Effetti di xilitolo e sorbitolo sul microbioma orale

Soggetti: i protocolli di studio sono stati approvati dai comitati etici dell'UWI, St. Augustine. Trenta volontari sani dell'Università delle Indie Occidentali (UWI), St. Augustine, Trinidad sono stati arruolati nello studio. Per essere idonei, i soggetti devono aver avuto almeno 20 denti, aver fornito il consenso informato scritto ed essere disposti a rispettare le procedure dello studio. Soggetti con malattie sistemiche, infettive o infiammatorie o che assumono farmaci, antibiotici o fluoro nell'ultimo mese, consumatori abituali di prodotti contenenti xilitolo/sorbitolo e collutori, con flusso salivare anomalo (

Gomme da masticare: la gomma xilitolo (menta verde epica; 1,5 g/pellet) denominata gomma X contiene il 70% di xilitolo oltre alla gomma base, aromi naturali, lecitina di soia, gomma arabica, biossido di titanio, cera di carnuba. La gomma S (Eclipse Spearmint), era simile tranne per il fatto che lo xilitolo è stato sostituito dal 63% di sorbitolo ed è stato incluso il 2% di maltitolo e aspartame. Le gengive erano confezionate in contenitori con codice colore. I codici sono stati mantenuti riservati dai partecipanti e dai ricercatori che hanno interagito con loro fino al completamento dello studio.

Disegno dello studio: questo studio prospettico cross-over, in doppio cieco, randomizzato è durato 14 settimane (marzo - giugno 2015). Per tutto il tempo, i soggetti sono stati istruiti a non usare collutori o prodotti a base di xilitolo, a seguire una dieta normale, a continuare a lavarsi i denti abitualmente e a segnalare l'uso di farmaci antimicrobici. I soggetti che hanno segnalato quest'ultimo sono stati eliminati.

I soggetti sono stati assegnati in modo casuale a due gruppi, A e B (vedi Figura 1). Entrambi i gruppi sono entrati in un "periodo di washout" di 4 settimane durante il quale non è stata masticata gomma, seguito da un periodo di trattamento di 3 settimane (periodo di trattamento 1) durante il quale il gruppo A ha usato la gomma X e il gruppo B ha usato la gomma S (2 pezzi di gomma, 3 volte al giorno dopo i pasti per 6 minuti). Entrambi i gruppi sono stati quindi sottoposti a un altro periodo di washout di 4 settimane prima di entrare nel periodo di trattamento 2 durante il quale il gruppo A ha utilizzato la gomma S e il gruppo B ha utilizzato la gomma X per 3 settimane.

Raccolta del campione: la saliva e la placca sono state raccolte dai partecipanti immediatamente prima e dopo ogni periodo di trattamento (Figura 1). I soggetti sono stati istruiti a non lavarsi i denti o utilizzare altre procedure di igiene orale almeno 24 ore prima della raccolta del campione e a non mangiare o bere almeno 1 ora prima. Per la raccolta della saliva, i soggetti hanno masticato paraffina sterile e tutta la saliva prodotta è stata raccolta per 5 minuti in provette sterili. Al soggetto è stato chiesto di sbavare nella provetta di raccolta da 50 ml etichettata (provetta in polipropilene conica sterile Falcon con tappo a vite piatto). Questo processo è stato ripetuto più volte per raccogliere maggiori volumi di saliva (2-5 ml). La saliva è stata trasferita tramite pipette sterili in provette da centrifuga sterili etichettate che sono state conservate a -70°C fino al momento dell'uso.

La placca sopragengivale è stata raccolta con una curette da 2 molari (#16 e #36), 2 premolari (#24 e #44) e 2 incisivi (#21 e #41); La raccolta della placca prevedeva l'utilizzo di una curette di Gracey per rimuovere tutta la placca sopragengivale dalla superficie buccale del dente indice selezionato con tutti i passaggi necessari. La punta della curette è stata immersa nel tampone sterile Tris-EDTA (TE) privo di DNasi nella provetta da centrifuga per 4-5 secondi. La faccia della curette è stata pulita sul bordo interno del tubo di raccolta e poi rimossa con garza sterile in modo da non far entrare il tampone sulla punta nella bocca del paziente. Il sito è stato quindi immediatamente nuovamente campionato utilizzando la stessa procedura. Il coperchio sulla provetta è stato sostituito e quindi la provetta è stata agitata per 4-5 secondi nel tentativo di massimizzare la dispersione del campione nel fluido. La provetta è stata immediatamente posta sul ghiaccio in un sacchetto Ziploc e conservata a -70°C fino al momento dell'uso. I campioni sono stati etichettati per gruppo (A/B), periodo di trattamento (1/2), gomma utilizzata (X/S nel caso di quei campioni raccolti alla fine di un determinato periodo di trattamento) e tipo (saliva/e o placca (p)). I campioni (n=232) sono stati quindi spediti su ghiaccio secco al J. Craig Venter Institute (JCVI) USA, campus di La Jolla per l'estrazione e il sequenziamento del DNA.

Estrazione del DNA: i campioni sono stati scongelati a 4°C e agitati accuratamente su vortex prima dell'estrazione del DNA da 500 ul di saliva o sospensione di placca utilizzando provette Lysing Matrix B (MPBio Inc.), quindi digerito con lisozima, estrazione con fenolo/cloroformio con alcool isoamilico e precipitazione con etanolo . Il DNA precipitato è stato risospeso in tampone TE 1x.

Preparazione e sequenziamento della libreria: il DNA di ciascun campione è stato quantificato utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Gli ampliconi sono stati generati utilizzando primer di reazione a catena della polimerasi (PCR) ligati con adattatore e codice a barre mirati alla regione V4 del gene 16S rDNA (16S) e purificati utilizzando i kit di purificazione PCR Qiaquick (Qiagen, Inc) seguendo le istruzioni del produttore. Gli ampliconi purificati sono stati quantificati utilizzando SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), normalizzati per garantire quantità equimolari di ciascun campione e raggruppati in preparazione per il sequenziamento Illumina MiSEQ. Il pool di librerie 16S è stato sequenziato utilizzando il kit chimico Illumina MiSEQ dual index 2x250bp V2 secondo le specifiche del produttore.

Elaborazione dei dati della sequenza dell'RNA 16S: le sequenze per ciascun campione sono state raggruppate in base ai corrispondenti doppi indici ed esportate come file .fastq individuali utilizzando CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, California). Le sequenze sono state elaborate per garantire che fossero conservate solo sequenze di qualità, poiché sono state mantenute impostazioni rigorose per garantire che durante il demultiplexing non fossero consentite mancate corrispondenze di codici a barre. Le sequenze elaborate sono state applicate alla pipeline Infernal [35] per ulteriori controlli di controllo qualità (QC). Le sequenze batteriche sono state assegnate tassonomicamente sulla base del database di RNA ribosomiale 16S basato su Genomic (GRD; //metasystems.riken.jp/grd/).

Analisi statistiche. La distribuzione per età, sesso e punteggio DMFT per i soggetti nei gruppi A e B sono stati confrontati utilizzando rispettivamente il test T per campioni indipendenti, il test Chi-quadrato di Pearson e il test della somma dei ranghi di Wilcoxon, con un cut-off di p