Wpływ ksylitolu i sorbitolu na mikrobiom jamy ustnej

Osoby badane: Protokoły badań zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki UWI, św. Augustyna. Do badania włączono trzydziestu zdrowych ochotników z University of the West Indies (UWI), St. Augustine, Trinidad. Aby się zakwalifikować, badani musieli mieć co najmniej 20 zębów, wyrazić pisemną świadomą zgodę i być gotowi do przestrzegania procedur badawczych. Osoby z chorobami ogólnoustrojowymi, zakaźnymi lub zapalnymi lub przyjmujące w ciągu ostatniego miesiąca leki, antybiotyki lub fluor, nałogowe osoby spożywające produkty zawierające ksylitol/sorbitol oraz płukanki do ust, z nieprawidłowym wydzielaniem śliny (

Gumy do żucia: Guma ksylitolowa (Epic Spearmint; 1,5 g/peletka) oznaczona jako Gum X zawiera 70% ksylitolu oprócz bazy gumy, naturalnych aromatów, lecytyny sojowej, gumy arabskiej, dwutlenku tytanu, wosku carnuba. Guma S (Eclipse Spearmint) była podobna, z wyjątkiem tego, że ksylitol zastąpiono 63% sorbitolem i 2% maltitolem oraz dodano aspartam. Gumy zapakowano w pojemniki oznaczone kolorami. Kody były utrzymywane w tajemnicy przed uczestnikami i badaczami, którzy wchodzili z nimi w interakcje, aż do zakończenia badania.

Projekt badania: To prospektywne, krzyżowe, randomizowane badanie z podwójnie ślepą próbą trwało 14 tygodni (marzec – czerwiec 2015 r.). Przez cały czas badani byli instruowani, aby nie używali płynów do płukania jamy ustnej ani produktów z ksylitolem, stosowali normalną dietę, kontynuowali zwykłe szczotkowanie zębów i zgłaszali stosowanie leków przeciwdrobnoustrojowych. Osoby zgłaszające te ostatnie zostały odrzucone.

Badani zostali losowo przydzieleni do dwóch grup, A i B (patrz ryc. 1). Obie grupy weszły w 4-tygodniowy „okres wymywania”, podczas którego żadna guma nie była żuta, po którym nastąpił 3-tygodniowy okres leczenia (okres leczenia 1), podczas którego Grupa A stosowała Gumę X, a Grupa B Gumę S (2 sztuki gumy, 3 razy dziennie po posiłkach przez 6 minut). Następnie obie grupy przeszły kolejny 4-tygodniowy okres wymywania przed rozpoczęciem okresu leczenia 2, podczas którego Grupa A stosowała Gum S, a Grupa B Gum X przez 3 tygodnie.

Pobieranie próbek: Ślina i płytka nazębna zostały pobrane od uczestników bezpośrednio przed i po każdym okresie leczenia (ryc. 1). Pacjentów poinstruowano, aby nie myli zębów ani nie stosowali żadnych innych procedur higieny jamy ustnej co najmniej 24 godziny przed pobraniem próbki oraz nie jedli ani nie pili co najmniej 1 godzinę przed. W celu pobrania śliny badani żuli sterylną parafinę, a całą wytworzoną ślinę zbierano przez 5 minut do sterylnych probówek. Pacjenta poproszono o ślinienie się do oznaczonej 50 ml probówki do pobierania (sterylna, stożkowa probówka polipropylenowa Falcon z płaską zakrętką). Proces ten powtarzano wielokrotnie w celu pobrania większych objętości śliny (2-5 ml). Ślina została przeniesiona sterylnymi pipetami do oznakowanych sterylnych probówek wirówkowych, które przechowywano w temperaturze -70°C do czasu użycia.

Płytkę naddziąsłową zebrano kiretą z 2 zębów trzonowych (#16 i #36), 2 zębów przedtrzonowych (#24 i #44) i 2 siekaczy (#21 i #41); Pobieranie płytki nazębnej obejmowało użycie kirety Gracey w celu usunięcia całej płytki nazębnej naddziąsłowej z powierzchni policzkowej wybranego zęba wskazującego za pomocą tylu pociągnięć, ile potrzeba. Końcówkę łyżeczki zanurzono w sterylnym, wolnym od DNazy buforze Tris-EDTA (TE) w probówce wirówkowej na 4-5 sekund. Powierzchnię czołową kirety przetarto wewnętrzną krawędzią probówki zbiorczej, a następnie wytarto sterylną gazą, aby bufor znajdujący się na końcówce nie dostał się do ust pacjenta. Następnie natychmiast ponownie pobrano próbki z miejsca, stosując tę ​​samą procedurę. Pokrywa na probówce została ponownie założona, a następnie probówka była wytrząsana przez 4-5 sekund w celu zmaksymalizowania rozproszenia próbki w płynie. Probówkę natychmiast umieszczono na lodzie w torebce Ziploc i przechowywano w temperaturze -70°C aż do użycia. Próbki oznaczono według grupy (A/B), okresu leczenia (1/2), użytej gumy (X/S w przypadku próbek pobranych pod koniec danego okresu leczenia) i rodzaju (ślina(y) lub płytka nazębna) (p)). Próbki (n = 232) następnie wysłano na suchym lodzie do J. Craig Venter Institute (JCVI) USA, kampus La Jolla w celu ekstrakcji DNA i sekwencjonowania.

Ekstrakcja DNA: Próbki rozmrożono w 4˚C i dokładnie wytrząsano przed ekstrakcją DNA z 500 µl zawiesiny śliny lub płytki nazębnej przy użyciu probówek Lysing Matrix B z ubijaniem kulek (MPBio Inc.), następnie trawienie lizozymem, ekstrakcja alkoholem izoamylowym fenol/chloroform i wytrącanie etanolem . Wytrącony DNA ponownie zawieszono w buforze 1x TE.

Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie: DNA z każdej próbki oznaczono ilościowo przy użyciu spektrofotometru Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Amplikony wytworzono przy użyciu starterów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) ligowanych z adapterem i kodem kreskowym ukierunkowanych na region V4 genu 16S rDNA (16S) i oczyszczono przy użyciu zestawów do oczyszczania Qiaquick PCR (Qiagen, Inc) zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone amplikony oznaczono ilościowo przy użyciu SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), znormalizowano, aby zapewnić równomolowe ilości każdej próbki i połączono w celu przygotowania do sekwencjonowania Illumina MiSEQ. Pulę bibliotek 16S sekwencjonowano stosując zestaw chemiczny Illumina MiSEQ dual index 2x250bp V2 zgodnie ze specyfikacjami producenta.

Przetwarzanie danych sekwencji 16S RNA: Sekwencje dla każdej próbki podzielono zgodnie z odpowiednimi podwójnymi wskaźnikami i wyeksportowano jako indywidualny plik .fastq pliki przy użyciu CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, Kalifornia). Sekwencje zostały przetworzone w celu zapewnienia, że ​​zachowane zostały tylko sekwencje jakościowe, ponieważ zachowano rygorystyczne ustawienia, aby zapewnić, że podczas demultipleksowania nie będą dozwolone żadne niedopasowania kodów kreskowych. Przetworzone sekwencje zastosowano w rurociągu Infernal [35] w celu przeprowadzenia dodatkowych kontroli kontroli jakości (QC). Sekwencje bakteryjne zostały taksonomicznie przypisane na podstawie bazy danych 16S rybosomalnego RNA opartej na genomie (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/).

Analizy statystyczne. Rozkład według wieku, płci i wyniku DMFT dla osób z grup A i B porównano odpowiednio za pomocą testu T dla niezależnych prób, testu chi-kwadrat Pearsona i testu sumy rang Wilcoxona, z punktem odcięcia p