Xylitol- og sorbitoleffekter på det orale mikrobiomet

Emner: Studieprotokoller ble godkjent av de etiske komiteene ved UWI, St. Augustine. Tretti friske frivillige fra University of the West Indies (UWI), St. Augustine, Trinidad ble registrert i studien. For å være kvalifisert må forsøkspersonene ha hatt minst 20 tenner, gitt skriftlig informert samtykke og vært villige til å følge studieprosedyrene. Personer med systemiske, smittsomme eller inflammatoriske sykdommer eller som har tatt medisiner, antibiotika eller fluor den siste måneden, vanlige forbrukere av produkter som inneholder xylitol/sorbitol og munnskylling, med unormal spyttstrøm (

Tyggegummi: Xylitolgummi (Epic Spearmint; 1,5g/pellet) betegnet Gum X inneholder 70 % xylitol i tillegg til tannkjøttbase, naturlige smaker, soyalecitin, gummi arabicum, titandioksid, karnubavoks. Gum S (Eclipse Spearmint), var lik bortsett fra at xylitol ble erstattet med 63 % sorbitol og 2 % maltitol og aspartam ble inkludert. Tannkjøttet ble pakket i fargekodede beholdere. Koder ble holdt konfidensielle fra deltakerne og forskerne som samhandlet med dem inntil studien var fullført.

Studiedesign: Denne prospektive cross-over, dobbeltblinde, randomiserte studien varte i 14 uker (mars - juni 2015). Gjennomgående ble forsøkspersonene instruert om ikke å bruke munnvann eller xylitolprodukter, å spise et normalt kosthold, fortsette sin vanlige tannpuss og rapportere bruk av antimikrobielle medisiner. Emner som rapporterte sistnevnte ble henlagt.

Forsøkspersonene ble tilfeldig fordelt i to grupper, A og B (se figur 1). Begge gruppene gikk inn i en 4-ukers "utvaskingsperiode" der ingen tyggegummi ble tygget, etterfulgt av en 3-ukers behandlingsperiode (behandlingsperiode 1) hvor gruppe A brukte tyggegummi X og gruppe B brukte tyggegummi S (2 tyggegummibiter, 3 ganger daglig etter måltider i 6 minutter). Begge gruppene gjennomgikk deretter en ny 4-ukers utvaskingsperiode før de gikk inn i behandlingsperiode 2 der gruppe A brukte Gum S og Gruppe B brukte Gum X i 3 uker.

Prøvetaking: Spytt og plakk ble samlet inn fra deltakerne rett før og etter hver behandlingsperiode (Figur 1). Forsøkspersonene ble bedt om å ikke pusse tennene eller bruke andre munnhygieneprosedyrer minst 24 timer før prøvetaking, og ikke spise eller drikke minst 1 time før. For spyttoppsamling ble forsøkspersonene tygget steril parafinvoks, og hel spytt ble samlet i 5 minutter i sterile rør. Forsøkspersonen ble bedt om å sikle i det merkede 50 ml oppsamlingsrøret (Falcon sterilt, konisk polypropylenrør med flatt skrukork). Denne prosessen ble gjentatt flere ganger for å samle større mengder spytt (2-5 ml). Spyttet ble overført via sterile pipetter til merkede sterile sentrifugerør som ble lagret ved -70˚C frem til bruk.

Supragingival plakk ble samlet med en curette fra 2 molarer (#16 og #36), 2 premolarer (#24 og #44) og 2 fortenner (#21 og #41); Plakksamling innebar bruk av en Gracey-kyrett for å fjerne all supragingival plakk fra den bukkale overflaten av den valgte indekstannen med så mange slag som nødvendig. Curettespissen ble nedsenket i den sterile DNase-frie Tris-EDTA (TE) bufferen i sentrifugerøret i 4-5 sekunder. Forsiden av kyretten ble tørket på innsiden av oppsamlingsrøret og deretter tørket av med sterilt gasbind for ikke å la bufferen på tuppen gå inn i pasientens munn. Stedet ble deretter umiddelbart tatt prøver igjen ved å bruke samme prosedyre. Lokket på røret ble satt på igjen og deretter ristet røret i 4-5 sekunder i et forsøk på å maksimere spredningen av prøven i væsken. Røret ble umiddelbart plassert på is i en Ziploc-pose og lagret ved -70˚C frem til bruk. Prøver ble merket etter gruppe (A/B), behandlingsperiode (1/2), tyggegummi brukt (X/S for de prøvene som ble samlet inn ved slutten av en gitt behandlingsperiode) og type (spytt(er) eller plakk (p)). Prøver (n=232) ble deretter sendt på tørris til J. Craig Venter Institute (JCVI) USA, La Jolla campus for DNA-ekstraksjon og sekvensering.

DNA-ekstraksjon: Prøver ble tint ved 4˚C og vortexet grundig før DNA-ekstraksjon fra 500 ul spytt- eller plakksuspensjon ved bruk av perleslagende Lysing Matrix B-rør (MPBio Inc.), deretter lysozymfordøyelse, fenol/kloroform isoamylalkoholekstraksjon og etanolutfelling . Utfelt DNA ble resuspendert i 1x TE-buffer.

Bibliotekforberedelse og sekvensering: DNA fra hver prøve ble kvantifisert ved bruk av et Nanodrop-spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Amplikoner ble generert ved bruk av adapter og strekkodeligert polymerasekjedereaksjon (PCR)-primere rettet mot V4-regionen til 16S rDNA-genet (16S) og renset ved bruk av Qiaquick PCR-rensesett (Qiagen, Inc) etter produsentens instruksjoner. Rensede amplikoner ble kvantifisert ved bruk av SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), normalisert for å sikre ekvimolare mengder av hver prøve, og samlet som forberedelse til Illumina MiSEQ-sekvensering. 16S-biblioteket ble sekvensert ved å bruke Illumina MiSEQ dual index 2x250bp V2 kjemisett i henhold til produsentens spesifikasjoner.

16S RNA-sekvensdatabehandling: Sekvenser for hver prøve ble lagret i henhold til tilsvarende doble indekser og eksportert som individuelle .fastq filer som bruker CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, CA). Sekvenser ble behandlet for å sikre at bare kvalitetssekvenser ble beholdt, da strenge innstillinger ble beholdt for å sikre at ingen strekkodefeil ble tillatt under demultipleksing. Behandlede sekvenser ble brukt på Infernal-rørledningen [35] for ytterligere kvalitetskontroll (QC) kontroller. Bakteriesekvenser ble taksonomisk tildelt basert på den genomisk-baserte 16S ribosomale RNA-databasen (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/).

Statistiske analyser. Fordeling etter alder, kjønn og DMFT-poengsum for forsøkspersoner i gruppe A og B ble sammenlignet ved å bruke uavhengige prøver T-test, Pearson's Chi-Squared test og Wilcoxon rangsumtest, med en cut-off på p