Obere GI-Symptome in Japan im Vergleich zu iranischen und kanadischen Patienten

Ziel Ziel der Studie ist es, die Symptome des oberen Gastrointestinaltrakts und Endoskopiebefunde in Kanada mit Japan und dem Iran zu vergleichen und diese mit dem Mikrobiom des oberen Gastrointestinaltrakts zu korrelieren.

Das primäre Ergebnis ist das bakterielle Mikrobiom bei Patienten mit FD im Vergleich zu Kontrollpatienten ohne Symptome im oberen Gastrointestinaltrakt und einer normalen Endoskopie. Die Ermittler führen eine geplante Untergruppenanalyse nach dem Land der Rekrutierung sowie nach Geschlecht und Alter durch (<oder =50 Jahre gegenüber >50 Jahren).

Sekundäre Ergebnisse sind

1. Das Mikrobiom bei Ösophagitis-Patienten im Vergleich zu Patienten ohne Ösophagitis. Bewertung der oralen nitratreduzierenden Bakterien auf dem Zungenrücken von erosiven GERD-Patienten, Patienten mit nicht-erosiver GERD und Vergleich mit denen der normalen Kontrollen, die in die JUICE-Studie aufgenommen wurden.
2. Das Mikrobiom bei H. pylori-negativen Patienten mit peptischer Ulkuskrankheit (PUD) im Vergleich zu H. pylori-positiven PUD-Patienten und asymptomatischen normalen Endoskopiekontrollen.
3. Das Mikrobiom bei Angstpatienten im Vergleich zu Kontrollen ohne Angst in der FD-Gruppe.
4. Das Mikrobiom bei Menschen mit Depression im Vergleich zu Kontrollen ohne Depression in der FD-Gruppe.
5. Das Mikrobiom bei Patienten mit Angstzuständen im Vergleich zu Kontrollen ohne Angstzustände bei Patienten ohne obere GI-Symptome und einer normalen Endoskopie.
6. Das Mikrobiom bei Patienten mit Depression im Vergleich zu Kontrollen ohne Depression bei Patienten ohne obere GI-Symptome und einer normalen Endoskopie
7. Vergleich der Pathologie des oberen Gastrointestinaltrakts (Entzündung, Dysplasie, Malignität) und des Mikrobioms in der kanadischen mit der japanischen Bevölkerung.

Methodik Studienpopulation, Einschluss- und Ausschlusskriterien Dies ist eine prospektive internationale Kohortenstudie in Kanada, Japan und Iran. Die Prüfärzte werden erwachsene Patienten (≥ 18 Jahre) rekrutieren, die sich aus irgendeinem Grund einer Ösophago-Gastro-Duodenoskopie (EGD) unterziehen und während des Studienzeitraums in die Studie aufgenommen werden. Die Kontrollgruppe besteht aus Patienten ohne oder mit minimalen Symptomen im oberen Gastrointestinaltrakt, die zur EGD überwiesen werden. Ausschlusskriterien sind Patienten, die in Kanada kein Englisch, in Japan kein Japanisch und im Iran kein Persisch sprechen können.

Methoden Von allen Teilnehmern wird eine schriftliche Zustimmung eingeholt. Die Zustimmung des Arztes aus medizinischen Gründen umfasst standardmäßige Endoskopie und Magenbiopsien zur Beurteilung des H. pylori-Status. Die Forschungseinwilligung umfasst die Speichelsammlung mit einem speziellen Gerät namens „Oracol plus®“ und Gewebebürsten an Speiseröhre, Magen (Körper und Antrum) und distalem Zwölffingerdarm. Wenn der Patient für diese Studie geeignet ist, werden die Ermittler demografische Daten (Alter, Geschlecht, Bildung, Rasse, Vorgeschichte, Medikamenteneinnahme - insbesondere PPI und Antibiotika) und den Hauptgrund für die Endoskopie aufzeichnen. Die Patienten füllen Fragebögen aus; obere GI-Symptome gemessen mit Short Form Leeds Dyspepsia Questionnaire (SFLDQ), Lebensqualität gemessen mit EQ-5D und Angst und Depression gemessen mit The Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Dann Speichelsammelgerät; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, UK) wird zum Sammeln von Speichel verwendet. Das Gerät ist so konzipiert, dass es ähnlich wie eine Zahnbürste verwendet werden kann. Speichel wird gesammelt, indem der Schwammtupfer fest über das Zahnfleisch (an der Basis der Zähne, falls vorhanden) sowie den Zungenrücken gerieben wird, bis der Schwamm feucht ist, dies dauert etwa 1 Minute. Sobald der Speichel entnommen wurde, ist er sicher im Behälter, ein Mikroröhrchen ist in das Gerät integriert, so dass der Speichel direkt in das bereitgestellte Mikroröhrchen zentrifugiert wird. Dies verringert das Risiko einer Aerosolkontamination. Dieser Prozess zielt darauf ab, die Mikrobiome in der Mundhöhle zu dokumentieren, um die ansässigen Mikrobiome im oberen Gastrointestinaltrakt zu bestätigen.

Messung der oralen Nitrat-Reduktase-Aktivität (NRA).

In Anbetracht der Tatsache, dass erosive GERD in Japan eher selten vorkommt, wird dieser Teil der Studie in Hamilton und Teheran wie folgt durchgeführt:

Zwanzig erosive GERD-Patienten, zwanzig nicht-erosive GERD-Patienten, die in JUICE aus Kanada aufgenommen wurden, und zwanzig Kontrollpersonen ohne obere GI-Symptome werden aufgenommen, nachdem eine Einverständniserklärung eingeholt wurde. Zusätzlich zu den in JUICE beschriebenen Verfahren wird für diese Gruppen Folgendes durchgeführt:

1. Ein Oracol plus®-Tupfer wird 60 Sekunden lang über das Zahnfleisch und den Zungenrücken gestrichen, wie im Hauptprotokoll beschrieben. Es wird auf die gleiche Weise verarbeitet und die Mikrobiomstudie wird auf die gleiche Weise durchgeführt, wie für das eigentliche JUICE-Protokoll beschrieben.
2. Die NRA wird mit aufeinanderfolgenden Proben aus der Mundhöhle in Intervallen von einer Minute für drei Minuten wie folgt gemessen: Fälle und Kontrollen werden gebeten, über Nacht zu fasten und Nahrungsmittel mit hohem Nitratgehalt (einschließlich Salat, Kohl, Sellerie, Rüben, Rote Bete, Rettich und Rhabarber) zu vermeiden mindestens 8 Std. Der Mund-NRA-Assay wird zwischen 7:30 und 10:00 Uhr durchgeführt. Am Morgen des Tests wird die Person zunächst gebeten, ihren Mund mit 22 ml deionisiertem, sterilem Wasser zu spülen. Dann wird er/sie gebeten, 22 ml einer 10 mg Nitrat-N/L-Lösung für 3 min im Mund zu behalten. Der Proband wird angewiesen, die Lösung zu Beginn und alle 1 Minute über die 3 Minuten hinweg im Mund zu mischen, und 1,5 ml der im Mund inkubierten Lösung werden nach jedem Mischen (d 1-Minuten-Intervalle). Der Rest der Lösung wird verworfen. Jede Probe wird sofort in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, das 56,25 Mikroliter 0,8 M NaOH enthält (um Vitamin C zu zerstören und die weitere Nitritproduktion zu stoppen). Dann werden 18,0 Mikroliter 1,4 M ZnSO 4 in jedes Röhrchen gegeben, 2 s geschüttelt und 30 min bei Raumtemperatur belassen. Die Proben werden dann bei 13.000 g bei 25 °C für 7 min zentrifugiert. Diese Behandlung entfernt die Proteine, die möglicherweise die zur Nitritmessung verwendete Griess-Reaktion stören könnten. Nitrit wird gemessen, indem 250 Mikroliter Griess-Reagenz A [0,2 % (w/v) Sulfanilamid in 5 % (v/v) konzentrierter H3PO4] zu 500 Mikroliter des Überstands der zentrifugierten Probe in einer 1.000-Mikroliter-Küvette gegeben und die Absorption gemessen wird bei 540 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (WPA BiowaveII, UK). Dieser Messwert wird „A1“ genannt. Dann werden 250 Mikroliter Griess-Reagenz B [0,02% (w/v) N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin-dihydrochlorid-Lösung] zu der Küvette gegeben. Die Küvette wird dann 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln gehalten und die Extinktion wurde erneut bei 540 nm abgelesen und der Messwert mit „A2“ bezeichnet. Der Wert (A2-A1) wird gegen eine Standardkurve abgelesen, die durch Testen bekannter Konzentrationen von NaNO2 entwickelt wurde, und die endgültige Nitritkonzentration wird bestimmt. Eine 500-Mikroliter-Probe des deionisierten sterilen Wassers wird jeweils genau wie die Speichelprobe behandelt und dient als Blindwert für die Qualitätskontrolle. Nitritwerte bei 0, 1, 2 und 3 min werden gegen die Zeit aufgetragen und die Steigung der Trendlinie berechnet. Diese Steigung stellt das pro Person und Minute gebildete Nitrit dar. Die Steigung wird mit 22 (dem Volumen der Nitratlösung) multipliziert, um die „Nitrat-Reduktase-Aktivität“ zu berechnen, und als Mikrogramm Nitrit-N angegeben, das pro Person und Minute gebildet wird.

Definitionen:

Aus praktischen Gründen wird GERD klinisch gemäß dem Montrealer Gipfel als lästiges Aufstoßen oder Sodbrennen definiert, das mindestens einmal pro Woche auftritt. Diese Definition wird verwendet, um die nicht-erosiven Patienten einzuschreiben sowie GERD in den Kontrollen auszuschließen. Es wird auch verwendet, um die erosiven Patienten klinisch zu beurteilen. Die Kontrollen müssen nicht nur asymptomatisch (gemäß der oben genannten Definition) sein, sondern auch keine groben endoskopischen Anzeichen von Reflux aufweisen.

Ösophagogastroduodenoskopie und Probenahme für das Mikrobiom EGD werden durchgeführt und eine sterile umhüllte Bürste wird verwendet, um Darmmikrobiota zu sammeln. Bei jedem Patienten wird zuerst mit einer Bürste die mittlere und untere Speiseröhre, dann mit einer zweiten Bürste der Magen (große und kleine Krümmung des Körpers und Antrum), mit einer dritten Bürste die Zwölffingerdarmkappe und das distale Zwölffingerdarm gebürstet. Dies wird durchgeführt, während das Endoskop eingeführt wird, und in jedem Fall wird die Sammlung durch sanftes Bürsten des entsprechenden Bereichs erreicht. Das auf der Bürstenoberfläche gesammelte Material wird später in einem sterilen Röhrchen in RNA resuspendiert. Die Proben wurden bis zu 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, dann eingefroren und bei –80 °C gelagert. Japanische gefrorene Mikrobiomproben werden von einem der Ermittler zum McMaster Genome Center versandt oder gebracht. Die iranischen Proben werden in Teheran verarbeitet und die extrahierten DNA-Proben werden zur Sequenzierung an McMaster übertragen. Der letzte Teil, also die Analyse der sequenzierten DNA-Proben, kann entweder in Teheran oder bei McMaster erfolgen. Es werden jeweils zwei Biopsien aus Antrum und Magenkörper entnommen, um den H. pylori-Status als Behandlungsstandard beider Kohorten zu beurteilen.

Mikrobiomanalyse DNA-Extraktion und molekulares Profiling werden unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt. Das Profiling der Bakteriengemeinschaft des 16S-rRNA-Gens wird unter Verwendung von Paired-End-Reads der V3-Region durchgeführt. Dreifach-Amplifikationen werden für die Paired-End-Illumina-Sequenzierung mit 150 oder 250 nt im McMaster Genome Center gepoolt. Dieser Ansatz bietet überlappende Sequenz-Reads der V3-Region, die zur Korrektur von Base-Calls schlechter Qualität und zur Erhöhung der Sequenzierungsgenauigkeit verwendet werden können. Das Multiplexen des Laufs mit Strichcode-Primern liefert etwa 25.000 Sequenzablesungen pro Probe. Die Sequenzdaten werden von einer hauseigenen Bioinformatik-Pipeline verarbeitet, die eine Qualitätsfilterung mit cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur und QIIME beinhaltet. Die Ausgabe umfasst geclusterte Sequenzen in operationellen taxonomischen Einheiten (OTUs) unter Verwendung von AbundantOTU+ und taxonomische Zuordnungen unter Verwendung des RDP-Klassifikator-Klassifikators unter Verwendung des Greengenes-Trainingssatzes. Die Mikrobiomanalyse umfasst α-Diversitätsmetriken für jede Probe und β-Diversitätsmaße (gewichtete und ungewichtete Unifrac, Bray-Curtis, nichtmetrische multidimensionale Skalierung) und andere statistische Analysen mit QIIME25 und PhyloSeq. Funktionelle Eigenschaften der Mikrobiota werden mittels Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) abgeleitet und mittels Statistical verglichen

Stichprobengröße Die Forscher planen, 500 neue Patienten zu rekrutieren, die für eine Endoskopie des oberen Gastrointestinaltrakts in Kanada (McMaster University) und 500 in Japan (Division of Gastroenterology, Tohoku University Hospital) und 500 aus dem Iran (Teheran University) überwiesen werden. Dies basiert auf vorläufigen Daten von 20 Patienten, bei denen das Mikrobiom in Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm untersucht wurde, und geht davon aus, dass das Chancenverhältnis für die operative taxonomische Einheit zwischen organischer Erkrankung und gesunder Kontrolle (EGD ohne GI-Symptome z.B. zur Beurteilung einer Anämie, bei der keine Anomalien gefunden werden) und geht davon aus, dass es mindestens 50 gesunde Kontrollpersonen und 50 Patienten mit einer bestimmten Krankheit geben wird. 500 Patienten werden benötigt, da die Ermittler Magengeschwüre, FD und Ösophagitis separat bewerten und sich auf mehrere Tests einstellen müssen.

Für die NRA-Messung benötigen die Ermittler 18 Patienten unter GERD, NERD und dem Kontrollarm. Dies setzt ein Z-Alpha von 1,96 (zweiseitig), 1-Beta = 0,8416 voraus, Sigma von 0,99 und mittlere Differenz von 0,9310.

Statistische Analyse Beschreibende Ausgangsdaten werden analysiert und als Mittelwerte und Standardabweichungen für kontinuierliche Variablen sowie als Prozentsatz und Häufigkeit für kategoriale Variablen angegeben. Dichotome Variablen werden mit dem Chi-Quadrat-Test (x2) und kontinuierlich mit dem Student-t-Test (für zwei Gruppen) und ANOVA (für mehr als zwei Gruppen) analysiert, es sei denn, die Anzahl ist < 50 in einer Gruppe, wenn die Ermittler den Mann-Whitney-U-Test verwenden zwei Gruppen und Kruskal-Wallis für mehr als zwei Gruppen. SPSS Version 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokio, Japan) für Windows-Systeme wird verwendet, wobei die Unterschiede auf der Ebene <0,05 für die primären Ergebnisse und <0,01 für die sekundären Ergebnisse als signifikant angesehen werden, um mehrere Tests anzupassen.