Efeitos do xilitol e sorbitol no microbioma oral

Sujeitos: Os protocolos do estudo foram aprovados pelos Comitês de Ética da UWI, St. Augustine. Trinta voluntários saudáveis ​​da Universidade das Índias Ocidentais (UWI), St. Augustine, Trinidad foram incluídos no estudo. Para serem elegíveis, os indivíduos devem ter pelo menos 20 dentes, fornecer consentimento informado por escrito e estar disposto a cumprir os procedimentos do estudo. Indivíduos com doenças sistêmicas, infecciosas ou inflamatórias ou em uso de medicamentos, antibióticos ou flúor no último mês, consumidores habituais de produtos contendo xilitol/sorbitol e enxaguatórios bucais, com fluxo salivar anormal (

Gomas de mascar: Goma de xilitol (Epic Spearmint; 1,5g/pellet) designada Gum X contém 70% de xilitol além de base de goma, sabores naturais, lecitina de soja, goma arábica, dióxido de titânio, cera de carnaúba. Goma S (Eclipse Spearmint), foi semelhante, exceto que o xilitol foi substituído por 63% de sorbitol e 2% de maltitol e aspartame foram incluídos. As gomas foram embaladas em recipientes codificados por cores. Os códigos foram mantidos em sigilo dos participantes e pesquisadores que interagiram com eles até a conclusão do estudo.

Desenho do estudo: Este estudo prospectivo cruzado, duplo-cego, randomizado durou 14 semanas (março - junho de 2015). Durante todo o estudo, os indivíduos foram instruídos a não usar enxaguatórios bucais ou produtos com xilitol, consumir uma dieta normal, continuar sua escovação habitual e relatar o uso de medicamentos antimicrobianos. Indivíduos relatando o último foram descartados.

Os indivíduos foram alocados aleatoriamente em dois grupos, A e B (ver Figura 1). Ambos os grupos entraram em um "período de washout" de 4 semanas durante o qual nenhuma goma foi mascada, seguido por um período de tratamento de 3 semanas (período de tratamento 1) durante o qual o Grupo A usou Goma X e o Grupo B usou Goma S (2 gomas, 3 vezes ao dia após as refeições por 6 minutos). Ambos os grupos passaram por outro período de washout de 4 semanas antes de entrar no período de tratamento 2, durante o qual o Grupo A usou Goma S e o Grupo B usou Goma X por 3 semanas.

Coleta de amostra: A saliva e a placa foram coletadas dos participantes imediatamente antes e após cada período de tratamento (Figura 1). Os indivíduos foram instruídos a não escovar os dentes ou usar qualquer outro procedimento de higiene bucal pelo menos 24 horas antes da coleta da amostra e não comer ou beber pelo menos 1 hora antes. Para a coleta de saliva, os indivíduos mastigaram cera de parafina estéril e toda a saliva produzida foi coletada por 5 minutos em tubos estéreis. O indivíduo foi solicitado a babar no tubo de coleta de 50 ml rotulado (tubo de polipropileno cônico estéril Falcon com tampa de rosca plana). Este processo foi repetido várias vezes para coletar maiores volumes de saliva (2-5 ml). A saliva foi transferida por meio de pipetas estéreis para tubos de centrífuga estéreis rotulados que foram armazenados a -70˚C até o uso.

A placa supragengival foi coletada com uma cureta de 2 molares (#16 e #36), 2 pré-molares (#24 e #44) e 2 incisivos (#21 e #41); A coleta de placa envolveu o uso de uma cureta Gracey para remover toda a placa supragengival da superfície vestibular do dente indicador selecionado com tantos golpes quanto necessário. A ponta da cureta foi imersa no tampão estéril DNase-free Tris-EDTA (TE) no tubo de centrífuga por 4-5 segundos. A face da cureta foi enxugada na borda interna do tubo coletor e, a seguir, enxugada com gaze estéril para que o tampão da ponta não entrasse na boca do paciente. O local foi imediatamente amostrado novamente usando o mesmo procedimento. A tampa do tubo foi recolocada e então o tubo agitado por 4-5 segundos na tentativa de maximizar a dispersão da amostra no fluido. O tubo foi imediatamente colocado no gelo em um saco Ziploc e armazenado a -70˚C até o uso. As amostras foram rotuladas por grupo (A/B), período de tratamento (1/2), goma utilizada (X/S no caso de amostras coletadas ao final de um determinado período de tratamento) e tipo (saliva(s) ou placa (p)). As amostras (n=232) foram então enviadas em gelo seco para o Instituto J. Craig Venter (JCVI) EUA, campus de La Jolla para extração e sequenciamento de DNA.

Extração de DNA: As amostras foram descongeladas a 4˚C e submetidas a vórtice completamente antes da extração de DNA de 500ul de saliva ou suspensão de placa usando tubos Lysing Matrix B de batimento de esferas (MPBio Inc.), depois digerido com lisozima, extração com álcool isoamílico de fenol/clorofórmio e precipitação com etanol . O DNA precipitado foi ressuspenso em tampão TE 1x.

Preparação e Sequenciamento da Biblioteca: O DNA de cada amostra foi quantificado usando um espectrofotômetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Os amplicons foram gerados usando adaptadores e iniciadores de reação em cadeia da polimerase (PCR) ligados por código de barras visando a região V4 do gene 16S rDNA (16S) e purificados usando kits de purificação Qiaquick PCR (Qiagen, Inc) seguindo as instruções do fabricante. Amplicons purificados foram quantificados usando SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), normalizados para garantir quantidades equimolares de cada amostra e agrupados em preparação para sequenciamento Illumina MiSEQ. O conjunto da biblioteca 16S foi sequenciado usando o kit de química Illumina MiSEQ dual index 2x250bp V2 de acordo com as especificações do fabricante.

Processamento de dados de sequência de RNA 16S: as sequências para cada amostra foram agrupadas de acordo com os índices duplos correspondentes e exportadas como arquivos .fastq individuais arquivos usando CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, Califórnia). As sequências foram processadas para garantir que apenas sequências de qualidade fossem mantidas, pois configurações rigorosas foram mantidas para garantir que nenhuma incompatibilidade de código de barras fosse permitida durante a demultiplexação. As sequências processadas foram aplicadas ao pipeline Infernal [35] para verificações adicionais de controle de qualidade (QC). As sequências bacterianas foram atribuídas taxonomicamente com base no banco de dados de RNA ribossômico 16S baseado em genoma (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/).

Análise estatística. A distribuição por idade, sexo e pontuação do CPOD para indivíduos nos grupos A e B foram comparadas usando o teste T de amostras independentes, o teste qui-quadrado de Pearson e o teste de soma de classificação de Wilcoxon, respectivamente, com um ponto de corte de p