木糖醇和山梨糖醇对口腔微生物群的影响

受试者：研究方案得到了圣奥古斯丁 UWI 伦理委员会的批准。 来自特立尼达圣奥古斯丁的西印度群岛大学 (UWI) 的 30 名健康志愿者参加了这项研究。 要符合资格，受试者必须至少有 20 颗牙齿，提供书面知情同意书并愿意遵守研究程序。 最近一个月患有全身性、感染性或炎症性疾病或服用过药物、抗生素或氟化物，经常食用含木糖醇/山梨糖醇的产品和漱口水，唾液流量异常（

口香糖：木糖醇口香糖（Epic Spearmint；1.5 克/粒）指定 Gum X 除了胶基、天然香料、大豆卵磷脂、阿拉伯树胶、二氧化钛、巴西棕榈蜡外，还含有 70% 的木糖醇。 Gum S (Eclipse Spearmint) 类似，只是木糖醇被 63% 的山梨糖醇和 2% 的麦芽糖醇替代，并且包括阿斯巴甜。 口香糖包装在颜色编码的容器中。 在研究完成之前，代码对与他们互动的参与者和研究人员保密。

研究设计：这项前瞻性交叉、双盲、随机研究持续了 14 周（2015 年 3 月至 6 月）。 自始至终，受试者都被指示不要使用漱口水或木糖醇产品，进行正常饮食，继续他们通常的刷牙并报告使用抗菌药物。 报告后者的受试者被删除。

受试者被随机分配到两组，A 和 B（见图 1）。 两组均进入为期 4 周的“清除期”，在此期间不咀嚼口香糖，随后是 3 周的治疗期（治疗期 1），在此期间 A 组使用口香糖 X，B 组使用口香糖 S（2 块口香糖，3每天饭后 6 分钟）。 然后两组在进入治疗期 2 之前又经历了 4 周的清除期，在此期间，A 组使用口香糖 S，B 组使用口香糖 X，持续 3 周。

样本采集：在每个治疗期之前和之后立即从参与者身上收集唾液和牙菌斑（图 1）。 指示受试者在样本采集前至少 24 小时不要刷牙或使用任何其他口腔卫生程序，并且至少在样本采集前 1 小时不要进食或饮水。 对于唾液收集，受试者咀嚼无菌石蜡并将产生的全部唾液收集在无菌管中 5 分钟。 受试者被要求将口水流进带标签的 50ml 收集管（Falcon 无菌、带平顶螺旋盖的锥形聚丙烯管）。 多次重复此过程以收集更大量的唾液（2-5 毫升）。 通过无菌移液器将唾液转移到标记的无菌离心管中，这些离心管在-70°C 下储存直至使用。

用刮匙从 2 颗磨牙（#16 和#36）、2 颗前磨牙（#24 和#44）和 2 颗切牙（#21 和#41）收集龈上菌斑；牙菌斑收集包括使用 Gracey 刮匙从所选指数牙齿的颊表面去除所有龈上牙菌斑，必要时进行多次。 将刮匙尖端浸入离心管中的无菌无 DNase Tris-EDTA (TE) 缓冲液中 4-5 秒。 刮匙的表面在收集管的内边缘上擦拭，然后用无菌纱布擦拭，以免尖端上的缓冲液进入患者口中。 然后立即使用相同的程序再次对该站点进行采样。 盖上管子的盖子，然后摇动管子 4-5 秒，以尝试最大限度地分散样品在液体中。 立即将试管放在 Ziploc 袋中的冰上，并储存在 -70°C 下直至使用。 样本按组 (A/B)、治疗期 (1/2)、使用的口香糖（X/S，对于在给定治疗期结束时收集的样本）和类型（唾液或牙菌斑）进行标记(p)). 然后将样本 (n=232) 用干冰运送到美国拉霍亚校区的 J. Craig Venter Institute (JCVI) 进行 DNA 提取和测序。

DNA 提取：样品在 4˚C 下解冻并彻底涡旋，然后使用珠打裂解矩阵 B 管（MPBio Inc.）从 500ul 唾液或斑块悬浮液中提取 DNA，然后进行溶菌酶消化、苯酚/氯仿异戊醇提取和乙醇沉淀. 沉淀的 DNA 重新悬浮在 1x TE 缓冲液中。

文库制备和测序：使用 Nanodrop 分光光度计（Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA）对每个样本的 DNA 进行定量。 使用针对 16S rDNA 基因 (16S) V4 区的接头和条形码连接的聚合酶链反应 (PCR) 引物生成扩增子，并按照制造商的说明使用 Qiaquick PCR 纯化试剂盒 (Qiagen, Inc) 进行纯化。 纯化的扩增子使用 SybrGold（Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA）进行量化，标准化以确保每个样品的等摩尔量，并汇集以准备 Illumina MiSEQ 测序。 根据制造商的规格，使用 Illumina MiSEQ 双索引 2x250bp V2 化学试剂盒对 16S 库池进行排序。

16S RNA 序列数据处理：每个样本的序列根据相应的双索引进行分类，并导出为单独的 .fastq 使用 CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. 加利福尼亚州拉霍亚）。 处理序列以确保只保留质量序列，因为保留了严格的设置以确保在多路分解期间不允许条形码不匹配。 处理后的序列被应用于 Infernal 管道 [35] 以进行额外的质量控制 (QC) 检查。 细菌序列根据基于基因组的 16S 核糖体 RNA 数据库（GRD；http://metasystems.riken.jp/grd/）进行分类分配。

统计分析。 分别使用独立样本 T 检验、Pearson 卡方检验和 Wilcoxon 秩和检验比较 A 组和 B 组受试者的年龄、性别和 DMFT 分数分布，截止值为 p