Japonské symptomy horní části GI ve srovnání s íránskými a kanadskými pacienty prezentujícími

Cíl Účelem studie je porovnat symptomy a endoskopické nálezy v horní části GI v Kanadě s Japonskem a Íránem a korelovat je s mikrobiomem v horní části GI.

Primárním výsledkem je bakteriální mikrobiom u pacientů s FD ve srovnání s kontrolními pacienty bez příznaků horní části GI a normální endoskopie. Vyšetřovatelé provedou plánovanou analýzu podskupin podle země náboru a také podle pohlaví a věku podskupin (<nebo =50 let versus >50 let)

Sekundární výsledky jsou

1. Mikrobiom u pacientů s ezofagitidou ve srovnání s pacienty bez ezofagitidy. Pro posouzení orálních bakterií redukujících dusičnany na hřbetu jazyka pacientů s erozivní GERD, pacientů s neerozivní GERD a jejich porovnání s těmi u normálních kontrol zařazených do studie JUICE.
2. Mikrobiom u pacientů s H. pylori negativním peptickým vředovým onemocněním (PUD) ve srovnání s H. pylori pozitivními pacienty s PUD a asymptomatickými normálními endoskopickými kontrolami.
3. Mikrobiom u pacientů s úzkostí versus kontroly bez úzkosti ve skupině FD.
4. Mikrobiom u pacientů s depresí versus kontroly bez deprese ve skupině FD.
5. Mikrobiom u pacientů s úzkostí versus kontroly bez úzkosti u pacientů bez příznaků horní části GI a normální endoskopie.
6. Mikrobiom u pacientů s depresí versus kontroly bez deprese u pacientů bez symptomů horní části GI a normální endoskopie
7. Srovnání patologie horního GI traktu (zánět, dysplazie, malignita) a mikrobiomu v kanadské versus japonské populaci.

Metodologie Populační studie, kritéria pro zařazení a vyloučení Toto je prospektivní mezinárodní kohortová studie v Kanadě, Japonsku a Íránu. Zkoušející přijmou dospělé pacienty (ve věku ≥ 18 let), kteří z jakéhokoli důvodu podstupují esophago-gastro duodenoskopii (EGD) a souhlasí se zařazením do studie během období studie. Kontrolní skupinou budou pacienti s žádnými nebo minimálními symptomy horního GI traktu, kteří jsou odesláni na EGD. Kritériem vyloučení budou pacienti, kteří nemluví anglicky v Kanadě, kteří nemluví japonsky v Japonsku a neumí persky v Íránu.

Metody Písemný souhlas bude získán od všech účastníků. Souhlas lékaře ze zdravotních důvodů zahrnuje standardní endoskopii a biopsie žaludku pro posouzení stavu H. pylori. Souhlas s výzkumem obsahuje odběr slin specifickým zařízením nazvaným „Oracol plus®“ a čištění tkání jícnu, žaludku (tělo a antra) a distálního dvanáctníku. Pokud je pacient způsobilý pro tuto studii, vyšetřovatelé zaznamenají demografické údaje (věk, pohlaví, vzdělání, rasu, anamnézu, užívání léků – zejména PPI a antibiotika) a hlavní důvod endoskopie. Pacienti vyplní dotazníky; symptomy horní části GI měřené pomocí Short Form Leeds Dyspepsia Questionnaire (SFLDQ), kvalita života měřená pomocí EQ-5D a úzkost a deprese měřená pomocí The Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Poté zařízení na sběr slin; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, UK) bude aplikován na odběr slin. Zařízení je navrženo pro použití podobným způsobem jako zubní kartáček. Sliny se odebírají třením tamponu houby pevně podél dásně (na kořeni zubů, pokud je přítomen) a také na hřbetu jazyka, dokud houba není mokrá, to trvá asi 1 minutu. Jakmile jsou sliny odebrány, jsou bezpečně v nádobce, do zařízení je začleněna mikrozkumavka, takže sliny jsou odstředěny přímo do dodávané mikrozkumavky. Tím se snižuje riziko kontaminace aerosolem. Tento proces je zaměřen na dokumentaci mikrobiomů v ústní dutině za účelem potvrzení rezidentních mikrobiomů v horní části GI traktu.

Měření aktivity orální nitrát reduktázy (NRA).

Vzhledem k tomu, že erozivní GERD je v Japonsku spíše vzácná, bude tato část studie provedena v Hamiltonu a Teheránu následovně:

Dvacet pacientů s erozivní GERD, dvacet pacientů s neerozivní GERD zařazených do JUICE z Kanady a dvacet kontrol bez příznaků v horní části GI je zahrnuto po získání informovaného souhlasu. Kromě postupů popsaných v JUICE se pro tyto skupiny provádí následující:

1. Tampón Oracol plus® se přetírá přes dásně a hřbet jazyka po dobu 60 sekund, jak je popsáno v hlavním protokolu. Zpracovává se stejným způsobem a studie mikrobiomu se provádí stejným způsobem, jaký je popsán pro samotný protokol JUICE.
2. NRA se měří po sobě jdoucími odběry vzorků z ústní dutiny v jednominutových intervalech po dobu tří minut následovně: případy a kontroly jsou požádány, aby se přes noc postily a vyhýbaly se potravinám s vysokým obsahem dusičnanů (včetně hlávkového salátu, zelí, celeru, tuřínu, červené řepy, ředkvičky a rebarbory). minimálně 8h. Test NRA v ústech se provádí mezi 7:30 a 10:00. Ráno v den testu je jedinec nejprve požádán, aby si vypláchl ústa 22 ml deionizované sterilní vody. Poté je požádán, aby podržel 22 ml 10 mg roztoku dusičnanu-N/L v ústech po dobu 3 minut. Subjekt je instruován, aby promíchal roztok v ústech na začátku a každou 1 minutu po dobu 3 minut, a po každém promíchání (tj. na začátku a na konci) se odebere 1,5 ml roztoku inkubovaného v ústech 1minutové intervaly). Zbytek roztoku se vyhodí. Každý vzorek se okamžitě přenese do zkumavky Eppendorf obsahující 56,25 mikrolitrů 0,8 M NaOH (pro zničení vitaminu C a zvýšení další produkce dusitanů). Poté se do každé zkumavky přidá 18,0 mikrolitrů 1,4 M ZnSO4, protřepává se po dobu 2 s a ponechá se při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Vzorky se poté odstřeďují při 13 000 g při 25 °C po dobu 7 minut. Toto ošetření odstraňuje proteiny, které by mohly interferovat s Griessovou reakcí použitou pro měření dusitanů. Dusitany se měří přidáním 250 mikrolitrů Griessova činidla A [0,2 % (w/v) sulfanilamidu v 5 % (v/v) koncentrované H3PO4] do 500 mikrolitrů supernatantu centrifugovaného vzorku v 1000-mikrolitrové kyvetě a odečtením absorbance při 540 nm za použití spektrofotometru (WPA BiowaveII, UK). Toto čtení se jmenuje ''A1.'' Potom se do kyvety přidá 250 mikrolitrů Griessova činidla B [0,02% (w/v) N-(1-naftyl)-ethylendiamin-dihydrochloridu]. Kyveta se poté ponechá ve tmě při pokojové teplotě po dobu 10 minut a absorbance se znovu odečte při 540 nm a odečet se pojmenuje ''A2''. Hodnota (A2-A1) se odečte proti standardní křivce vytvořené testováním známých koncentrací NaNO2 a určí se konečná koncentrace dusitanů. Vzorek 500 mikrolitrů deionizované sterilní vody je v každém případě zpracován přesně jako vzorek slin a slouží jako slepý vzorek pro kontrolu kvality. Hodnoty dusitanů v čase 0, 1, 2 a 3 min se vynesou do grafu proti času a vypočítá se sklon trendové čáry. Tento sklon představuje dusitan vytvořený na osobu za minutu. Sklon se vynásobí 22 (objem roztoku dusičnanu), aby se vypočítala „aktivita dusičnanové reduktázy“ a vykázala se jako mikrogram dusitanu-N vytvořeného na osobu za minutu.

Definice:

Pro praktické účely je GERD klinicky definována podle Montrealského summitu jako obtížná regurgitace nebo pálení žáhy vyskytující se alespoň jednou týdně. Tato definice bude použita k zařazení neerozivních pacientů a také k vyloučení GERD do kontrol. Bude také použit ke klinickému hodnocení erozivních pacientů. Kontroly musí být nejen asymptomatické (podle výše uvedené definice), ale také bez velkých endoskopických známek refluxu.

Bude provedena esofagogastroduodenoskopie a odběr vzorků pro mikrobiom EGD a k odběru střevní mikroflóry bude použit sterilní kartáček s pouzdrem. U každého pacienta se provede tkáňový kartáček nejprve ze středního a dolního jícnu jedním kartáčkem, poté žaludku (větší a menší zakřivení těla a antra) druhým kartáčkem, uzávěr duodena a distuální duodenum třetím kartáčkem. To bude provedeno při zavádění endoskopu a v každém případě bude odběr získán jemným kartáčováním příslušné oblasti. Materiál shromážděný na povrchu kartáčku bude později resuspendován do RNA ve sterilní zkumavce. Vzorky se nechaly inkubovat při teplotě místnosti po dobu až 2 hodin, poté se zmrazily a skladovaly při -80 °C. Japonské zmrazené vzorky mikrobiomu odešle nebo přiveze do McMaster Genome Center jeden z vyšetřovatelů. Íránské vzorky budou zpracovány v Teheránu a extrahované vzorky DNA budou přeneseny do McMaster pro sekvenování. Poslední část, tj. analýzu sekvenovaných vzorků DNA, lze provést buď v Teheránu, nebo v McMaster. K posouzení stavu H. pylori budou získány dvě biopsie, každá z antra a těla žaludku, jako standardní péče obou kohort.

Analýza mikrobiomu Extrakce DNA a molekulární profilování bude prováděno pomocí standardních protokolů. Profilování bakteriální komunity genu 16S rRNA bude prováděno pomocí párových čtení konce oblasti V3. Triplikované amplifikace budou sloučeny pro sekvenování 150 nebo 250 nt párového konce Illumina v McMaster Genome Center. Tento přístup poskytuje překrývající se čtení sekvencí oblasti V3, které lze použít pro korekci nízké kvality základních volání a zvýšení přesnosti sekvenování. Multiplexování běhu s primery s čárovým kódem poskytne přibližně 25 000 čtení sekvence na vzorek. Sekvenční data budou zpracována interním bioinformatickým potrubím, které zahrnuje kvalitní filtrování s cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur a QIIME. Výstup bude zahrnovat seskupené sekvence v operačních taxonomických jednotkách (OTU) pomocí AbundantOTU+ a taxonomické přiřazení pomocí klasifikátoru RDP pomocí trénovací sady Greengenes. Analýza mikrobiomu bude zahrnovat metriky α-diverzity pro každý vzorek a měření β-diverzity (vážené a nevážené unifrac, Bray-Curtis, nemetrické vícerozměrné škálování) a další statistické analýzy pomocí QIIME25 a PhyloSeq. Funkční vlastnosti mikrobioty budou odvozeny pomocí Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) a dále porovnány pomocí Statistical

Velikost vzorku Výzkumníci plánují získat 500 nových pacientů doporučených na endoskopii horního GI v Kanadě (McMaster University) a 500 v Japonsku (Division of Gastroenterology, Tohoku University Hospital) a 500 z Íránu (Teheránská univerzita). To je založeno na předběžných údajích od 20 pacientů, kteří podstoupili hodnocení mikrobiomu v jícnu, žaludku a dvanáctníku, a předpokládá, že poměr šancí pro operační taxonomickou jednotku bude 2násobný mezi organickým onemocněním a zdravou kontrolou (EGD bez příznaků GI např. pro hodnocení anémie, kde není nalezena žádná abnormalita) a předpokládá, že bude alespoň 50 zdravých kontrol a 50 pacientů s daným onemocněním. Bude potřeba 500 pacientů, protože vyšetřovatelé budou samostatně hodnotit žaludeční vřed, FD, ezofagitidu a budou se muset přizpůsobit pro vícenásobné testování.

Pro měření NRA potřebují vyšetřovatelé 18 pacientů z GERD, NERD a kontrolní větve. To předpokládá Z-alfa 1,96 (oboustranný), 1-beta=0,8416, Sigma 0,99 a průměrný rozdíl 0,9310.

Statistická analýza Základní popisná data budou analyzována a vykázána jako průměry a standardní odchylky pro spojité proměnné a procento a frekvence pro kategorické proměnné. Dichotomické proměnné budou analyzovány pomocí Chi kvadrát (x2) testu a kontinuálně pomocí Studentova t testu (pro dvě skupiny) a ANOVA (pro více než dvě skupiny), pokud čísla ve skupině nebudou < 50, když vyšetřovatelé použijí Mann Whitney U test pro dvě skupiny a Kruskal-Wallis pro více než dvě skupiny. SPSS verze 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokio, Japonsko) pro systémy Windows bude používán s rozdíly považovanými za významné na úrovni <0,05 pro primární výsledky a <0,01 pro sekundární, aby bylo možné upravit pro vícenásobné testování.