Влияние ксилита и сорбита на микробиом полости рта

Субъекты: протоколы исследования были одобрены комитетами по этике UWI, Сент-Огастин. В исследовании приняли участие 30 здоровых добровольцев из Университета Вест-Индии (UWI), Сент-Огастин, Тринидад. Чтобы иметь право на участие, субъекты должны иметь не менее 20 зубов, предоставить письменное информированное согласие и быть готовыми соблюдать процедуры исследования. Субъекты с системными, инфекционными или воспалительными заболеваниями или принимающие лекарства, антибиотики или фторид в течение последнего месяца, привычные потребители продуктов, содержащих ксилит / сорбит, и ополаскивателей для рта, с аномальным слюноотделением (

Жевательные резинки: ксилитовая камедь (Epic Spearmint; 1,5 г/гранулы), обозначенная как Gum X, содержит 70% ксилита в дополнение к основе жевательной резинки, натуральным ароматизаторам, соевому лецитину, гуммиарабику, диоксиду титана, карнубскому воску. Gum S (Eclipse Spearmint) был таким же, за исключением того, что ксилит был заменен на 63% сорбита и 2% мальтита, а также был включен аспартам. Жевательные резинки были упакованы в контейнеры с цветовой маркировкой. Коды хранились в тайне от участников и исследователей, которые взаимодействовали с ними, до завершения исследования.

Дизайн исследования. Проспективное перекрестное двойное слепое рандомизированное исследование длилось 14 недель (март-июнь 2015 г.). На протяжении всего эксперимента испытуемых проинструктировали не использовать жидкости для полоскания рта или продукты с ксилитом, соблюдать нормальную диету, продолжать обычную чистку зубов и сообщать об использовании противомикробных препаратов. Субъекты, сообщившие о последнем, были исключены.

Субъекты были случайным образом распределены по двум группам, A и B (см. Рисунок 1). Обе группы вошли в 4-недельный «период вымывания», в течение которого жевательную резинку не жевали, за которым последовал 3-недельный период лечения (период лечения 1), в течение которого группа А использовала жевательную резинку X, а группа B использовала жевательную резинку S (2 кусочка жевательной резинки, 3 жевательных резинки). раз в день после еды по 6 минут). Затем обе группы прошли еще один 4-недельный период вымывания перед началом второго периода лечения, в течение которого группа А использовала Gum S, а группа B использовала Gum X в течение 3 недель.

Сбор образцов: у участников собирали слюну и зубной налет непосредственно до и после каждого периода лечения (рис. 1). Субъектов проинструктировали не чистить зубы и не использовать какие-либо другие процедуры гигиены полости рта по крайней мере за 24 часа до сбора образцов, а также не есть и не пить по крайней мере за 1 час до этого. Для сбора слюны испытуемые жевали стерильный парафин, а всю полученную слюну собирали в течение 5 минут в стерильные пробирки. Субъекта просили пускать слюни в маркированную пробирку для сбора 50 мл (стерильная коническая полипропиленовая пробирка Falcon с завинчивающейся крышкой с плоским верхом). Этот процесс повторяли несколько раз, чтобы собрать большие объемы слюны (2-5 мл). Слюну переносили стерильными пипетками в маркированные стерильные центрифужные пробирки, которые хранили при -70°С до использования.

Наддесневой налет собирали кюреткой с 2 ​​моляров (№16 и №36), 2 премоляров (№24 и №44) и 2 резцов (№21 и №41); Сбор налета включал использование кюретки Gracey для удаления всего наддесневого налета с щечной поверхности выбранного индексного зуба с помощью необходимого количества движений. Наконечник кюретки погружали в стерильный буфер Tris-EDTA (TE), не содержащий ДНКазы, в центрифужной пробирке на 4-5 секунд. Поверхность кюретки протирали внутренним краем пробирки для сбора, а затем вытирали стерильной марлей, чтобы буфер на кончике не попал в рот пациента. Затем сайт был немедленно снова отобран с использованием той же процедуры. Крышку на пробирке заменяли, а затем пробирку встряхивали в течение 4-5 секунд, пытаясь максимально диспергировать образец в жидкости. Пробирку немедленно помещали на лед в пакет Ziploc и хранили при -70°C до использования. Образцы были помечены по группе (A/B), периоду лечения (1/2), используемой жевательной резинке (X/S в случае тех образцов, которые были собраны в конце данного периода лечения) и типу (слюна (ы) или зубной налет). (п)). Затем образцы (n=232) были отправлены на сухом льду в Институт Дж. Крейга Вентера (JCVI), США, кампус Ла-Хойя, для выделения ДНК и секвенирования.

Экстракция ДНК: образцы оттаивали при 4°C и тщательно встряхивали перед экстракцией ДНК из 500 мкл суспензии слюны или зубного налета с использованием пробирок Lysing Matrix B (MPBio Inc.), затем расщепляли лизоцимом, экстрагировали фенолом/хлороформом изоамиловым спиртом и преципитировали этанолом. . Осажденную ДНК ресуспендировали в 1х ТЕ-буфере.

Подготовка библиотеки и секвенирование: ДНК из каждого образца количественно определяли с использованием спектрофотометра Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Ампликоны были созданы с использованием адаптера и праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР) с лигированием штрих-кода, нацеленных на область V4 гена рДНК 16S (16S), и очищены с использованием наборов для очистки ПЦР Qiaquick (Qiagen, Inc) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные ампликоны количественно определяли с использованием SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс), нормализовали для обеспечения эквимолярных количеств каждого образца и объединяли при подготовке к секвенированию Illumina MiSEQ. Пул библиотеки 16S был секвенирован с использованием набора Illumina MiSEQ с двойным индексом 2x250bp V2 в соответствии со спецификациями производителя.

Обработка данных последовательности 16S РНК: последовательности для каждого образца были объединены в бины в соответствии с соответствующими двойными индексами и экспортированы как отдельные файлы .fastq. файлы с помощью CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. Ла-Холья, Калифорния). Последовательности были обработаны, чтобы гарантировать, что будут сохранены только качественные последовательности, поскольку были сохранены строгие настройки, чтобы гарантировать отсутствие несоответствий штрих-кода во время демультиплексирования. Обработанные последовательности были применены к конвейеру Infernal [35] для дополнительных проверок контроля качества (QC). Бактериальные последовательности были таксономически отнесены на основе базы данных 16S рибосомных РНК на основе генома (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/).

Статистический анализ. Распределение по возрасту, полу и показателю DMFT для субъектов в группах A и B сравнивали с использованием T-критерия для независимых выборок, критерия хи-квадрат Пирсона и критерия суммы рангов Уилкоксона, соответственно, с отсечением p