イラン人およびカナダ人患者と比較した日本の上部消化管症状

目的 この試験の目的は、カナダにおける上部消化管症状および内視鏡所見を日本およびイランと比較し、これを上部消化管マイクロバイオームと相関させることです。

主な結果は、上部消化管症状がなく、内視鏡検査が正常な対照患者と比較した FD 患者の細菌マイクロバイオームです。 治験責任医師は、募集国、性別および年齢に基づくサブグループ（<または= 50歳対> 50歳）に従って、計画されたサブグループ分析を行います。

副次的な結果は次のとおりです。

1. 食道炎のない患者と比較した食道炎患者のマイクロバイオーム。 びらん性 GERD 患者、非びらん性 GERD 患者の舌の背部にある経口硝酸塩還元細菌を評価し、JUICE 研究に登録された正常対照と比較する。
2. H. pylori 陰性の消化性潰瘍疾患 (PUD) 患者のマイクロバイオームと、H. pylori 陽性の PUD 患者および無症候性の正常な内視鏡検査対照との比較。
3. FD群の不安症患者と不安症のない対照群のマイクロバイオーム。
4. FD群のうつ病患者とうつ病のない対照群のマイクロバイオーム。
5. 上部消化管症状がなく正常な内視鏡検査を受けていない患者における不安のないコントロールと、不安のある患者のマイクロバイオーム。
6. 上部消化管症状がなく、正常な内視鏡検査を受けていない患者のうつ病患者とうつ病のない対照者のマイクロバイオーム
7. 上部消化管の病理学 (炎症、異形成、悪性腫瘍) と、カナダと日本の集団におけるマイクロバイオームの比較。

方法論 研究集団、包含および除外基準 これは、カナダ、日本、およびイランにおける前向き国際コホート研究です。 研究者は、何らかの理由で食道胃十二指腸鏡検査（EGD）を受けており、研究期間中に研究に登録することに同意している成人患者（18歳以上）を募集します。 対照群は、EGDに紹介された上部消化管症状がないか最小限の患者です。 除外基準は、カナダで英語が話せない患者、日本で日本語が話せない患者、イランでペルシア語が話せない患者となります。

方法 書面による同意は、すべての参加者から取得されます。 医療上の理由による臨床医の同意には、ピロリ菌の状態を評価するための標準的な内視鏡検査および胃生検が含まれます。 研究の同意には、「Oracol plus®」と呼ばれる特定のデバイスを使用した唾液の収集と、食道、胃 (体と洞)、および十二指腸遠位部での組織ブラッシングが含まれます。 患者がこの研究に適格である場合、研究者は人口統計 (年齢、性別、教育、人種、過去の病歴、服薬 - 特に PPI と抗生物質)、および内視鏡検査の主な理由を記録します。 患者はアンケートに記入します。 Short Form Leeds Dyspepsia Questionnaire (SFLDQ) によって測定された上部消化管症状、EQ-5D によって測定された生活の質、Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) によって測定された不安とうつ病。 次に、唾液収集装置。 Oracol plus® (Malvern Medical Developments、ウーチェスター、英国) を塗布して唾液を採取します。 このデバイスは、歯ブラシと同じように使用できるように設計されています。 唾液は、スポンジが湿るまで、スポンジ綿棒で歯肉 (存在する場合は歯の付け根) と舌の背部に沿ってしっかりとこすって収集します。これには約 1 分かかります。 唾液が採取されると、容器内に固定され、唾液が提供されたマイクロチューブに直接遠心分離されるように、マイクロチューブがデバイス内に組み込まれます。 これにより、エアロゾル汚染のリスクが軽減されます。 このプロセスは、上部消化管の常在マイクロバイオームを確認するために、口腔内のマイクロバイオームを文書化することを目的としています。

経口硝酸レダクターゼ活性（NRA）測定

びらん性GERDは日本ではめったに発生しないことを考慮して、研究のこの部分は次のようにハミルトンとテヘランで実施されます。

インフォームド コンセントが得られた後、20 人のびらん性 GERD 患者、20 人の非びらん性 GERD 患者がカナダから JUICE に登録され、上部消化管症状のない 20 人の対照が登録されます。 JUICE で説明されている手順に加えて、これらのグループに対して次のことが行われます。

1. 主なプロトコールに記載されているように、Oracol plus® スワブを歯肉と舌背に 60 秒間ブラッシングします。 それは同じ方法で処理され、マイクロバイオームの研究は、適切な JUICE プロトコルについて説明したのと同じ方法で行われます。
2. NRA は、次のように 1 分間隔で 3 分間連続して口腔サンプリングを行うことで測定されます。症例と対照は、一晩絶食し、硝酸塩の多い食品 (レタス、キャベツ、セロリ、カブ、ビーツ、大根、ルバーブを含む) を避けるように求められます。少なくとも8時間。 口の NRA アッセイは午前 7 時 30 分から 10 時の間に行われます。 試験の朝、個人は最初に22mlの脱イオン滅菌水で口をすすぐように求められます。 次に、10 mg の硝酸塩-N/L 溶液 22 ml を 3 分間口に含むように指示されます。 被験者は、最初と 3 分間にわたって 1 分ごとに口の中で溶液を混合するように指示され、口の中でインキュベートされた溶液 1.5 ml が、各混合後 (すなわち、最初と最後に) 滅菌シリンジでサンプリングされます。 1分間隔）。 ソリューションの残りの部分は破棄されます。 各サンプルを、56.25 マイクロリットルの 0.8 M NaOH を含むエッペンドルフ チューブに直ちに移します (ビタミン C を破壊し、さらなる亜硝酸塩の生成を抑えるため)。 次に、18.0 マイクロリットルの 1.4 M ZnSO4 を各チューブに加え、2 秒間振とうし、室温で 30 分間放置します。 次に、サンプルを 25℃、13,000g で 7 分間遠心分離します。 この処理により、亜硝酸測定に使用されるグリース反応を妨害する可能性のあるタンパク質が除去されます。 亜硝酸塩は、250 マイクロリットルのグリース試薬 A [5% (v/v) 濃縮 H3PO4 中の 0.2% (w/v) スルファニルアミド] を 1,000 マイクロリットル キュベット内の遠心分離サンプルの上清 500 マイクロリットルに添加し、吸光度を読み取ることによって測定されます。分光光度計 (WPA BiowaveII、英国) を使用して 540 nm で。 この読み取り値は「A1」と名付けられています。 次いで、２５０マイクロリットルのグリース試薬Ｂ［０．０２％（ｗ／ｖ）Ｎ－（１－ナフチル）－エチレンジアミン－二塩酸塩溶液］をキュベットに添加する。 次に、キュベットを室温で10分間暗所に保ち、吸光度を540 nmで再度読み取り、読み取り値を「A2」と名付けました。 値 (A2-A1) は、NaNO2 の既知の濃度をテストすることによって作成された標準曲線に対して読み取られ、最終的な亜硝酸塩濃度が決定されます。 脱イオン滅菌水の 500 マイクロリットル サンプルは、各インスタンスで唾液サンプルとまったく同じように処理され、品質管理のブランクとして機能します。 0、1、2、および 3 分の亜硝酸塩の値が時間に対してプロットされ、傾向線の傾きが計算されます。 この勾配は、1 人あたり 1 分間に生成される亜硝酸塩を表します。 勾配に 22 (硝酸塩溶液の量) を掛けて「硝酸レダクターゼ活性」を計算し、1 人あたり 1 分あたりに形成される亜硝酸 N のマイクログラムとして報告します。

定義:

実用的な目的のために、GERD は、モントリオール サミットに従って、少なくとも週に 1 回発生する厄介な逆流または胸やけとして臨床的に定義されています。 この定義は、びらん性のない患者を登録するだけでなく、コントロールで GERD を除外するためにも使用されます。 また、びらん性患者を臨床的に評価するためにも使用されます。 コントロールは無症候性（上記の定義による）である必要があるだけでなく、逆流の内視鏡的兆候がないことも必要です。

食道胃十二指腸内視鏡検査とマイクロバイオーム EGD のサンプリングを行い、無菌シース ブラシを使用して腸内微生物叢を収集します。 各患者に対して、最初に 1 つのブラシで中央および下部食道から組織ブラッシングを行い、次に 2 つ目のブラシで胃 (体の大弯および小弯)、3 つ目のブラシで十二指腸キャップおよび遠位十二指腸をブラッシングします。 これは、内視鏡が導入されたときに実施され、いずれの場合も、適切な領域を優しくブラッシングすることによってコレクションが取得されます。 ブラシの表面に収集された材料は、後で滅菌チューブで RNA に再懸濁されます。 サンプルを室温で最大 2 時間インキュベートした後、凍結し、-80 °C で保存しました。 日本の冷凍マイクロバイオームサンプルは、研究者の 1 人によって McMaster Genome Center に発送または持ち込まれます。 イランのサンプルはテヘランで処理され、抽出された DNA サンプルはシーケンスのために McMaster に転送されます。 最後の部分、つまりシーケンスされた DNA サンプルの分析は、テヘランまたはマクマスターで行うことができます。 両方のコホートの標準的なケアとしてピロリ菌の状態を評価するために、前庭部と胃体からそれぞれ2つの生検が得られます。

マイクロバイオーム分析 DNA 抽出と分子プロファイリングは、標準的なプロトコルを使用して実行されます。 16S rRNA遺伝子の細菌群集プロファイリングは、V3領域のペアエンドリードを使用して実行されます。 McMaster Genome Center での 150 または 250 nt のペアエンド イルミナ シーケンス用に、3 回の増幅がプールされます。 このアプローチは、V3 領域のオーバーラップ シーケンス リードを提供します。これは、質の悪いベース コールを修正し、シーケンス精度を向上させるために使用できます。 バーコード付きプライマーを使用して実行を多重化すると、サンプルあたり約 25,000 のシーケンス読み取りが提供されます。 配列データは、cutadap PandaSeq、AbundantOTU+、mothur、および QIIME による品質フィルタリングを組み込んだ社内バイオインフォマティクス パイプラインによって処理されます。 出力には、AbundantOTU+ を使用した運用分類単位 (OTU) のクラスター化されたシーケンスと、Greengenes トレーニング セットを使用した RDP 分類子分類子を使用した分類割り当てが含まれます。 マイクロバイオーム解析には、各サンプルの α 多様性測定基準と β 多様性測定 (加重および非加重 unifrac、Bray-Curtis、非計量多次元スケーリング)、および QIIME25 と PhyloSeq を使用したその他の統計分析が含まれます。 微生物叢の機能的特性は、観察されていない状態の再構築によるコミュニティの系統発生調査（PICRUSt）を使用して推測され、統計を使用してさらに比較されます。

サンプルサイズ 調査員は、カナダ (マクマスター大学) で上部消化管内視鏡検査に紹介された 500 人の新しい患者、日本 (東北大学病院消化器病科) で 500 人、イラン (テヘラン大学) から 500 人の新しい患者を募集する予定です。 これは、食道、胃、および十二指腸のマイクロバイオームの評価を受けた 20 人の患者からの予備データに基づいており、操作上の分類単位のオッズ比は、器質的疾患と健康な対照 (GI 症状のない EGD) の間で 2 倍になると想定しています。たとえば、異常が見つからない貧血の評価など）、少なくとも 50 人の健康なコントロールと 50 人の特定の疾患の患者がいると想定しています。 研究者は胃潰瘍、FD、食道炎を個別に評価し、複数の検査に合わせて調整する必要があるため、500 人の患者が必要になります。

NRA 測定のために、研究者は GERD、NERD、および対照群の 18 人の患者を必要とします。 これは、Z-アルファが 1.96 (両面)、1-ベータ=0.8416、 シグマ 0.99、平均差 0.9310。

統計分析 ベースライン記述データが分析され、連続変数の平均と標準偏差、およびカテゴリ変数のパーセンテージと頻度として報告されます。 二分変数は、カイ二乗 (x2) 検定を使用して分析され、研究者がマンホイットニーの U 検定を使用する場合、グループ内の数が < 50 でない限り、スチューデントの t 検定 (2 つのグループの場合) および ANOVA (3 つ以上のグループの場合) を使用して連続的に分析されます。 2 つのグループと、3 つ以上のグループの場合は Kruskal-Wallis。 Windows システム用の SPSS バージョン 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokyo, Japan) を使用し、一次結果では <0.05 レベル、二次結果では <0.01 レベルで有意と見なされる差異を使用して、複数のテストを調整します。