Efectos del xilitol y sorbitol en el microbioma oral

Sujetos: Los protocolos de estudio fueron aprobados por los Comités de Ética de la UWI, St. Augustine. Treinta voluntarios sanos de la Universidad de las Indias Occidentales (UWI), St. Augustine, Trinidad, se inscribieron en el estudio. Para ser elegible, los sujetos deben haber tenido al menos 20 dientes, haber dado su consentimiento informado por escrito y estar dispuestos a cumplir con los procedimientos del estudio. Sujetos con enfermedades sistémicas, infecciosas o inflamatorias o tomando medicamentos, antibióticos o flúor en el último mes, consumidores habituales de productos y enjuagues bucales que contengan xilitol/sorbitol, con flujo salival anormal (

Gomas de mascar: Goma de mascar con xilitol (Epic Spearmint; 1,5 g/pellet) designada como Gum X que contiene un 70 % de xilitol además de base de goma, sabores naturales, lecitina de soja, goma arábiga, dióxido de titanio, cera de carnauba. Gum S (Eclipse Spearmint), fue similar excepto que se reemplazó el xilitol por 63% de sorbitol y se incluyó 2% de maltitol y aspartamo. Los chicles se envasaron en contenedores codificados por colores. Los códigos se mantuvieron confidenciales para los participantes y los investigadores que interactuaron con ellos hasta la finalización del estudio.

Diseño del estudio: este estudio prospectivo, cruzado, doble ciego, aleatorizado, duró 14 semanas (marzo a junio de 2015). En todo momento, se instruyó a los sujetos para que no usaran enjuagues bucales ni productos con xilitol, que consumieran una dieta normal, que continuaran con su cepillado dental habitual y que informaran sobre el uso de medicamentos antimicrobianos. Los sujetos que informaron lo último fueron eliminados.

Los sujetos fueron asignados aleatoriamente a dos grupos, A y B (ver Figura 1). Ambos grupos entraron en un "período de lavado" de 4 semanas durante el cual no mascaron chicle, seguido de un período de tratamiento de 3 semanas (período de tratamiento 1) durante el cual el Grupo A usó Gum X y el Grupo B usó Gum S (2 piezas de chicle, 3 veces al día después de las comidas durante 6 minutos). Luego, ambos grupos se sometieron a otro período de lavado de 4 semanas antes de ingresar al período de tratamiento 2 durante el cual el Grupo A usó Gum S y el Grupo B usó Gum X durante 3 semanas.

Recolección de muestras: Se recolectaron saliva y placa de los participantes inmediatamente antes y después de cada período de tratamiento (Figura 1). Se indicó a los sujetos que no se cepillaran los dientes ni usaran ningún otro procedimiento de higiene bucal al menos 24 horas antes de la recolección de la muestra, y que no comieran ni bebieran al menos 1 hora antes. Para la recolección de saliva, los sujetos masticaron cera de parafina estéril y toda la saliva producida se recolectó durante 5 minutos en tubos estériles. Se pidió al sujeto que babeara en el tubo de recogida de 50 ml etiquetado (tubo de polipropileno cónico estéril Falcon con tapón de rosca de parte superior plana). Este proceso se repitió varias veces para recolectar mayores volúmenes de saliva (2-5 ml). La saliva se transfirió a través de pipetas estériles a tubos de centrífuga estériles etiquetados que se almacenaron a -70 °C hasta su uso.

La placa supragingival se recogió con una cureta de 2 molares (#16 y #36), 2 premolares (#24 y #44) y 2 incisivos (#21 y #41); La recolección de placa implicó el uso de una cureta Gracey para eliminar toda la placa supragingival de la superficie bucal del diente índice seleccionado con tantos golpes como sea necesario. La punta de la cureta se sumergió en el tampón Tris-EDTA (TE) libre de ADNasa estéril en el tubo de centrífuga durante 4-5 segundos. La cara de la cureta se limpió en el borde interior del tubo de recolección y luego se limpió con una gasa estéril para que el tampón de la punta no entrara en la boca del paciente. El sitio fue entonces inmediatamente muestreado de nuevo utilizando el mismo procedimiento. Se volvió a colocar la tapa del tubo y luego se agitó el tubo durante 4-5 segundos en un intento de maximizar la dispersión de la muestra en el fluido. El tubo se colocó inmediatamente en hielo en una bolsa Ziploc y se almacenó a -70 ˚C hasta su uso. Las muestras se etiquetaron por grupo (A/B), periodo de tratamiento (1/2), chicle utilizado (X/S en el caso de las muestras recogidas al final de un periodo de tratamiento dado) y tipo (saliva(s) o placa (pag)). Luego, las muestras (n=232) se enviaron en hielo seco al Instituto J. Craig Venter (JCVI) EE. UU., campus de La Jolla para la extracción y secuenciación de ADN.

Extracción de ADN: las muestras se descongelaron a 4 °C y se agitaron completamente antes de la extracción de ADN a partir de 500 ul de saliva o suspensión de placa utilizando tubos Lysing Matrix B batidores de perlas (MPBio Inc.), luego digestión con lisozima, extracción con fenol/cloroformo alcohol isoamílico y precipitación con etanol . El ADN precipitado se resuspendió en tampón TE 1x.

Preparación y secuenciación de bibliotecas: el ADN de cada muestra se cuantificó utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Los amplicones se generaron utilizando adaptadores y cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ligados a códigos de barras dirigidos a la región V4 del gen 16S rDNA (16S) y se purificaron utilizando kits de purificación Qiaquick PCR (Qiagen, Inc) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los amplicones purificados se cuantificaron con SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), se normalizaron para garantizar cantidades equimolares de cada muestra y se agruparon en preparación para la secuenciación Illumina MiSEQ. El conjunto de bibliotecas 16S se secuenció utilizando el kit de química Illumina MiSEQ de doble índice 2x250bp V2 de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

Procesamiento de datos de secuencias de ARN 16S: las secuencias de cada muestra se agruparon de acuerdo con los índices duales correspondientes y se exportaron como archivos .fastq individuales archivos usando CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, CA). Las secuencias se procesaron para garantizar que solo se conservaran las secuencias de calidad, ya que se mantuvieron ajustes estrictos para garantizar que no se permitieran discrepancias en los códigos de barras durante la demultiplexación. Las secuencias procesadas se aplicaron a la canalización Infernal [35] para verificaciones adicionales de control de calidad (QC). Las secuencias bacterianas se asignaron taxonómicamente en función de la base de datos de ARN ribosómico 16S basada en genómica (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/).

Análisis estadístico. La distribución por edad, sexo y puntaje CPOD para los sujetos en los grupos A y B se compararon utilizando la prueba T para muestras independientes, la prueba Chi-Squared de Pearson y la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, respectivamente, con un punto de corte de p