Xylitol en Sorbitol effecten op het orale microbioom

Onderwerpen: Studieprotocollen werden goedgekeurd door de ethische commissies van de UWI, St. Augustine. Dertig gezonde vrijwilligers van The University of the West Indies (UWI), St. Augustine, Trinidad namen deel aan het onderzoek. Om in aanmerking te komen, moeten proefpersonen ten minste 20 tanden hebben gehad, schriftelijke geïnformeerde toestemming hebben gegeven en bereid zijn geweest om te voldoen aan onderzoeksprocedures. Proefpersonen met systemische, infectie- of ontstekingsziekten of mensen die in de afgelopen maand medicijnen, antibiotica of fluoride gebruikten, regelmatige consumenten van xylitol/sorbitol-bevattende producten en mondspoelingen, met abnormale speekselvloed (

Kauwgom: Xylitol-gom (Epic Spearmint; 1,5 g/pellet) genaamd Gum X bevat 70% xylitol naast gombasis, natuurlijke aroma's, sojalecithine, Arabische gom, titaandioxide, carnubawas. Gum S (Eclipse Spearmint), was vergelijkbaar, behalve dat xylitol werd vervangen door 63% sorbitol en 2% maltitol en aspartaam ​​werd toegevoegd. Kauwgom was verpakt in kleurgecodeerde containers. Codes werden vertrouwelijk gehouden voor de deelnemers en onderzoekers die ermee communiceerden totdat de studie was voltooid.

Studieopzet: Deze prospectieve cross-over, dubbelblinde, gerandomiseerde studie duurde 14 weken (maart - juni 2015). Gedurende de hele tijd kregen de proefpersonen de instructie om geen mondwater of xylitolproducten te gebruiken, een normaal dieet te volgen, hun gebruikelijke tandenpoetsen voort te zetten en het gebruik van antimicrobiële medicijnen te melden. Onderwerpen die dit laatste rapporteerden, werden geschrapt.

Onderwerpen werden willekeurig toegewezen aan twee groepen, A en B (zie figuur 1). Beide groepen begonnen aan een "wash-out-periode" van 4 weken waarin geen kauwgom werd gekauwd, gevolgd door een behandelingsperiode van 3 weken (behandelingsperiode 1) waarin Groep A Gum X gebruikte en Groep B Gum S (2 kauwgomstukjes, 3 keer per dag na de maaltijd gedurende 6 minuten). Beide groepen ondergingen vervolgens nog een uitwasperiode van 4 weken voordat behandelingsperiode 2 inging, waarin Groep A Gum S gebruikte en Groep B Gum X gedurende 3 weken.

Monsterverzameling: Speeksel en tandplak werden direct voor en na elke behandelingsperiode van de deelnemers verzameld (Figuur 1). De proefpersonen kregen de instructie om ten minste 24 uur vóór de monsterafname hun tanden niet te poetsen of andere mondhygiëneprocedures te gebruiken en ten minste 1 uur ervoor niet te eten of te drinken. Voor het verzamelen van speeksel kauwden de proefpersonen op steriele paraffinewas en het geproduceerde hele speeksel werd gedurende 5 minuten in steriele buisjes verzameld. De proefpersoon werd gevraagd te kwijlen in het gelabelde verzamelbuisje van 50 ml (Falcon steriel, conisch polypropyleen buisje met platte schroefdop). Dit proces werd meerdere keren herhaald om grotere hoeveelheden speeksel (2-5 ml) te verzamelen. Het speeksel werd via steriele pipetten overgebracht in gelabelde steriele centrifugebuisjes die tot gebruik bij -70˚C werden bewaard.

Supragingivale plaque werd verzameld met een curette van 2 kiezen (#16 en #36), 2 premolaren (#24 en #44) en 2 snijtanden (#21 en #41); Bij het verzamelen van plaque werd een Gracey-curette gebruikt om alle supragingivale plaque van het buccale oppervlak van de geselecteerde wijstand te verwijderen met zoveel slagen als nodig. De punt van de curette werd gedurende 4-5 seconden ondergedompeld in de steriele DNase-vrije Tris-EDTA (TE)-buffer in de centrifugebuis. De voorkant van de curette werd aan de binnenrand van de verzamelbuis afgeveegd en vervolgens afgeveegd met steriel gaas om te voorkomen dat de buffer op de punt in de mond van de patiënt terechtkwam. De site werd vervolgens onmiddellijk opnieuw bemonsterd met dezelfde procedure. Het deksel op de buis werd teruggeplaatst en vervolgens werd de buis gedurende 4-5 seconden geschud in een poging het monster zo goed mogelijk in de vloeistof te verspreiden. De buis werd onmiddellijk in een Ziploc-zak op ijs geplaatst en tot gebruik bij -70°C bewaard. Monsters werden gelabeld per groep (A/B), behandelingsperiode (1/2), gebruikte kauwgom (X/S in het geval van monsters die aan het einde van een bepaalde behandelingsperiode werden verzameld) en type (speeksel(s) of plaque (p)). Monsters (n=232) werden vervolgens op droogijs vervoerd naar het J. Craig Venter Institute (JCVI) USA, La Jolla campus voor DNA-extractie en sequentiebepaling.

DNA-extractie: Monsters werden ontdooid bij 4 °C en grondig gevortext voorafgaand aan DNA-extractie uit 500 µl speeksel- of plaque-suspensie met behulp van bead-beating Lysing Matrix B-buizen (MPBio Inc.), vervolgens lysozyme-digestie, fenol/chloroform-isoamylalcohol-extractie en ethanolprecipitatie . Geprecipiteerd DNA werd opnieuw gesuspendeerd in lx TE-buffer.

Bibliotheekvoorbereiding en sequentiebepaling: DNA van elk monster werd gekwantificeerd met behulp van een Nanodrop-spectrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Amplicons werden gegenereerd met behulp van adapter en barcode geligeerde polymerasekettingreactie (PCR) primers gericht op het V4-gebied van het 16S rDNA-gen (16S) en gezuiverd met behulp van Qiaquick PCR-zuiveringskits (Qiagen, Inc) volgens de instructies van de fabrikant. Gezuiverde amplicons werden gekwantificeerd met behulp van SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), genormaliseerd om equimolaire hoeveelheden van elk monster te garanderen, en samengevoegd ter voorbereiding op Illumina MiSEQ-sequencing. De 16S-bibliotheekpool werd gesequenced met behulp van de Illumina MiSEQ dual index 2x250bp V2-chemiekit volgens de specificaties van de fabrikant.

16S RNA-sequentiegegevensverwerking: sequenties voor elk monster werden in een bin geplaatst volgens overeenkomstige dubbele indices en geëxporteerd als individuele .fastq bestanden met CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, CA). Sequenties werden verwerkt om ervoor te zorgen dat alleen kwaliteitssequenties werden behouden, aangezien strikte instellingen werden gehandhaafd om ervoor te zorgen dat er tijdens het demultiplexen geen verkeerde combinaties van streepjescodes waren toegestaan. Verwerkte sequenties werden toegepast op de Infernal-pijplijn [35] voor aanvullende kwaliteitscontrolecontroles (QC). Bacteriële sequenties werden taxonomisch toegewezen op basis van de op Genomic gebaseerde 16S ribosomale RNA-database (GRD; //metasystems.riken.jp/grd/).

Statistische analyse. Verdeling naar leeftijd, geslacht en DMFT-score voor proefpersonen in groep A en B werden vergeleken met behulp van respectievelijk onafhankelijke steekproeven T-test, Pearson's Chi-Squared-test en Wilcoxon rank sum-test, met een grenswaarde van p