구강 마이크로바이옴에 대한 자일리톨 및 소르비톨 효과

주제: 연구 프로토콜은 St. Augustine에 있는 UWI 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 트리니다드 주 세인트 어거스틴에 있는 서인도 제도 대학(UWI)의 건강한 지원자 30명이 이 연구에 등록했습니다. 적격 대상이 되려면 피험자는 치아가 20개 이상이어야 하며 서면 동의서를 제공하고 연구 절차를 기꺼이 준수해야 합니다. 전신성, 감염성 또는 염증성 질환이 있거나 최근 1개월 동안 약물, 항생제 또는 불소를 복용하고 있는 피험자, 자일리톨/소르비톨 함유 제품 및 구강 세정제를 상습적으로 섭취하고 비정상적인 타액 분비(

츄잉 껌: Gum X로 지정된 자일리톨 껌(Epic Spearmint; 1.5g/pellet)에는 껌 베이스, 천연 향료, 대두 레시틴, 아라비아 고무, 이산화티타늄, 카르누바 왁스 외에 70% 자일리톨이 함유되어 있습니다. Gum S(Eclipse Spearmint)는 자일리톨이 63% 소르비톨로 대체되고 2% 말티톨과 아스파탐이 포함된 것을 제외하고 유사했습니다. 잇몸은 색으로 구분된 용기에 포장되었습니다. 코드는 연구가 완료될 때까지 코드와 상호 작용한 참가자 및 연구원에게 기밀로 유지되었습니다.

연구 설계: 이 전향적 교차, 이중 맹검, 무작위 연구는 14주 동안 지속되었습니다(2015년 3월 - 6월). 전반적으로 피험자는 구강 세척제나 자일리톨 제품을 사용하지 말고 정상적인 식사를 하고 평소 양치질을 계속하고 항균 약물 사용을 보고하도록 지시받았습니다. 후자를 보고한 피험자는 제외되었습니다.

피험자는 A와 B의 두 그룹에 무작위로 할당되었습니다(그림 1 참조). 두 그룹 모두 껌을 씹지 않는 4주간의 "워시아웃 기간"에 들어간 후, 3주간의 치료 기간(치료 기간 1)에 들어가 A 그룹은 껌 X를, 그룹 B는 껌 S(껌 조각 2개, 3개)를 사용했습니다. 매일 식후 6분). 그런 다음 두 그룹 모두 치료 기간 2에 들어가기 전에 또 다른 4주간의 워시아웃 기간을 거쳤으며, 이 기간 동안 그룹 A는 껌 S를 사용하고 그룹 B는 껌 X를 3주 동안 사용했습니다.

샘플 수집: 각 치료 기간 직전과 직후 참가자로부터 타액과 플라크를 수집했습니다(그림 1). 피험자는 샘플 채취 최소 24시간 전에 양치질을 하거나 다른 구강 위생 절차를 사용하지 말고, 최소 1시간 전에는 먹거나 마시지 말라고 지시했습니다. 타액 채취는 피험자가 멸균 파라핀 왁스를 씹어 생성된 타액을 멸균 튜브에 5분 동안 채취하였다. 피험자에게 라벨이 붙은 50ml 수집 튜브(Falcon 살균, 평면 상단 나사 캡이 있는 원추형 폴리프로필렌 튜브)에 침을 흘리도록 요청했습니다. 더 많은 양의 타액(2-5ml)을 수집하기 위해 이 과정을 여러 번 반복했습니다. 타액은 멸균 피펫을 통해 라벨이 부착된 멸균 원심분리기 튜브로 옮겨져 사용할 때까지 -70˚C에서 보관되었습니다.

2개의 어금니(#16 및 #36), 2개의 소구치(#24 및 #44) 및 2개의 앞니(#21 및 #41)에서 큐렛으로 치은연 플라크를 수집했습니다. 플라크 수집은 Gracey 큐렛을 사용하여 선택된 인덱스 치아의 협측 표면에서 필요한 만큼의 스트로크로 모든 치은연 플라크를 제거하는 것과 관련이 있습니다. 큐렛 팁을 원심분리 튜브의 멸균 DNase-free Tris-EDTA(TE) 완충액에 4-5초 동안 담가두었습니다. 큐렛의 표면을 채집관 안쪽 가장자리로 닦은 후 팁에 있는 완충액이 환자의 입으로 들어가지 않도록 멸균 거즈로 닦아 냈다. 그런 다음 사이트는 동일한 절차를 사용하여 즉시 다시 샘플링되었습니다. 튜브의 뚜껑을 교체한 다음 유체에서 시편의 분산을 최대화하기 위해 튜브를 4-5초 동안 흔들었습니다. 튜브를 즉시 Ziploc 백에 얼음 위에 놓고 사용할 때까지 -70˚C에서 보관했습니다. 샘플은 그룹(A/B), 치료 기간(1/2), 사용된 껌(주어진 치료 기간이 끝날 때 수집된 샘플의 경우 X/S) 및 유형(타액 또는 플라크)으로 표시되었습니다. (피)). 그런 다음 샘플(n=232)을 DNA 추출 및 시퀀싱을 위해 드라이아이스에 담아 J. Craig Venter Institute(JCVI) USA, La Jolla 캠퍼스로 배송했습니다.

DNA 추출: 샘플을 4˚C에서 해동하고 비드 비팅 Lysing Matrix B 튜브(MPBio Inc.)를 사용하여 500ul의 타액 또는 플라크 현탁액에서 DNA를 추출하기 전에 철저히 와류 처리한 다음 리소자임 분해, 페놀/클로로포름 이소아밀 알코올 추출 및 에탄올 침전을 수행했습니다. . 침전된 DNA를 1x TE 버퍼에 재현탁했습니다.

라이브러리 준비 및 시퀀싱: Nanodrop 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA)를 사용하여 각 샘플의 DNA를 정량화했습니다. 16S rDNA 유전자(16S)의 V4 영역을 표적으로 하는 어댑터 및 바코드 연결 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머를 사용하여 앰플리콘을 생성하고 제조업체의 지침에 따라 Qiaquick PCR 정제 키트(Qiagen, Inc)를 사용하여 정제했습니다. 정제된 앰플리콘은 SybrGold(Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA)를 사용하여 정량화하고, 각 샘플의 등몰량을 보장하기 위해 정규화하고, Illumina MiSEQ 시퀀싱을 위한 준비로 풀링했습니다. 16S 라이브러리 풀은 제조업체의 사양에 따라 Illumina MiSEQ 이중 인덱스 2x250bp V2 화학 키트를 사용하여 시퀀싱되었습니다.

16S RNA 시퀀스 데이터 처리: 각 샘플의 시퀀스는 해당 이중 인덱스에 따라 비닝되고 개별 .fastq로 내보내졌습니다. CASAVA v1.8.2(Illumina Inc. 라 졸라, 캘리포니아). 디멀티플렉싱 중에 바코드 불일치가 허용되지 않도록 엄격한 설정이 유지되었기 때문에 품질 시퀀스만 유지되도록 시퀀스를 처리했습니다. 추가 품질 관리(QC) 확인을 위해 처리된 시퀀스가 ​​Infernal 파이프라인[35]에 적용되었습니다. 박테리아 서열은 게놈 기반 16S 리보솜 RNA 데이터베이스(GRD; //metasystems.riken.jp/grd/)를 기반으로 분류학적으로 할당되었습니다.

통계 분석. 그룹 A와 B의 피험자에 대한 연령, 성별 및 DMFT 점수별 분포는 각각 독립 샘플 T- 검정, Pearson의 카이 제곱 검정 및 Wilcoxon 순위 합계 검정을 사용하여 비교했으며 컷오프는 p입니다.