Effets du xylitol et du sorbitol sur le microbiome oral

Sujets : Les protocoles d'étude ont été approuvés par les comités d'éthique de l'UWI, St. Augustine. Trente volontaires sains de l'Université des Antilles (UWI), St. Augustine, Trinidad ont été inscrits à l'étude. Pour être éligibles, les sujets doivent avoir eu au moins 20 dents, fourni un consentement éclairé écrit et être disposés à se conformer aux procédures de l'étude. Sujets atteints de maladies systémiques, infectieuses ou inflammatoires ou prenant des médicaments, des antibiotiques ou du fluorure au cours du dernier mois, consommateurs habituels de produits et de bains de bouche contenant du xylitol/sorbitol, avec un flux salivaire anormal (

Gommes à mâcher : La gomme xylitol (Epic Spearmint ; 1,5 g/pastille) désignée Gum X contient 70 % de xylitol en plus de la base de gomme, des arômes naturels, de la lécithine de soja, de la gomme arabique, du dioxyde de titane, de la cire de carnuba. La gomme S (Eclipse Spearmint) était similaire, sauf que le xylitol a été remplacé par 63 % de sorbitol et 2 % de maltitol et l'aspartame a été inclus. Les gommes étaient emballées dans des contenants à code couleur. Les codes ont été gardés confidentiels pour les participants et les chercheurs qui ont interagi avec eux jusqu'à la fin de l'étude.

Conception de l'étude : Cette étude prospective croisée, à double insu et randomisée a duré 14 semaines (mars - juin 2015). Tout au long de l'étude, les sujets ont reçu pour instruction de ne pas utiliser de bains de bouche ou de produits à base de xylitol, de suivre un régime alimentaire normal, de poursuivre leur brossage de dents habituel et de signaler l'utilisation de médicaments antimicrobiens. Les sujets signalant ce dernier ont été abandonnés.

Les sujets ont été répartis au hasard en deux groupes, A et B (voir Figure 1). Les deux groupes sont entrés dans une "période de sevrage" de 4 semaines au cours de laquelle aucune gomme n'a été mâchée, suivie d'une période de traitement de 3 semaines (période de traitement 1) au cours de laquelle le groupe A a utilisé la gomme X et le groupe B a utilisé la gomme S (2 morceaux de gomme, 3 fois par jour après les repas pendant 6 minutes). Les deux groupes ont ensuite subi une autre période de sevrage de 4 semaines avant d'entrer dans la période de traitement 2 au cours de laquelle le groupe A a utilisé la gomme S et le groupe B a utilisé la gomme X pendant 3 semaines.

Collecte d'échantillons : La salive et la plaque ont été prélevées sur les participants immédiatement avant et après chaque période de traitement (Figure 1). Les sujets ont reçu pour instruction de ne pas se brosser les dents ni d'utiliser d'autres procédures d'hygiène bucco-dentaire au moins 24 heures avant le prélèvement de l'échantillon, et de ne pas manger ni boire au moins 1 heure avant. Pour la collecte de salive, les sujets ont mâché de la cire de paraffine stérile et la salive entière produite a été collectée pendant 5 minutes dans des tubes stériles. On a demandé au sujet de baver dans le tube de prélèvement étiqueté de 50 ml (tube en polypropylène conique stérile Falcon avec bouchon à vis plat). Ce processus a été répété plusieurs fois afin de recueillir de plus grands volumes de salive (2-5 ml). La salive a été transférée via des pipettes stériles dans des tubes à centrifuger stériles étiquetés qui ont été stockés à -70°C jusqu'à utilisation.

La plaque supragingivale a été collectée avec une curette à partir de 2 molaires (#16 et #36), 2 prémolaires (#24 et #44) et 2 incisives (#21 et #41); La collecte de la plaque impliquait l'utilisation d'une curette Gracey pour éliminer toute la plaque supragingivale de la surface buccale de la dent index sélectionnée avec autant de coups que nécessaire. La pointe de la curette a été immergée dans le tampon stérile Tris-EDTA (TE) sans DNase dans le tube de centrifugation pendant 4 à 5 secondes. La face de la curette a été essuyée sur le bord intérieur du tube de prélèvement, puis essuyée avec de la gaze stérile afin de ne pas laisser le tampon sur la pointe entrer dans la bouche du patient. Le site a ensuite été immédiatement échantillonné à nouveau selon la même procédure. Le couvercle sur le tube a été remis en place, puis le tube a été secoué pendant 4 à 5 secondes dans le but de maximiser la dispersion de l'échantillon dans le fluide. Le tube a été immédiatement placé sur de la glace dans un sac Ziploc et stocké à -70°C jusqu'à utilisation. Les échantillons ont été étiquetés par groupe (A/B), période de traitement (1/2), gomme utilisée (X/S dans le cas des échantillons prélevés à la fin d'une période de traitement donnée) et type (salive(s) ou plaque (p)). Les échantillons (n ​​= 232) ont ensuite été expédiés sur de la neige carbonique au J. Craig Venter Institute (JCVI) USA, campus de La Jolla pour l'extraction et le séquençage de l'ADN.

Extraction d'ADN : les échantillons ont été décongelés à 4 °C et soigneusement vortexés avant l'extraction d'ADN à partir de 500 ul de suspension de salive ou de plaque à l'aide de tubes Lysing Matrix B (MPBio Inc.), puis de digestion de lysozyme, d'extraction d'alcool isoamylique au phénol/chloroforme et de précipitation à l'éthanol. . L'ADN précipité a été remis en suspension dans du tampon 1x TE.

Préparation et séquençage de la bibliothèque : l'ADN de chaque échantillon a été quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Des amplicons ont été générés à l'aide d'amorces de réaction en chaîne par polymérase (PCR) ligaturées par adaptateur et code-barres ciblant la région V4 du gène d'ADNr 16S (16S) et purifiés à l'aide de kits de purification Qiaquick PCR (Qiagen, Inc) conformément aux instructions du fabricant. Les amplicons purifiés ont été quantifiés à l'aide de SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), normalisés pour garantir des quantités équimolaires de chaque échantillon et regroupés en vue du séquençage Illumina MiSEQ. Le pool de bibliothèques 16S a été séquencé à l'aide du kit de chimie Illumina MiSEQ dual index 2x250bp V2 conformément aux spécifications du fabricant.

Traitement des données de séquence d'ARN 16S : les séquences de chaque échantillon ont été regroupées selon les indices doubles correspondants et exportées en tant que .fastq individuel fichiers utilisant CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, Californie). Les séquences ont été traitées pour s'assurer que seules les séquences de qualité ont été conservées, car des paramètres rigoureux ont été conservés pour s'assurer qu'aucune discordance de code à barres n'était autorisée pendant le démultiplexage. Les séquences traitées ont été appliquées au pipeline Infernal [35] pour des contrôles de qualité (CQ) supplémentaires. Les séquences bactériennes ont été assignées taxonomiquement sur la base de la base de données d'ARN ribosomal 16S basée sur la génomique (GRD ; http://metasystems.riken.jp/grd/).

Analyses statistiques. La distribution par âge, sexe et score DMFT pour les sujets des groupes A et B a été comparée à l'aide du test T pour échantillons indépendants, du test du chi carré de Pearson et du test de somme des rangs de Wilcoxon, respectivement, avec un seuil de p