Sintomas gastrointestinais superiores japoneses em comparação com pacientes iranianos e canadenses apresentando

Objetivo O objetivo do estudo é comparar os sintomas do trato gastrointestinal superior e os achados da endoscopia no Canadá com o Japão e o Irã, e correlacionar isso com o microbioma do trato gastrointestinal superior.

Os resultados primários são o microbioma bacteriano em pacientes com DF em comparação com pacientes de controle sem sintomas gastrointestinais superiores e uma endoscopia normal. Os investigadores farão uma análise de subgrupo planejada de acordo com o país de recrutamento, bem como subgrupos baseados em sexo e idade (<ou = 50 anos versus> 50 anos)

Os resultados secundários são

1. O microbioma em pacientes com esofagite em comparação com pacientes sem esofagite. Avaliar as bactérias redutoras de nitrato oral no dorso da língua de pacientes com DRGE erosiva, pacientes com DRGE não erosiva e compará-los com os dos controles normais incluídos no estudo JUICE.
2. O microbioma em pacientes com úlcera péptica (DUP) negativos para H. pylori em comparação com pacientes com DUP positivos para H. pylori e controles de endoscopia normais assintomáticos.
3. O microbioma naqueles com pacientes ansiosos versus controles sem ansiedade no grupo DF.
4. O microbioma naqueles com depressão versus controles sem depressão no grupo FD.
5. O microbioma em pacientes com ansiedade versus controles sem ansiedade em pacientes sem sintomas gastrointestinais superiores e endoscopia normal.
6. O microbioma naqueles com depressão versus controles sem depressão nos pacientes sem sintomas do trato gastrointestinal superior e endoscopia normal
7. Comparação da patologia gastrointestinal superior (inflamação, displasia, malignidade) e o microbioma nas populações canadense versus japonesa.

Metodologia População do estudo, critérios de inclusão e exclusão Este é um estudo de coorte internacional prospectivo no Canadá, Japão e Irã. Os investigadores irão recrutar pacientes adultos (≥18 anos de idade) que estão passando por duodenoscopia esofagogastro-gastro (EGD) por qualquer motivo e estão consentindo em serem incluídos no estudo durante o período do estudo. O grupo de controle será composto por pacientes com nenhum ou mínimos sintomas gastrointestinais encaminhados para EGD. Os critérios de exclusão serão os pacientes que não falam inglês no Canadá, que não falam japonês no Japão e não falam persa no Irã.

Métodos O consentimento por escrito será obtido de todos os participantes. O consentimento do médico por razões médicas inclui endoscopia padrão e biópsias gástricas para avaliar o estado de H.pylori. O consentimento da pesquisa contém coleta de saliva com aparelho específico denominado "Oracol plus®" e escovação de tecidos no esôfago, estômago (corpo e antro) e duodeno distal. Se o paciente for elegível para este estudo, os investigadores registrarão dados demográficos (idade, sexo, escolaridade, raça, histórico médico anterior, uso de medicamentos - especialmente IBPs e antibióticos) e o principal motivo da endoscopia. Os pacientes irão preencher questionários; sintomas gastrointestinais superiores medidos pelo Short Form Leeds Dypepsia Questionnaire (SFLDQ), qualidade de vida medida pelo EQ-5D e ansiedade e depressão medidas pela Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão (HADS). Em seguida, dispositivo de coleta de saliva; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, Reino Unido) será aplicado para coletar saliva. O dispositivo foi concebido para ser utilizado de forma semelhante a uma escova de dentes. A saliva é coletada esfregando o swab de esponja firmemente ao longo da gengiva (na base dos dentes, se presente), bem como no dorso da língua até que a esponja esteja molhada, o que leva cerca de 1 minuto. Uma vez que a saliva é coletada e segura dentro do recipiente, um microtubo é incorporado ao dispositivo para que a saliva seja centrifugada diretamente no microtubo fornecido. Isso reduz o risco de contaminação por aerossol. Este processo visa documentar os microbiomas na cavidade oral, a fim de confirmar os microbiomas residentes no trato gastrointestinal superior.

A medição oral da atividade da redutase do nitrato (NRA)

Considerando que a DRGE erosiva é pouco frequente no Japão, esta parte do estudo será realizada em Hamilton e Teerã da seguinte forma:

Vinte pacientes com DRGE erosiva, vinte pacientes com DRGE não erosiva inscritos no JUICE do Canadá e vinte controles sem sintomas gastrointestinais superiores são inscritos após a obtenção do consentimento informado. Além dos procedimentos descritos no JUICE, o seguinte é feito para esses grupos:

1. Um swab Oracol plus® é aplicado nas gengivas e no dorso da língua por 60 segundos, conforme descrito no protocolo principal. É processado da mesma forma e o estudo do microbioma é feito da mesma forma descrita para o protocolo JUICE propriamente dito.
2. O NRA é medido com amostragens consecutivas da cavidade oral em intervalos de um minuto por três minutos, como segue: casos e controles são solicitados a jejuar durante a noite e evitar alimentos com alto teor de nitrato (incluindo alface, repolho, aipo, nabo, beterraba, rabanete e ruibarbo) para pelo menos 8h. O ensaio de NRA na boca é feito entre 7h30 e 10h00. Na manhã do exame, inicialmente, o indivíduo é solicitado a enxaguar a boca com 22 ml de água deionizada estéril. Em seguida, ele/ela é solicitado a manter 22 ml de uma solução de 10 mg de nitrato N/L na boca por 3 minutos. O sujeito é instruído a misturar a solução na boca no início e a cada 1 min durante os 3 min, e 1,5 ml da solução incubada na boca é amostrado com uma seringa estéril após cada mistura (ou seja, no início e no intervalos de 1 minuto). O restante da solução é descartado. Cada amostra é imediatamente transferida para um tubo Eppendorf contendo 56,25 microlitros de NaOH 0,8 M (para destruir a vitamina C e aumentar a produção de nitrito). Em seguida, 18,0 microlitros 1,4 M ZnSO4 são adicionados a cada tubo, agitados por 2 s e deixados em temperatura ambiente por 30 min. As amostras são então centrifugadas a 13.000 g a 25 ℃ por 7 min. Este tratamento remove as proteínas que poderiam interferir na reação de Griess usada para medição de nitrito. O nitrito é medido adicionando 250 microlitros de reagente de Griess A [0,2% (p/v) sulfanilamida em 5% (v/v) H3PO4 concentrado] a 500 microlitros do sobrenadante da amostra centrifugada em uma cubeta de 1.000 microlitros e lendo a absorbância a 540 nm usando um espectrofotômetro (WPA BiowaveII, Reino Unido). Esta leitura é denominada ''A1.'' Em seguida, 250 microlitros de reagente de Griess B [solução de N-(1-naftil)-etilenodiamina-dicloridrato a 0,02% (p/v)] são adicionados à cubeta. A cubeta é então mantida no escuro em temperatura ambiente por 10 min e a absorbância é novamente lida a 540 nm e a leitura denominada ''A2.'' O valor (A2-A1) é lido contra uma curva padrão desenvolvida testando concentrações conhecidas de NaNO2 e a concentração final de nitrito determinada. Uma amostra de 500 microlitros de água estéril deionizada é tratada exatamente como a amostra de saliva em cada instância e serve como branco para controle de qualidade. Os valores de nitrito em 0, 1, 2 e 3 min são plotados contra o tempo e a inclinação da linha de tendência calculada. Esta inclinação representa o nitrito formado por pessoa por minuto. A inclinação é multiplicada por 22 (o volume da solução de nitrato) para calcular a ''atividade da redutase do nitrato'' e relatada como micrograma de nitrito-N formado por pessoa por minuto.

Definições:

Para fins práticos, a DRGE é definida clinicamente de acordo com a cúpula de Montreal como regurgitação ou azia incômoda ocorrendo pelo menos uma vez por semana. Essa definição será usada para inscrever os pacientes não erosivos, bem como excluir a DRGE nos controles. Também será usado para avaliar clinicamente os pacientes erosivos. Os controles precisam não apenas ser assintomáticos (de acordo com a definição acima mencionada), mas também não ter nenhum sinal endoscópico macroscópico de refluxo.

Esofagogastroduodenoscopia e amostragem para o microbioma EGD serão realizadas e uma escova com bainha estéril será usada para coletar a microbiota intestinal. Para cada paciente, a escovação dos tecidos será realizada primeiro do esôfago médio e inferior com uma escova, depois do estômago (curvatura maior e menor do corpo e antro) com uma segunda escova, da tampa duodenal e do duodeno distual com uma terceira escova. Isso será realizado à medida que o endoscópio for introduzido e, em cada caso, a coleta será obtida escovando suavemente a área apropriada. O material coletado na superfície do pincel será ressuspenso em RNA posteriormente em um tubo estéril. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente por até 2 horas, depois congeladas e armazenadas a -80 °C. Amostras de microbioma congeladas japonesas serão enviadas ou trazidas ao McMaster Genome Center por um dos investigadores. As amostras iranianas serão processadas em Teerã e as amostras de DNA extraídas serão transferidas para McMaster para sequenciamento. A última parte, ou seja, a análise das amostras de DNA sequenciadas pode ser feita em Teerã ou em McMaster. Duas biópsias do antro e do corpo do estômago serão obtidas para avaliar o status de H. pylori como padrão de tratamento de ambas as coortes.

A extração de DNA de análise de microbioma e o perfil molecular serão realizados usando protocolos padrão. O perfil da comunidade bacteriana do gene 16S rRNA será realizado usando leituras pareadas da região V3. Amplificações em triplicado serão agrupadas para sequenciamento Illumina de 150 ou 250 nt no McMaster Genome Center. Essa abordagem fornece leituras de sequência sobrepostas da região V3, que podem ser usadas para corrigir chamadas de base de baixa qualidade e aumentar a precisão do sequenciamento. A multiplexação da execução com iniciadores com código de barras fornecerá aproximadamente 25.000 leituras de sequência por amostra. Os dados da sequência serão processados ​​por um pipeline interno de bioinformática que incorpora filtragem de qualidade com cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur e QIIME. A saída incluirá sequências agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) usando AbundantOTU+ e atribuições taxonômicas usando o classificador classificador RDP usando o conjunto de treinamento Greengenes. A análise do microbioma incluirá métricas de α-diversidade para cada amostra e medidas de β-diversidade (unifrac ponderada e não ponderada, Bray-Curtis, escalonamento multidimensional não métrico) e outras análises estatísticas usando QIIME25 e PhyloSeq. As propriedades funcionais da microbiota serão inferidas usando a Investigação Filogenética de Comunidades por Reconstrução de Estados Não Observados (PICRUSt) e posteriormente comparadas usando Estatística

Tamanho da amostra Os investigadores planejam recrutar 500 novos pacientes encaminhados para endoscopia digestiva alta no Canadá (McMaster University), 500 no Japão (Divisão de Gastroenterologia, Tohoku University Hospital) e 500 no Irã (Tehran University). Isso se baseia em dados preliminares de 20 pacientes que tiveram avaliação do microbioma no esôfago, estômago e duodeno e assume que a razão de chances para a unidade taxonômica operacional será 2 vezes maior entre doença orgânica e controle saudável (EGD sem sintomas gastrointestinais por exemplo, para avaliação de anemia onde nenhuma anormalidade é encontrada) e assume que haverá pelo menos 50 controles saudáveis ​​e 50 pacientes com uma determinada doença. Serão necessários 500 pacientes, pois os investigadores avaliarão úlcera gástrica, DF e esofagite separadamente e precisarão fazer ajustes para testes múltiplos.

Para medição de NRA, os investigadores precisam de 18 pacientes entre GERD, NERD e braço de controle. Isso pressupõe um Z-alfa de 1,96 (dois lados), 1-beta = 0,8416, Sigma de 0,99 e diferença média de 0,9310.

Análise estatística Os dados descritivos da linha de base serão analisados ​​e relatados como médias e desvios padrão para variáveis ​​contínuas, e porcentagem e frequência para variáveis ​​categóricas. As variáveis ​​dicotômicas serão analisadas usando o teste Qui quadrado (x2) e contínua usando o teste t de Student (para dois grupos) e ANOVA (para mais de dois grupos), a menos que os números sejam < 50 em um grupo quando os investigadores usarão o teste U de Mann Whitney para dois grupos e Kruskal-Wallis para mais de dois grupos. SPSS versão 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tóquio, Japão) para sistemas Windows será usado com diferenças consideradas significativas no nível <0,05 para os resultados primários e <0,01 para o secundário para ajustar para testes múltiplos.