ライブラリーの調製と配列決定: 各サンプルからの DNA は、Nanodrop 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) を使用して定量化されました。 アンプリコンは、16S rDNA 遺伝子 (16S) の V4 領域をターゲットとするアダプターおよびバーコード連結ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プライマーを使用して生成され、製造元の指示に従って Qiaquick PCR 精製キット (Qiagen, Inc) を使用して精製されました。 精製されたアンプリコンは、SybrGold（Thermo Fisher Scientific、Inc、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用して定量化され、各サンプルの等モル量を確保するために正規化され、イルミナMiSEQシーケンスの準備のためにプールされました。 16S ライブラリー プールは、メーカーの仕様書に従って、イルミナ MiSEQ デュアル インデックス 2x250bp V2 ケミストリー キットを使用して配列決定されました。

16S RNA シーケンス データ処理: 各サンプルのシーケンスは、対応するデュアル インデックスに従ってビニングされ、個々の .fastq としてエクスポートされました。 CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. カリフォルニア州ラホーヤ）。 逆多重化中にバーコードの不一致が許可されないように厳格な設定が維持されたため、高品質の配列のみが保持されるように配列が処理されました。 処理されたシーケンスは、追加の品質管理 (QC) チェックのために Infernal パイプライン [35] に適用されました。 細菌配列は、ゲノムベースの 16S リボソーム RNA データベース (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/) に基づいて分類学的に割り当てられました。

統計分析。 グループ A および B の被験者の年齢、性別、および DMFT スコアによる分布を、それぞれ独立標本 T 検定、ピアソンのカイ 2 乗検定、およびウィルコクソン順位和検定を使用して比較しました。