Japanse bovenste GI-symptomen vergeleken met gepresenteerde Iraanse en Canadese patiënten

Doelstelling Het doel van de proef is om de bovenste GI-symptomen en endoscopiebevindingen in Canada te vergelijken met Japan en Iran, en dit te correleren met het bovenste GI-microbioom.

De primaire uitkomst is het bacteriële microbioom bij patiënten met FD in vergelijking met controlepatiënten zonder bovenste GI-symptomen en een normale endoscopie. De onderzoekers zullen een geplande subgroepanalyse uitvoeren op basis van het land van rekrutering en subgroepen op basis van geslacht en leeftijd (<of =50 jaar versus >50 jaar).

Secundaire uitkomsten zijn

1. Het microbioom bij patiënten met slokdarmontsteking in vergelijking met patiënten zonder slokdarmontsteking. Om de orale nitraatreducerende bacteriën op het dorsum van de tong van erosieve GORZ-patiënten en patiënten met niet-erosieve GORZ te beoordelen en deze te vergelijken met die van de normale controles die deelnamen aan de JUICE-studie.
2. Het microbioom bij patiënten met H. pylori-negatieve maagzweren (PUD) in vergelijking met H. pylori-positieve PUD-patiënten en asymptomatische normale endoscopiecontroles.
3. Het microbioom bij patiënten met angst versus controles zonder angst in de FD-groep.
4. Het microbioom bij mensen met een depressie versus controles zonder depressie in de FD-groep.
5. Het microbioom bij patiënten met angst versus controles zonder angst bij patiënten zonder bovenste GI-symptomen en een normale endoscopie.
6. Het microbioom bij mensen met een depressie versus controles zonder depressie bij de patiënten zonder bovenste GI-symptomen en een normale endoscopie
7. Vergelijking van bovenste GI-pathologie (ontsteking, dysplasie, maligniteit) en het microbioom in de Canadese versus de Japanse bevolking.

Methodologie Studiepopulatie, inclusie- en exclusiecriteria Dit is een prospectieve internationale cohortstudie in Canada, Japan en Iran. De onderzoekers zullen volwassen patiënten rekruteren (≥18 jaar) die om welke reden dan ook een oesofago-gastro-duodenoscopie (EGD) ondergaan en die ermee instemmen om gedurende de onderzoeksperiode deel te nemen aan het onderzoek. De controlegroep bestaat uit patiënten met geen of minimale bovenste GI-symptomen die worden doorverwezen voor EGD. Uitsluitingscriteria zijn de patiënten die geen Engels kunnen spreken in Canada, die geen Japans kunnen spreken in Japan en geen Perzisch kunnen spreken in Iran.

Werkwijze Schriftelijke toestemming wordt verkregen van alle deelnemers. De toestemming van de clinicus om medische redenen omvat standaardendoscopie en maagbiopten voor het beoordelen van de H.pylori-status. De onderzoekstoestemming omvat speekselverzameling met een specifiek apparaat genaamd "Oracol plus®" en weefselborsteling van de slokdarm, maag (lichaam en antrum) en distale twaalfvingerige darm. Als de patiënt in aanmerking komt voor deze studie, zullen de onderzoekers demografische gegevens registreren (leeftijd, geslacht, opleiding, ras, medische geschiedenis in het verleden, medicatiegebruik - vooral PPI's en antibiotica) en de belangrijkste reden voor endoscopie. Patiënten vullen vragenlijsten in; bovenste GI-symptomen gemeten door Short Form Leeds Dyspepsia Questionnaire (SFLDQ), kwaliteit van leven gemeten door EQ-5D, en angst en depressie gemeten door The Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Dan speekselopvangapparaat; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, VK) zal worden toegepast om speeksel op te vangen. Het apparaat is ontworpen om op dezelfde manier te worden gebruikt als een tandenborstel. Speeksel wordt verzameld door de spons stevig langs het tandvlees (indien aanwezig aan de basis van de tanden) en de achterkant van de tong te wrijven totdat de spons nat is, dit duurt ongeveer 1 minuut. Zodra het speeksel is afgenomen, zit het veilig in de container, een microbuisje is in het apparaat opgenomen zodat het speeksel rechtstreeks in het meegeleverde microbuisje wordt gecentrifugeerd. Dit verkleint het risico op aerosolbesmetting. Dit proces is bedoeld om de microbiomen in de mondholte te documenteren om de residente microbiomen in het bovenste deel van het maagdarmkanaal te bevestigen.

De meting van de orale nitraatreductaseactiviteit (NRA).

Gezien het feit dat erosieve GORZ vrij zeldzaam is in Japan, zal dit deel van het onderzoek als volgt worden uitgevoerd in Hamilton en Teheran:

Twintig erosieve GORZ-patiënten, twintig niet-erosieve GORZ-patiënten die deelnamen aan JUICE uit Canada en twintig controles zonder bovenste GI-symptomen werden ingeschreven nadat geïnformeerde toestemming is verkregen. Naast de procedures beschreven in JUICE, wordt het volgende gedaan voor deze groepen:

1. Een Oracol plus® wattenstaafje wordt gedurende 60 seconden over het tandvlees en de achterkant van de tong geborsteld, zoals beschreven in het hoofdprotocol. Het wordt op dezelfde manier verwerkt en de microbioomstudie wordt op dezelfde manier gedaan als beschreven voor het eigenlijke JUICE-protocol.
2. NRA wordt als volgt gemeten met opeenvolgende mondholtemonsters met tussenpozen van één minuut gedurende drie minuten: gevallen en controles wordt gevraagd om een ​​nacht te vasten en voedsel met een hoog nitraatgehalte (waaronder sla, kool, selderij, raap, rode biet, radijs en rabarber) te vermijden. minimaal 8 uur. Mond-NRA-test wordt gedaan tussen 7.30 en 10.00 uur. Op de ochtend van de test wordt de persoon in eerste instantie gevraagd zijn/haar mond te spoelen met 22 ml gedeïoniseerd, steriel water. Vervolgens wordt hem/haar gevraagd om 22 ml van een 10 mg nitraat-N/L-oplossing gedurende 3 minuten in de mond te houden. De proefpersoon wordt geïnstrueerd om de oplossing in de mond te mengen aan het begin en elke 1 minuut gedurende de 3 min, en 1,5 ml van de in de mond geïncubeerde oplossing wordt bemonsterd met een steriele injectiespuit na elke menging (d.w.z. aan het begin en aan het einde van de mond). intervallen van 1 minuut). De rest van de oplossing wordt weggegooid. Elk monster wordt onmiddellijk overgebracht in een Eppendorf-buis die 56,25 microliter 0,8 M NaOH bevat (om vitamine C te vernietigen en verdere nitrietproductie te stoppen). Vervolgens wordt 18,0 microliter 1,4 M ZnS04 aan elk buisje toegevoegd, 2 seconden geschud en 30 minuten bij kamertemperatuur gelaten. De monsters worden vervolgens gedurende 7 minuten bij 13.000 g bij 25°C gecentrifugeerd. Deze behandeling verwijdert de eiwitten die mogelijk kunnen interfereren met de Griess-reactie die wordt gebruikt voor nitrietmeting. Nitriet wordt gemeten door 250 microliter Griess-reagens A [0,2% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) geconcentreerd H3PO4] toe te voegen aan 500 microliter van het supernatant van het gecentrifugeerde monster in een cuvet van 1000 microliter en de absorptie af te lezen. bij 540 nm met behulp van een spectrofotometer (WPA BiowaveII, UK). Deze meting heet ''A1.'' Vervolgens wordt 250 microliter Griess-reagens B [0,02% (w/v) N-(1-naftyl)-ethyleendiamine-dihydrochloride-oplossing] aan de cuvette toegevoegd. De cuvet wordt vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker bewaard en de absorptie wordt opnieuw afgelezen bij 540 nm en de aflezing wordt ''A2'' genoemd. De waarde (A2-A1) wordt afgelezen tegen een standaardcurve die is ontwikkeld door bekende NaNO2-concentraties te testen en de uiteindelijke nitrietconcentratie wordt bepaald. Een monster van 500 microliter van het gedeïoniseerde steriele water wordt in elk geval op precies dezelfde manier behandeld als het speekselmonster en dient als blanco voor kwaliteitscontrole. Nitrietwaarden op 0, 1, 2 en 3 min worden uitgezet tegen de tijd en de helling van de trendlijn wordt berekend. Deze helling vertegenwoordigt het gevormde nitriet per persoon per minuut. De helling wordt vermenigvuldigd met 22 (het volume van de nitraatoplossing) om de ''nitraatreductase-activiteit'' te berekenen en gerapporteerd als microgram gevormd nitriet-N per persoon per minuut.

Definities:

Voor praktische doeleinden wordt GORZ volgens de top van Montreal klinisch gedefinieerd als lastige oprispingen of brandend maagzuur die minstens één keer per week voorkomen. Deze definitie zal worden gebruikt om de niet-erosieve patiënten in te schrijven en GORZ uit te sluiten in controles. Het zal ook worden gebruikt om de erosieve patiënten klinisch te beoordelen. De controles moeten niet alleen asymptomatisch zijn (volgens de bovenstaande definitie), maar ook geen grove endoscopische tekenen van reflux vertonen.

Esophagogastroduodenoscopie en bemonstering voor het microbioom EGD zullen worden uitgevoerd en een steriele omhulde borstel zal worden gebruikt om de darmmicrobiota te verzamelen. Voor elke patiënt wordt eerst het weefsel geborsteld vanaf de middelste en onderste slokdarm met één borstel, vervolgens de maag (grotere en kleinere kromming van lichaam en antrum) met een tweede borstel, de kap van de twaalfvingerige darm en de distale twaalfvingerige darm met een derde borstel. Dit wordt uitgevoerd terwijl de endoscoop wordt ingebracht en in elk geval wordt de verzameling verkregen door het juiste gebied voorzichtig te borstelen. Het materiaal dat op het borsteloppervlak wordt verzameld, wordt later opnieuw in RNA gesuspendeerd in een steriele buis. Monsters mochten maximaal 2 uur bij kamertemperatuur incuberen, daarna werden ze ingevroren en bewaard bij -80°C. Japanse ingevroren microbioommonsters worden door een van de onderzoekers naar het McMaster Genome Center verzonden of gebracht. De Iraanse monsters zullen worden verwerkt in Teheran en de geëxtraheerde DNA-monsters zullen worden overgebracht naar McMaster voor sequentiebepaling. Het laatste deel, d.w.z. de analyse van de DNA-monsters waarvan de sequentie is bepaald, kan in Teheran of bij McMaster worden gedaan. Twee biopsieën, elk van het antrum en het maaglichaam, zullen worden verkregen om de H. pylori-status te beoordelen als standaardzorg voor beide cohorten.

Microbioomanalyse DNA-extractie en moleculaire profilering zullen worden uitgevoerd met behulp van standaardprotocollen. Bacteriële gemeenschapsprofilering van het 16S rRNA-gen zal worden uitgevoerd met behulp van gepaarde einduitlezingen van de V3-regio. Amplificaties in drievoud zullen worden samengevoegd voor 150 of 250 nt Illumina-sequencing met gepaarde uiteinden in het McMaster Genome Center. Deze benadering biedt overlappende sequentie-uitlezingen van de V3-regio, die kan worden gebruikt voor het corrigeren van basisoproepen van slechte kwaliteit en het vergroten van de nauwkeurigheid van de sequentie. Het multiplexen van de run met primers met streepjescode levert ongeveer 25.000 sequentielezingen per monster op. De sequentiegegevens zullen worden verwerkt door een interne bioinformatica-pijplijn die kwaliteitsfiltering bevat met cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur en QIIME. De uitvoer omvat geclusterde reeksen in operationele taxonomische eenheden (OTU's) met behulp van AbundantOTU+ en taxonomische toewijzingen met behulp van de RDP-classificatieclassificatie met behulp van de Greengenes-trainingsset. Microbiome-analyse omvat α-diversiteitsstatistieken voor elk monster en β-diversiteitsmetingen (gewogen en ongewogen unifrac, Bray-Curtis, niet-metrische multidimensionale schaling) en andere statistische analyse met behulp van QIIME25 en PhyloSeq. Functionele eigenschappen van de microbiota zullen worden afgeleid met behulp van Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) en verder worden vergeleken met behulp van Statistical

Steekproefomvang De onderzoekers zijn van plan 500 nieuwe patiënten te werven die zijn doorverwezen voor endoscopie van het bovenste deel van het maagdarmkanaal in Canada (McMaster University) en 500 in Japan (Division of Gastroenterology, Tohoku University Hospital) en 500 uit Iran (Tehran University). Dit is gebaseerd op voorlopige gegevens van 20 patiënten bij wie het microbioom in de slokdarm, maag en twaalfvingerige darm is beoordeeld en er wordt aangenomen dat de odds ratio voor de operationele taxonomische eenheid het dubbele zal zijn tussen organische ziekte en gezonde controle (EGD zonder gastro-intestinale symptomen). bijv. voor evaluatie van bloedarmoede waarbij geen afwijking wordt gevonden) en gaat ervan uit dat er ten minste 50 gezonde controles en 50 patiënten met een bepaalde ziekte zullen zijn. Er zijn 500 patiënten nodig, aangezien de onderzoekers maagzweren, FD en oesofagitis afzonderlijk zullen evalueren en zich moeten aanpassen voor meerdere tests.

Voor NRA-meting hebben de onderzoekers 18 patiënten nodig uit GERD, NERD en controlearm. Hierbij wordt uitgegaan van een Z-alfa van 1,96 (tweezijdig), 1-beta=0,8416, Sigma van 0,99 en gemiddeld verschil van 0,9310.

Statistische analyse Baseline beschrijvende gegevens zullen worden geanalyseerd en gerapporteerd als gemiddelden en standaarddeviaties voor continue variabelen, en percentage en frequentie voor categorische variabelen. Dichotome variabelen zullen worden geanalyseerd volgens de Chi-kwadraat (x2)-test en continu met de Student's t-test (voor twee groepen) en ANOVA (voor meer dan twee groepen), tenzij de aantallen < 50 in een groep zijn, wanneer de onderzoekers de Mann Whitney U-test zullen gebruiken voor twee groepen en Kruskal-Wallis voor meer dan twee groepen. SPSS versie 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokio, Japan) voor Windows-systemen zal worden gebruikt met verschillen die als significant worden beschouwd op het niveau <0,05 voor de primaire uitkomsten en <0,01 voor de secundaire om te corrigeren voor meervoudige tests.