Auswirkungen von Xylit und Sorbit auf das orale Mikrobiom

Probanden: Studienprotokolle wurden von den Ethikkommissionen des UWI, St. Augustine, genehmigt. Dreißig gesunde Freiwillige von der University of the West Indies (UWI), St. Augustine, Trinidad, wurden in die Studie aufgenommen. Um teilnahmeberechtigt zu sein, müssen die Probanden mindestens 20 Zähne gehabt haben, eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben haben und bereit gewesen sein, die Studienverfahren einzuhalten. Personen mit systemischen, infektiösen oder entzündlichen Erkrankungen oder Einnahme von Medikamenten, Antibiotika oder Fluorid im letzten Monat, gewohnheitsmäßige Konsumentinnen von xylit-/sorbithaltigen Produkten und Mundspülungen, mit anormalem Speichelfluss (

Kaugummis: Xylitol-Kaugummi (Epic Spearmint; 1,5 g/Pellet) mit der Bezeichnung Gum X enthält 70 % Xylit zusätzlich zu Kaugummibase, natürlichen Aromen, Sojalecithin, Gummi arabicum, Titandioxid, Carnaubawachs. Gum S (Eclipse Spearmint) war ähnlich, außer dass Xylitol durch 63 % Sorbitol und 2 % Maltitol ersetzt wurde und Aspartam enthalten war. Kaugummis wurden in farbcodierte Behälter verpackt. Die Codes wurden von den Teilnehmern und Forschern, die mit ihnen interagierten, bis zum Abschluss der Studie vertraulich behandelt.

Studiendesign: Diese prospektive, doppelblinde, randomisierte Crossover-Studie dauerte 14 Wochen (März bis Juni 2015). Während der gesamten Studie wurden die Probanden angewiesen, keine Mundspülungen oder Xylitprodukte zu verwenden, sich normal zu ernähren, ihr gewohntes Zähneputzen fortzusetzen und die Verwendung von antimikrobiellen Medikamenten anzugeben. Subjekte, die letzteres berichteten, wurden fallen gelassen.

Die Probanden wurden nach dem Zufallsprinzip zwei Gruppen zugeordnet, A und B (siehe Abbildung 1). Beide Gruppen traten in eine 4-wöchige „Auswaschphase“ ein, während der kein Kaugummi gekaut wurde, gefolgt von einer 3-wöchigen Behandlungsphase (Behandlungsphase 1), während der Gruppe A Kaugummi X und Gruppe B Kaugummi S verwendete (2 Kaugummistücke, 3 mal täglich nach den Mahlzeiten für 6 Minuten). Beide Gruppen durchliefen dann eine weitere 4-wöchige Auswaschphase, bevor sie in die Behandlungsperiode 2 eintraten, während der Gruppe A Kaugummi S und Gruppe B Kaugummi X für 3 Wochen verwendete.

Probenentnahme: Speichel und Plaque wurden den Teilnehmern unmittelbar vor und nach jeder Behandlungsperiode entnommen (Abbildung 1). Die Probanden wurden angewiesen, sich mindestens 24 Stunden vor der Probenentnahme nicht die Zähne zu putzen oder andere Mundhygieneverfahren anzuwenden und mindestens 1 Stunde vorher nichts zu essen oder zu trinken. Für die Speichelsammlung kauten die Probanden steriles Paraffinwachs, und der produzierte Gesamtspeichel wurde 5 Minuten lang in sterilen Röhrchen gesammelt. Die Testperson wurde gebeten, in das gekennzeichnete 50-ml-Sammelröhrchen (steriles, konisches Falcon-Röhrchen aus Polypropylen mit flacher Schraubkappe) zu sabbern. Dieser Vorgang wurde mehrfach wiederholt, um größere Speichelmengen (2–5 ml) zu sammeln. Der Speichel wurde über sterile Pipetten in beschriftete sterile Zentrifugenröhrchen überführt, die bis zur Verwendung bei –70 °C gelagert wurden.

Supragingivale Plaque wurde mit einer Kürette von 2 Molaren (Nr. 16 und Nr. 36), 2 Prämolaren (Nr. 24 und Nr. 44) und 2 Schneidezähnen (Nr. 21 und Nr. 41) gesammelt; Die Plaquesammlung umfasste die Verwendung einer Gracey-Kürette, um die gesamte supragingivale Plaque mit so vielen Zügen wie nötig von der bukkalen Oberfläche des ausgewählten Indexzahns zu entfernen. Die Kürettenspitze wurde 4–5 Sekunden lang in den sterilen DNase-freien Tris-EDTA (TE)-Puffer im Zentrifugenröhrchen eingetaucht. Die Oberfläche der Kürette wurde an der Innenkante des Sammelröhrchens abgewischt und dann mit steriler Gaze abgewischt, damit der Puffer an der Spitze nicht in den Mund des Patienten gelangen konnte. Die Stelle wurde dann sofort erneut unter Verwendung des gleichen Verfahrens beprobt. Der Deckel auf dem Röhrchen wurde wieder aufgesetzt und dann das Röhrchen 4–5 Sekunden lang geschüttelt, um zu versuchen, die Dispersion der Probe in der Flüssigkeit zu maximieren. Das Röhrchen wurde sofort in einem Ziploc-Beutel auf Eis gelegt und bis zur Verwendung bei –70 °C gelagert. Die Proben wurden nach Gruppe (A/B), Behandlungszeitraum (1/2), verwendetem Gummi (X/S im Fall von Proben, die am Ende eines gegebenen Behandlungszeitraums gesammelt wurden) und Art (Speichel(n) oder Plaque) gekennzeichnet (p)). Die Proben (n=232) wurden dann zur DNA-Extraktion und -Sequenzierung auf Trockeneis an das J. Craig Venter Institute (JCVI) USA, Campus La Jolla, versandt.

DNA-Extraktion: Die Proben wurden bei 4 °C aufgetaut und vor der DNA-Extraktion aus 500 ul Speichel- oder Plaquesuspension unter Verwendung von Bead-Beating-Lysing-Matrix-B-Röhrchen (MPBio Inc.) gründlich gevortext, dann mit Lysozym verdaut, mit Phenol/Chloroform, Isoamylalkohol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert . Präzipitierte DNA wurde in 1x TE-Puffer resuspendiert.

Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung: DNA aus jeder Probe wurde unter Verwendung eines Nanodrop-Spektrophotometers (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) quantifiziert. Amplikons wurden unter Verwendung von Adapter- und Barcode-ligierten Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Primern erzeugt, die auf die V4-Region des 16S-rDNA-Gens (16S) abzielen, und unter Verwendung von Qiaquick-PCR-Reinigungskits (Qiagen, Inc) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Gereinigte Amplikons wurden mit SybrGold (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) quantifiziert, normalisiert, um äquimolare Mengen jeder Probe sicherzustellen, und zur Vorbereitung der Illumina MiSEQ-Sequenzierung gepoolt. Der 16S-Bibliothekspool wurde unter Verwendung des Illumina MiSEQ Dual Index 2x250bp V2-Chemiekits gemäß den Spezifikationen des Herstellers sequenziert.

16S-RNA-Sequenzdatenverarbeitung: Sequenzen für jede Probe wurden gemäß den entsprechenden dualen Indizes eingeteilt und als einzelne .fastq exportiert Dateien mit CASAVA v1.8.2 (Illumina Inc. La Jolla, Kalifornien). Die Sequenzen wurden verarbeitet, um sicherzustellen, dass nur qualitativ hochwertige Sequenzen beibehalten wurden, da strenge Einstellungen eingehalten wurden, um sicherzustellen, dass beim Demultiplexen keine Barcode-Nichtübereinstimmungen zulässig waren. Verarbeitete Sequenzen wurden für zusätzliche Qualitätskontrollen (QC) auf die Infernal-Pipeline [35] angewendet. Bakteriensequenzen wurden basierend auf der Genomic-based 16S ribosomal RNA Database (GRD; http://metasystems.riken.jp/grd/) taxonomisch zugeordnet.

Statistische Analysen. Die Verteilung nach Alter, Geschlecht und DMFT-Score für die Probanden in den Gruppen A und B wurden unter Verwendung des T-Tests unabhängiger Stichproben, des Pearson-Chi-Quadrat-Tests bzw. des Wilcoxon-Rangsummentests mit einem Cut-Off von p verglichen