Xylitol og sorbitol virkninger på det orale mikrobiom

Emner: Undersøgelsesprotokoller blev godkendt af de etiske komitéer i UWI, St. Augustine. Tredive raske frivillige fra University of the West Indies (UWI), St. Augustine, Trinidad blev tilmeldt undersøgelsen. For at være berettiget skal forsøgspersoner have haft mindst 20 tænder, givet skriftligt informeret samtykke og været villige til at overholde undersøgelsesprocedurer. Personer med systemiske, infektions- eller inflammatoriske sygdomme eller som har taget medicin, antibiotika eller fluorid inden for den sidste måned, almindelige forbrugere af xylitol/sorbitol-holdige produkter og mundskyllemidler med unormal spytstrøm (

Tyggegummi: Xylitolgummi (Epic Spearmint; 1,5 g/pellet) betegnet Gum X indeholder 70% xylitol ud over gummibase, naturlige smagsstoffer, sojalecithin, gummi arabicum, titaniumdioxid, carnubavoks. Gum S (Eclipse Spearmint) var ens, bortset fra at xylitol blev erstattet af 63 % sorbitol og 2 % maltitol og aspartam var inkluderet. Gummi blev pakket i farvekodede beholdere. Koderne blev holdt fortrolige fra deltagerne og forskerne, der interagerede med dem, indtil undersøgelsen var afsluttet.

Undersøgelsesdesign: Dette prospektive cross-over, dobbeltblindede, randomiserede studie varede 14 uger (marts - juni 2015). Gennemgående blev forsøgspersonerne instrueret i ikke at bruge mundskyl eller xylitolprodukter, at indtage en normal kost, fortsætte deres sædvanlige tandbørstning og at rapportere brug af antimikrobiel medicin. Emner, der rapporterede sidstnævnte, blev droppet.

Forsøgspersoner blev tilfældigt inddelt i to grupper, A og B (se figur 1). Begge grupper gik ind i en 4-ugers "udvaskningsperiode", hvor der ikke blev tygget tyggegummi, efterfulgt af en 3-ugers behandlingsperiode (behandlingsperiode 1), hvor gruppe A brugte Gum X og Gruppe B brugte Gum S (2 tyggegummistykker, 3 gange dagligt efter måltider i 6 minutter). Begge grupper gennemgik derefter endnu en 4-ugers udvaskningsperiode, før de gik ind i behandlingsperiode 2, hvor gruppe A brugte Gum S og Gruppe B brugte Gum X i 3 uger.

Prøveindsamling: Spyt og plak blev indsamlet fra deltagerne umiddelbart før og efter hver behandlingsperiode (figur 1). Forsøgspersonerne blev instrueret i ikke at børste deres tænder eller bruge andre mundhygiejneprocedurer mindst 24 timer før prøvetagning og ikke at spise eller drikke mindst 1 time før. Til spytopsamling tyggede forsøgspersoner steril paraffinvoks, og hel spyt blev opsamlet i 5 minutter i sterile rør. Forsøgspersonen blev bedt om at savle ind i det mærkede 50 ml opsamlingsrør (Falcon sterilt, konisk polypropylenrør med flad skruelåg). Denne proces blev gentaget flere gange for at opsamle større mængder spyt (2-5 ml). Spyttet blev overført via sterile pipetter til mærkede sterile centrifugerør, som blev opbevaret ved -70˚C indtil brug.

Supragingival plak blev opsamlet med en curette fra 2 kindtænder (#16 og #36), 2 præmolarer (#24 og #44) og 2 fortænder (#21 og #41); Plaqueopsamling involverede brug af en Gracey curette til at fjerne al den supragingivale plak fra den bukkale overflade af den valgte indekstand med så mange strøg som nødvendigt. Curettespidsen blev nedsænket i den sterile DNase-fri Tris-EDTA (TE) buffer i centrifugerøret i 4-5 sekunder. Forsiden af ​​curetten blev tørret af på den indvendige kant af opsamlingsrøret og derefter tørret af med steril gaze for ikke at lade bufferen på spidsen gå ind i patientens mund. Stedet blev derefter straks prøvet igen under anvendelse af den samme procedure. Låget på røret blev sat på igen, og derefter blev røret rystet i 4-5 sekunder i et forsøg på at maksimere spredningen af ​​prøven i væsken. Røret blev straks anbragt på is i en Ziploc-pose og opbevaret ved -70˚C indtil brug. Prøver blev mærket efter gruppe (A/B), behandlingsperiode (1/2), anvendt tyggegummi (X/S i tilfælde af de prøver, der blev indsamlet ved slutningen af ​​en given behandlingsperiode) og type (spyt(er) eller plak (p)). Prøver (n=232) blev derefter sendt på tøris til J. Craig Venter Institute (JCVI) USA, La Jolla campus til DNA-ekstraktion og sekventering.

DNA-ekstraktion: Prøver blev optøet ved 4˚C og vortexet grundigt før DNA-ekstraktion fra 500 ul spyt- eller plaksuspension ved hjælp af perle-beating Lysing Matrix B-rør (MPBio Inc.), derefter lysozymfordøjelse, phenol/chloroform isoamylalkoholekstraktion og ethanoludfældning . Præcipiteret DNA blev resuspenderet i 1 x TE-buffer.

Biblioteksforberedelse og sekventering: DNA fra hver prøve blev kvantificeret ved anvendelse af et Nanodrop-spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA). Amplikoner blev genereret ved hjælp af adapter- og stregkodeligerede polymerasekædereaktions (PCR)-primere målrettet mod V4-regionen af ​​16S rDNA-genet (16S) og oprenset ved hjælp af Qiaquick PCR-oprensningskit (Qiagen, Inc) efter producentens instruktioner. Oprensede amplikoner blev kvantificeret under anvendelse af SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), normaliseret for at sikre ækvimolære mængder af hver prøve og poolet som forberedelse til Illumina MiSEQ-sekventering. 16S bibliotekspuljen blev sekventeret ved hjælp af Illumina MiSEQ dual index 2x250bp V2 kemi kit i henhold til producentens specifikationer.

16S RNA-sekvensdatabehandling: Sekvenser for hver prøve blev lagret i henhold til tilsvarende dobbelte indekser og eksporteret som individuelle .fastq filer ved hjælp af CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, CA). Sekvenser blev behandlet for at sikre, at kun kvalitetssekvenser blev bibeholdt, da stringente indstillinger blev holdt for at sikre, at der ikke var tilladt stregkodemismatch under demultiplexing. Bearbejdede sekvenser blev anvendt på Infernal-rørledningen [35] til yderligere kvalitetskontrol (QC)-tjek. Bakteriesekvenser blev taksonomisk tildelt baseret på den genomisk-baserede 16S ribosomale RNA-database (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/).

Statistiske analyser. Fordeling efter alder, køn og DMFT-score for forsøgspersoner i gruppe A og B blev sammenlignet ved hjælp af henholdsvis uafhængige prøver T-test, Pearson's Chi-Squared test og Wilcoxon rangsum test med en cut-off på p