Účinky xylitolu a sorbitolu na orální mikrobiom

Předměty: Protokoly studie byly schváleny etickými komisemi UWI, St. Augustine. Do studie bylo zařazeno třicet zdravých dobrovolníků z University of the West Indies (UWI), St. Augustine, Trinidad. Aby byly subjekty způsobilé, musí mít alespoň 20 zubů, poskytnout písemný informovaný souhlas a být ochotni dodržovat studijní postupy. Subjekty se systémovými, infekčními nebo zánětlivými onemocněními nebo užívající léky, antibiotika nebo fluor v posledním měsíci, obvyklí konzumenti přípravků obsahujících xylitol / sorbitol a ústní vody, s abnormálním průtokem slin (

Žvýkačky: Xylitolová guma (Epic Spearmint; 1,5 g/peleta) označená jako Gum X obsahuje kromě gumové báze 70 % xylitolu, přírodní příchutě, sójový lecitin, arabskou gumu, oxid titaničitý, karnaubský vosk. Gum S (Eclipse Spearmint) byl podobný až na to, že xylitol byl nahrazen 63% sorbitolem a 2% maltitol a aspartam byly zahrnuty. Žvýkačky byly baleny do barevně označených nádob. Kódy byly důvěrné od účastníků a výzkumníků, kteří s nimi komunikovali, až do dokončení studie.

Design studie: Tato prospektivní zkřížená, dvojitě zaslepená, randomizovaná studie trvala 14 týdnů (březen - červen 2015). Po celou dobu byly subjekty instruovány, aby nepoužívaly ústní vody nebo xylitolové produkty, konzumovaly normální stravu, pokračovaly v obvyklém čištění zubů a hlásily užívání antimikrobiálních léků. Subjekty uvádějící posledně uvedené byly vyřazeny.

Subjekty byly náhodně rozděleny do dvou skupin, A a B (viz obrázek 1). Obě skupiny vstoupily do 4týdenního „období vymývání“, během kterého nebyla žvýkaná žádná žvýkačka, následovalo 3týdenní období léčby (období léčby 1), během kterého skupina A používala gumu X a skupina B používala gumu S (2 kousky gumy, 3 denně po jídle po dobu 6 minut). Obě skupiny pak podstoupily další 4týdenní vymývací období před vstupem do léčebného období 2, během kterého skupina A používala gumu S a skupina B používala gumu X po dobu 3 týdnů.

Odběr vzorků: Sliny a plak byly účastníkům odebrány bezprostředně před a po každém období léčby (obrázek 1). Subjekty byly instruovány, aby si nečistily zuby nebo nepoužívaly žádné jiné postupy ústní hygieny alespoň 24 hodin před odběrem vzorku a nejedly ani nepily alespoň 1 hodinu před. Pro odběr slin jedinci žvýkali sterilní parafinový vosk a celé vytvořené sliny byly sbírány po dobu 5 minut do sterilních zkumavek. Subjekt byl požádán, aby slintal do označené 50ml odběrové zkumavky (Falcon sterilní, kuželovitá polypropylenová zkumavka s plochým šroubovacím uzávěrem). Tento proces byl několikrát opakován, aby se shromáždily větší objemy slin (2-5 ml). Sliny byly přeneseny pomocí sterilních pipet do označených sterilních centrifugačních zkumavek, které byly do použití skladovány při -70 °C.

Supragingivální plak byl odebrán kyretou ze 2 molárů (#16 a #36), 2 premolárů (#24 a #44) a 2 řezáků (#21 a #41); Odběr plaku zahrnoval použití kyrety Gracey k odstranění veškerého supragingiválního plaku z bukálního povrchu vybraného indexového zubu tolika tahy, kolik je potřeba. Špička kyrety byla ponořena do sterilního Tris-EDTA (TE) pufru bez DNázy v centrifugační zkumavce na 4-5 sekund. Přední strana kyrety se otřela o vnitřní okraj odběrové zkumavky a poté se setřela sterilní gázou, aby se pufr na špičce nedostal do úst pacienta. Místo bylo poté okamžitě znovu odebráno pomocí stejného postupu. Víko na zkumavce bylo nasazeno a poté zkumavka protřepávána po dobu 4-5 sekund ve snaze maximalizovat disperzi vzorku v tekutině. Zkumavka byla okamžitě umístěna na led v sáčku Ziploc a skladována při -70 °C až do použití. Vzorky byly označeny podle skupiny (A/B), doby léčby (1/2), použité gumy (X/S v případě vzorků odebraných na konci daného období léčby) a typu (sliny nebo plak (p)). Vzorky (n=232) byly poté odeslány na suchém ledu do J. Craig Venter Institute (JCVI) USA, kampus La Jolla pro extrakci a sekvenování DNA.

Extrakce DNA: Vzorky byly rozmraženy při 4 °C a důkladně promíchány před extrakcí DNA z 500 ul slin nebo suspenze plaku pomocí zkumavek Lysing Matrix B (MPBio Inc.), poté štěpení lysozymem, extrakce fenol/chloroform isoamylalkohol a srážení ethanolem . Precipitovaná DNA byla resuspendována v 1x TE pufru.

Příprava knihovny a sekvenování: DNA z každého vzorku byla kvantifikována pomocí spektrofotometru Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA). Amplikony byly vytvořeny s použitím adaptorových a čárových kódů ligovaných primerů pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) zacílených na oblast V4 genu 16S rDNA (16S) a purifikovány pomocí purifikačních souprav Qiaquick PCR (Qiagen, Inc) podle pokynů výrobce. Purifikované amplikony byly kvantifikovány pomocí SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA), normalizovány pro zajištění ekvimolárních množství každého vzorku a spojeny při přípravě pro sekvenování Illumina MiSEQ. Knihovna 16S byla sekvenována pomocí chemické soupravy Illumina MiSEQ dual index 2x250bp V2 podle specifikací výrobce.

Zpracování sekvenčních dat 16S RNA: Sekvence pro každý vzorek byly spojeny podle odpovídajících duálních indexů a exportovány jako jednotlivé .fastq soubory pomocí CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, CA). Sekvence byly zpracovány, aby bylo zajištěno, že budou zachovány pouze kvalitní sekvence, protože byla dodržena přísná nastavení, aby bylo zajištěno, že během demultiplexování nebudou povoleny žádné neshody čárových kódů. Zpracované sekvence byly aplikovány na potrubí Infernal [35] pro dodatečné kontroly kvality (QC). Bakteriální sekvence byly taxonomicky přiřazeny na základě databáze 16S ribozomální RNA založené na genomu (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/).

Statistické analýzy. Distribuce podle věku, pohlaví a skóre DMFT pro subjekty ve skupinách A a B byly porovnány pomocí T-testu na nezávislých vzorcích, Pearsonova Chi-Squared testu a Wilcoxonova rank sum testu, v tomto pořadí, s hraniční hodnotou p