Symptômes gastro-intestinaux supérieurs japonais comparés aux patients iraniens et canadiens se présentant

Objectif Le but de l'essai est de comparer les symptômes gastro-intestinaux supérieurs et les résultats d'endoscopie au Canada avec le Japon et l'Iran, et de les corréler avec le microbiome gastro-intestinal supérieur.

Les principaux critères de jugement sont le microbiome bactérien chez les patients atteints de FD par rapport aux patients témoins sans symptômes gastro-intestinaux supérieurs et une endoscopie normale. Les enquêteurs effectueront une analyse de sous-groupe planifiée en fonction du pays de recrutement ainsi que des sous-groupes basés sur le sexe et l'âge (<ou = 50 ans contre> 50 ans)

Les résultats secondaires sont

1. Le microbiome chez les patients atteints d'œsophagite par rapport aux patients sans œsophagite. Évaluer les bactéries orales réduisant les nitrates sur le dos de la langue des patients atteints de RGO érosif, des patients atteints de RGO non érosif et les comparer à celles des témoins normaux inscrits à l'étude JUICE.
2. Le microbiome chez les patients atteints d'ulcère gastroduodénal négatif pour H. pylori par rapport aux patients atteints d'ulcère gastro-duodénal positif pour H. pylori et aux contrôles d'endoscopie normaux asymptomatiques.
3. Le microbiome chez les patients anxieux par rapport aux témoins sans anxiété dans le groupe FD.
4. Le microbiome chez les personnes souffrant de dépression par rapport aux témoins sans dépression dans le groupe FD.
5. Le microbiome chez les patients anxieux par rapport aux témoins sans anxiété chez les patients sans symptômes gastro-intestinaux supérieurs et une endoscopie normale.
6. Le microbiome chez les personnes souffrant de dépression versus les témoins sans dépression chez les patients sans symptômes gastro-intestinaux supérieurs et une endoscopie normale
7. Comparaison de la pathologie gastro-intestinale supérieure (inflammation, dysplasie, malignité) et du microbiome dans la population canadienne par rapport à la population japonaise.

Méthodologie Population de l'étude, critères d'inclusion et d'exclusion Il s'agit d'une étude de cohorte internationale prospective au Canada, au Japon et en Iran. Les investigateurs recruteront des patients adultes (≥ 18 ans) qui subissent une duodénoscopie œsophago-gastro (EGD) pour quelque raison que ce soit et qui consentent à être inclus dans l'étude pendant la période d'étude. Le groupe témoin sera composé de patients ne présentant aucun symptôme ou présentant des symptômes gastro-intestinaux minimes et référés pour EGD. Les critères d'exclusion seront les patients qui ne peuvent pas parler l'anglais au Canada, qui ne peuvent pas parler le japonais au Japon et qui ne peuvent pas parler le persan en Iran.

Méthodes Un consentement écrit sera obtenu de tous les participants. Le consentement du clinicien pour des raisons médicales comprend une endoscopie standard et des biopsies gastriques pour évaluer le statut H.pylori. Le consentement de recherche contient la collecte de salive avec un dispositif spécifique appelé "Oracol plus®" et le brossage des tissus au niveau de l'œsophage, de l'estomac (corps et antre) et du duodénum distal. Si le patient est éligible pour cette étude, les enquêteurs enregistreront les données démographiques (âge, sexe, éducation, race, antécédents médicaux, prise de médicaments - en particulier les IPP et les antibiotiques) et la principale raison de l'endoscopie. Les patients rempliront des questionnaires; symptômes gastro-intestinaux supérieurs mesurés par le Short Form Leeds Dyspepsia Questionnaire (SFLDQ), qualité de vie mesurée par EQ-5D, et anxiété et dépression mesurées par The Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Puis dispositif de collecte de salive ; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, Royaume-Uni) sera appliqué pour recueillir la salive. L'appareil est conçu pour être utilisé de la même manière qu'une brosse à dents. La salive est recueillie en frottant fermement l'éponge le long de la gencive (à la base des dents si présente) ainsi que sur le dos de la langue jusqu'à ce que l'éponge soit humide, cela prend environ 1 minute. Une fois la salive prélevée, elle est sécurisée dans le récipient, un microtube est incorporé dans le dispositif afin que la salive soit centrifugée directement dans le microtube fourni. Cela réduit le risque de contamination par les aérosols. Ce processus vise à documenter les microbiomes dans la cavité buccale afin de confirmer les microbiomes résidents dans le tractus gastro-intestinal supérieur.

La mesure orale de l'activité nitrate réductase (ANR)

Considérant que le RGO érosif est plutôt peu fréquent au Japon, cette partie de l'étude sera réalisée à Hamilton et à Téhéran comme suit :

Vingt patients atteints de RGO érosif, vingt patients atteints de RGO non érosif inscrits dans JUICE du Canada et vingt témoins sans symptômes gastro-intestinaux supérieurs sont inscrits après l'obtention du consentement éclairé. Outre les procédures décrites dans JUICE, les opérations suivantes sont effectuées pour ces groupes :

1. Un écouvillon Oracol plus® est brossé sur les gencives et le dos de la langue pendant 60 secondes comme décrit dans le protocole principal. Il est traité de la même manière et l'étude du microbiome est effectuée de la même manière que celle décrite pour le protocole JUICE proprement dit.
2. La NRA est mesurée avec des prélèvements consécutifs dans la cavité buccale à des intervalles d'une minute pendant trois minutes comme suit : les cas et les témoins sont invités à jeûner pendant la nuit et à éviter les aliments riches en nitrates (y compris la laitue, le chou, le céleri, le navet, la betterave, le radis et la rhubarbe) pendant au moins 8h. Le test NRA buccal est effectué entre 7h30 et 10h00. Le matin du test, on demande d'abord à l'individu de se rincer la bouche avec 22 ml d'eau désionisée et stérile. Ensuite, on lui demande de tenir 22 ml d'une solution de nitrate-N/L à 10 mg dans la bouche pendant 3 min. Le sujet est chargé de mélanger la solution dans la bouche au début et toutes les 1 min au cours des 3 min, et 1,5 ml de la solution incubée dans la bouche est prélevé avec une seringue stérile après chaque mélange (c'est-à-dire au début et à intervalles de 1 min). Le reste de la solution est jeté. Chaque échantillon est immédiatement transféré dans un tube Eppendorf contenant 56,25 microlitres de NaOH 0,8 M (pour détruire la vitamine C et augmenter la production de nitrite). Ensuite, 18,0 microlitres de ZnSO4 1,4 M sont ajoutés à chaque tube, agités pendant 2 s et laissés à température ambiante pendant 30 min. Les échantillons sont ensuite centrifugés à 13 000g à 25℃ pendant 7 min. Ce traitement élimine les protéines qui pourraient éventuellement interférer avec la réaction de Griess utilisée pour la mesure des nitrites. Le nitrite est mesuré en ajoutant 250 microlitres de réactif de Griess A [0,2 % (p/v) de sulfanilamide dans 5 % (v/v) de H3PO4 concentré] à 500 microlitres du surnageant de l'échantillon centrifugé dans une cuvette de 1 000 microlitres et en lisant l'absorbance à 540 nm à l'aide d'un spectrophotomètre (WPA BiowaveII, UK). Cette lecture est nommée ''A1.'' Ensuite, 250 microlitres de réactif de Griess B [solution à 0,02 % (p/v) de N-(1-naphtyl)-éthylènediamine-dichlorhydrate] sont ajoutés à la cuvette. La cuvette est ensuite maintenue dans l'obscurité à température ambiante pendant 10 min et l'absorbance a été à nouveau lue à 540 nm et la lecture nommée ''A2.'' La valeur (A2-A1) est lue par rapport à une courbe standard développée en testant des concentrations connues de NaNO2 et la concentration finale en nitrite déterminée. Un échantillon de 500 microlitres d'eau stérile déionisée est traité exactement comme l'échantillon de salive dans chaque cas et sert de blanc pour le contrôle de la qualité. Les valeurs de nitrite à 0, 1, 2 et 3 min sont tracées en fonction du temps et la pente de la ligne de tendance est calculée. Cette pente représente le nitrite formé par personne et par minute. La pente est multipliée par 22 (le volume de la solution de nitrate) pour calculer « l'activité nitrate réductase » et rapportée en microgrammes de nitrite-N formé par personne et par minute.

Définitions :

À des fins pratiques, le RGO est défini cliniquement selon le sommet de Montréal comme une régurgitation gênante ou des brûlures d'estomac survenant au moins une fois par semaine. Cette définition sera utilisée pour inscrire les patients non érosifs ainsi que pour exclure le RGO des témoins. Il sera également utilisé pour évaluer cliniquement les patients érosifs. Les témoins doivent non seulement être asymptomatiques (selon la définition mentionnée ci-dessus), mais aussi ne présenter aucun signe endoscopique macroscopique de reflux.

Une œsophagogastroduodénoscopie et un prélèvement pour le microbiome EGD seront effectués et une brosse gainée stérile sera utilisée pour prélever le microbiote intestinal. Pour chaque patient, le brossage des tissus sera effectué d'abord à partir de l'œsophage moyen et inférieur avec une brosse, puis de l'estomac (grande et petite courbure du corps et de l'antre) avec une deuxième brosse, de la calotte duodénale et du duodénum distal avec une troisième brosse. Celle-ci sera effectuée au fur et à mesure de l'introduction de l'endoscope et dans chaque cas la collecte sera obtenue en brossant délicatement la zone appropriée. Le matériel recueilli sur la surface de la brosse sera remis en suspension dans l'ARN plus tard dans un tube stérile. Les échantillons ont été laissés à incuber à température ambiante jusqu'à 2 heures, puis congelés et stockés à -80 °C. Des échantillons de microbiome congelé japonais seront expédiés ou apportés au McMaster Genome Center par l'un des enquêteurs. Les échantillons iraniens seront traités à Téhéran et les échantillons d'ADN extraits seront transférés à McMaster pour le séquençage. La dernière partie, c'est-à-dire l'analyse des échantillons d'ADN séquencés, peut être effectuée à Téhéran ou à McMaster. Deux biopsies de l'antre et du corps de l'estomac seront obtenues pour évaluer le statut de H. pylori en tant que norme de soins des deux cohortes.

Analyse du microbiome L'extraction d'ADN et le profilage moléculaire seront effectués en utilisant des protocoles standards. Le profilage de la communauté bactérienne du gène de l'ARNr 16S sera effectué à l'aide de lectures appariées de la région V3. Les amplifications en triple seront regroupées pour le séquençage Illumina apparié de 150 ou 250 nt au McMaster Genome Center. Cette approche fournit des lectures de séquences superposées de la région V3, qui peuvent être utilisées pour corriger les appels de base de mauvaise qualité et augmenter la précision du séquençage. Le multiplexage de l'analyse avec des amorces à code-barres fournira environ 25 000 lectures de séquences par échantillon. Les données de séquence seront traitées par un pipeline bioinformatique interne qui intègre un filtrage de qualité avec cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur et QIIME. La sortie comprendra des séquences groupées dans des unités taxonomiques opérationnelles (OTU) à l'aide d'AbundantOTU+ et des affectations taxonomiques à l'aide du classificateur de classificateur RDP à l'aide de l'ensemble de formation Greengenes. L'analyse du microbiome comprendra des mesures de diversité α pour chaque échantillon et des mesures de diversité β (unifrac pondéré et non pondéré, Bray-Curtis, mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique) et d'autres analyses statistiques utilisant QIIME25 et PhyloSeq. Les propriétés fonctionnelles du microbiote seront déduites à l'aide de l'enquête phylogénétique des communautés par reconstruction d'états non observés (PICRUSt) et comparées à l'aide de statistiques

Taille de l'échantillon Les chercheurs prévoient de recruter 500 nouveaux patients référés pour une endoscopie digestive haute au Canada (Université McMaster) et 500 au Japon (Division de gastroentérologie, Hôpital universitaire de Tohoku) et 500 en Iran (Université de Téhéran). Ceci est basé sur les données préliminaires de 20 patients qui ont eu une évaluation du microbiome dans l'œsophage, l'estomac et le duodénum et suppose que le rapport de cotes pour l'unité taxonomique opérationnelle sera de 2 fois entre la maladie organique et le contrôle sain (EGD sans symptômes gastro-intestinaux par exemple pour l'évaluation de l'anémie lorsqu'aucune anomalie n'est trouvée) et suppose qu'il y aura au moins 50 témoins sains et 50 patients atteints d'une maladie donnée. 500 patients seront nécessaires car les chercheurs évalueront séparément l'ulcère gastrique, la DF et l'œsophagite et devront s'adapter à plusieurs tests.

Pour la mesure de la NRA, les investigateurs ont besoin de 18 patients parmi le RGO, le NERD et le bras contrôle. Cela suppose un Z-alpha de 1,96 (recto-verso), 1-beta=0,8416, Sigma de 0,99 et différence moyenne de 0,9310.

Analyse statistique Les données descriptives de base seront analysées et rapportées sous forme de moyennes et d'écarts types pour les variables continues, et de pourcentage et de fréquence pour les variables catégorielles. Les variables dichotomiques seront analysées en utilisant le test Chi carré (x2) et en continu en utilisant le test t de Student (pour deux groupes) et l'ANOVA (pour plus de deux groupes) à moins que les nombres ne soient <50 dans un groupe lorsque les enquêteurs utiliseront le test U de Mann Whitney pour deux groupes et Kruskal-Wallis pour plus de deux groupes. La version 21.0 de SPSS (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokyo, Japon) pour les systèmes Windows sera utilisée avec des différences considérées comme significatives au niveau <0,05 pour les résultats primaires et <0,01 pour le secondaire à ajuster pour les tests multiples.