Xylitol och sorbitol effekter på det orala mikrobiomet

Ämnen: Studieprotokollen godkändes av de etiska kommittéerna vid UWI, St. Augustine. Trettio friska frivilliga från University of the West Indies (UWI), St. Augustine, Trinidad ingick i studien. För att vara berättigade måste försökspersoner ha haft minst 20 tänder, lämnat skriftligt informerat samtycke och varit villiga att följa studieprocedurer. Personer med systemiska, infektionssjukdomar eller inflammatoriska sjukdomar eller som tagit mediciner, antibiotika eller fluor under den senaste månaden, vanliga konsumenter av produkter som innehåller xylitol/sorbitol och munsköljningar, med onormalt salivflöde (

Tuggummin: Xylitolgummi (Epic Spearmint; 1,5 g/pellet) betecknat Gum X innehåller 70 % xylitol förutom gummibas, naturliga smakämnen, sojalecitin, gummi arabicum, titandioxid, karnubavax. Gum S (Eclipse Spearmint), var liknande förutom att xylitol ersattes med 63 % sorbitol och 2 % maltitol och aspartam inkluderades. Gummi packades i färgkodade behållare. Koder hölls konfidentiella från deltagarna och forskarna som interagerade med dem tills studien avslutades.

Studiedesign: Denna prospektiva dubbelblinda, randomiserade studie varade i 14 veckor (mars - juni 2015). Under hela tiden instruerades försökspersonerna att inte använda munvatten eller xylitolprodukter, att äta en normal kost, fortsätta sin vanliga tandborstning och att rapportera användning av antimikrobiella läkemedel. Ämnen som rapporterade det sistnämnda lades ner.

Försökspersonerna fördelades slumpmässigt i två grupper, A och B (se figur 1). Båda grupperna gick in i en 4-veckors "tvättningsperiod" under vilken inget tuggummi tuggades, följt av en 3-veckors behandlingsperiod (behandlingsperiod 1) under vilken Grupp A använde Gum X och Grupp B använde Gum S (2 tuggummibitar, 3 gånger dagligen efter måltid i 6 minuter). Båda grupperna genomgick sedan ytterligare en 4-veckors tvättperiod innan de gick in i behandlingsperiod 2 under vilken grupp A använde Gum S och Grupp B använde Gum X i 3 veckor.

Provtagning: Saliv och plack samlades in från deltagarna omedelbart före och efter varje behandlingsperiod (Figur 1). Försökspersonerna instruerades att inte borsta tänderna eller använda andra munhygieniska procedurer minst 24 timmar före provtagningen och att inte äta eller dricka minst 1 timme innan. För salivuppsamling tuggade försökspersonerna sterilt paraffinvax och hel saliv som producerades samlades upp under 5 minuter i sterila rör. Försökspersonen ombads att dregla in i det märkta 50 ml uppsamlingsröret (Falcon sterilt, koniskt polypropenrör med platt skruvlock). Denna process upprepades flera gånger för att samla in större volymer saliv (2-5 ml). Saliven överfördes via sterila pipetter till märkta sterila centrifugrör som förvarades vid -70˚C fram till användning.

Supragingival plack uppsamlades med en curette från 2 molarer (#16 och #36), 2 premolarer (#24 och #44) och 2 framtänder (#21 och #41); Plackuppsamling involverade att använda en Gracey-kyrett för att avlägsna allt supragingivalt plack från den buckala ytan på den valda indextanden med så många drag som nödvändigt. Kyrettspetsen nedsänktes i den sterila DNas-fria Tris-EDTA (TE) bufferten i centrifugröret under 4-5 sekunder. Ytan på kyretten torkades på insidan av uppsamlingsröret och torkades sedan av med steril gasväv för att inte låta bufferten på spetsen gå in i patientens mun. Stället togs sedan omedelbart igen med samma procedur. Locket på röret sattes tillbaka och sedan skakades röret under 4-5 sekunder i ett försök att maximera spridningen av provet i vätskan. Röret placerades omedelbart på is i en Ziploc-påse och förvarades vid -70˚C fram till användning. Proverna märktes efter grupp (A/B), behandlingsperiod (1/2), tuggummi som användes (X/S i fallet med de prover som tagits i slutet av en given behandlingsperiod) och typ (saliv(er) eller plack (p)). Prover (n=232) skickades sedan på torris till J. Craig Venter Institute (JCVI) USA, La Jolla campus för DNA-extraktion och sekvensering.

DNA-extraktion: Prover tinades vid 4˚C och vortexades noggrant före DNA-extraktion från 500 ul saliv eller placksuspension med pärlslagande Lysing Matrix B-rör (MPBio Inc.), sedan lysozymuppslutning, fenol/kloroform isoamylalkoholextraktion och etanolfällning . Utfällt DNA återsuspenderades i 1x TE-buffert.

Biblioteksberedning och sekvensering: DNA från varje prov kvantifierades med användning av en Nanodrop-spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Amplikoner genererades med hjälp av adapter och streckkodsligerade polymeraskedjereaktions (PCR)-primrar riktade mot V4-regionen av 16S rDNA-genen (16S) och renades med Qiaquick PCR-reningskit (Qiagen, Inc) enligt tillverkarens instruktioner. Renade amplikoner kvantifierades med SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), normaliserades för att säkerställa ekvimolära kvantiteter av varje prov och slogs samman som förberedelse för Illumina MiSEQ-sekvensering. 16S-bibliotekspoolen sekvenserades med hjälp av Illumina MiSEQ dual index 2x250bp V2 kemi kit enligt tillverkarens specifikationer.

16S RNA-sekvensdatabearbetning: Sekvenser för varje prov lagrades enligt motsvarande dubbla index och exporterades som individuella .fastq filer med CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, CA). Sekvenser bearbetades för att säkerställa att endast kvalitetssekvenser behölls, eftersom stränga inställningar behölls för att säkerställa att inga streckkodsfelmatchningar tillåts under demultiplexering. Bearbetade sekvenser applicerades på Infernal pipeline [35] för ytterligare kvalitetskontroller (QC). Bakteriesekvenser tilldelades taxonomiskt baserat på den genomiska 16S ribosomala RNA-databasen (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/).

Statistiska analyser. Fördelning efter ålder, kön och DMFT-poäng för försökspersoner i grupp A och B jämfördes med T-test med oberoende prover, Pearsons Chi-Squared test respektive Wilcoxon ranksummetest, med en cut-off på p