Japanilaiset ylemmän GI-oireet verrattuna iranilaisiin ja kanadalaisiin potilaisiin

Tavoite Kokeen tarkoituksena on verrata ylemmän GI-oireita ja endoskopialöydöksiä Kanadassa Japanin ja Iranin kanssa ja korreloida tämä ylemmän GI-mikrobiomin kanssa.

Ensisijainen tulos on bakteeri-mikrobiomi FD-potilailla verrattuna kontrollipotilaisiin, joilla ei ole ylemmän maha-suolikanavan oireita ja normaalia endoskopiaa. Tutkijat tekevät suunnitellun alaryhmäanalyysin rekrytointimaan sekä sukupuoleen ja ikään perustuvien alaryhmien mukaan (<tai =50 vuotta vastaan ​​>50 vuotta)

Toissijaiset tulokset ovat

1. Esofagiittipotilaiden mikrobiomi verrattuna potilaisiin, joilla ei ole esofagiittia. Arvioida oraalisia nitraattia vähentäviä bakteereja erosiivisten GERD-potilaiden kielen selässä, potilailla, joilla on ei-eroosiota GERD, ja vertailla niitä JUICE-tutkimukseen osallistuneiden normaaleiden kontrollien bakteerien kanssa.
2. Mikrobiomi H. pylori-negatiivista mahahaavatautia (PUD) sairastavilla potilailla verrattuna H. pylori-positiivisiin PUD-potilaisiin ja oireettomiin normaaleihin endoskopiakontrolleihin.
3. Ahdistuneesta kärsivien potilaiden mikrobiomi verrattuna kontrolleihin, joilla ei ole ahdistusta FD-ryhmässä.
4. Mikrobiomi masennuksesta kärsivillä verrattuna kontrolleihin, joilla ei ole masennusta FD-ryhmässä.
5. Ahdistuneesta kärsivien potilaiden mikrobiomi verrattuna kontrolleihin, joilla ei ole ahdistusta potilailla, joilla ei ole ylemmän maha-suolikanavan oireita ja normaalia endoskopiaa.
6. Mikrobiomi masennuksesta kärsivillä verrattuna kontrolleihin, joilla ei ole masennusta potilailla, joilla ei ole ylemmän GI-oireita ja normaalia endoskopiaa
7. Ylemmän GI-patologian (tulehdus, dysplasia, pahanlaatuisuus) ja mikrobiomin vertailu kanadalaisiin verrattuna japanilaisiin populaatioihin.

Metodologia Tutkimuspopulaatio, inkluusio- ja poissulkemiskriteerit Tämä on tuleva kansainvälinen kohorttitutkimus Kanadassa, Japanissa ja Iranissa. Tutkijat rekrytoivat aikuispotilaita (≥18-vuotiaita), joille tehdään esophago-gastro duodenoskopia (EGD) mistä tahansa syystä ja jotka suostuvat osallistumaan tutkimukseen tutkimusjakson aikana. Kontrolliryhmän muodostavat potilaat, joilla ei ole tai joilla on vain vähän ylemmän GI-oireita ja jotka lähetetään EGD:hen. Poissulkemiskriteerit ovat potilaat, jotka eivät osaa puhua englantia Kanadassa, jotka eivät puhu japania Japanissa ja jotka eivät voi puhua persiaa Iranissa.

Menetelmät Kaikilta osallistujilta hankitaan kirjallinen suostumus. Kliinikon lääketieteellisistä syistä antamaan suostumukseen sisältyy tavallinen endoskopia ja mahalaukun biopsiat H. pylori -statuksen arvioimiseksi. Tutkimuslupa sisältää syljen keräämisen erityisellä "Oracol plus®" -laitteella sekä kudosharjauksen ruokatorvessa, mahassa (vartalo ja antrum) ja distaalisessa pohjukaissuolessa. Jos potilas on kelvollinen tähän tutkimukseen, tutkijat kirjaavat demografiset tiedot (ikä, sukupuoli, koulutus, rotu, aiempi sairaushistoria, lääkitys - erityisesti PPI:t ja antibiootit) ja pääasiallisen endoskopian syyn. Potilaat täyttävät kyselylomakkeet; ylemmän GI-oireet mitattuna Short Form Leeds Dyspepsia Questionnairella (SFLDQ), elämänlaatu mitattuna EQ-5D:llä ja ahdistuneisuus ja masennus mitattuna sairaalan ahdistuneisuus- ja masennusasteikolla (HADS). Sitten syljenkeräyslaite; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, UK) levitetään syljen keräämiseen. Laite on suunniteltu käytettäväksi samalla tavalla kuin hammasharjaa. Sylki kerätään hieromalla sienipuikkoa tiukasti pitkin ikeniä (jos hampaiden tyvestä) sekä kielen selkää pitkin, kunnes sieni on märkä. Tämä kestää noin minuutin. Kun sylki on otettu, se on kiinni säiliössä, laitteeseen liitetään mikroputki niin, että sylki sentrifugoidaan suoraan mukana olevaan mikroputkeen. Tämä vähentää aerosolikontaminaation riskiä. Tämän prosessin tarkoituksena on dokumentoida suuontelon mikrobiomit, jotta voidaan vahvistaa ylemmän ruoansulatuskanavan mikrobiomit.

Suun kautta otettava nitraattireduktaasiaktiivisuuden (NRA) mittaus

Ottaen huomioon, että erosiivinen GERD on melko harvinainen Japanissa, tämä osa tutkimuksesta suoritetaan Hamiltonissa ja Teheranissa seuraavasti:

Kaksikymmentä erosiivista GERD-potilasta, kaksikymmentä ei-eroosiota GERD-potilasta, jotka on otettu mukaan JUICE-ohjelmaan Kanadasta, ja kaksikymmentä kontrollia, joilla ei ole ylemmän GI-oireita, otetaan mukaan tietoisen suostumuksen saatuaan. JUICE-julkaisussa kuvattujen toimenpiteiden lisäksi näille ryhmille tehdään seuraavaa:

1. Oracol plus® -puikolla harjataan ikeniä ja kielen selkää 60 sekunnin ajan pääprotokollassa kuvatulla tavalla. Se käsitellään samalla tavalla ja mikrobiomitutkimus tehdään samalla tavalla kuin varsinaiselle JUICE-protokollalle on kuvattu.
2. NRA mitataan peräkkäisillä suuontelonäytteillä minuutin välein kolmen minuutin ajan seuraavasti: tapauksia ja kontrolleja pyydetään paastoamaan yön yli ja välttämään runsaasti nitraattia sisältäviä ruokia (mukaan lukien salaatti, kaali, selleri, nauris, punajuuri, retiisi ja raparperi) vähintään 8 h. Suun NRA-määritys tehdään klo 7.30-10.00. Testiaamuna henkilöä pyydetään aluksi huuhtelemaan suunsa 22 ml:lla deionisoitua, steriiliä vettä. Sitten häntä pyydetään pitämään suussa 22 ml 10 mg nitraatti-N/L-liuosta 3 minuutin ajan. Potilasta neuvotaan sekoittamaan liuos suussa alussa ja 1 minuutin välein 3 minuutin ajan, ja 1,5 ml suussa inkuboidusta liuoksesta otetaan näyte steriilillä ruiskulla jokaisen sekoituksen jälkeen (eli alussa ja klo. 1 minuutin välein). Loput liuoksesta heitetään pois. Jokainen näyte siirretään välittömästi Eppendorf-putkeen, joka sisältää 56,25 mikrolitraa 0,8 M NaOH:ta (C-vitamiinin tuhoamiseksi ja nitriittituotannon lisäämiseksi). Sitten kuhunkin putkeen lisätään 18,0 mikrolitraa 1,4 M ZnS04:a, ravistellaan 2 s ja jätetään huoneenlämpötilaan 30 minuutiksi. Näytteitä sentrifugoidaan sitten 13 000 g:ssä 25 ℃:ssa 7 minuutin ajan. Tämä käsittely poistaa proteiinit, jotka voisivat mahdollisesti häiritä nitriittimittauksessa käytettävää Griess-reaktiota. Nitriitti mitataan lisäämällä 250 mikrolitraa Griess-reagenssia A [0,2 % (w/v) sulfanilamidia 5 % (v/v) väkevässä H3PO4:ssa] 500 mikrolitraan sentrifugoidun näytteen supernatanttia 1 000 mikrolitran kyvetissä ja lukemalla absorbanssi. 540 nm:ssä käyttäen spektrofotometriä (WPA BiowaveII, UK). Tämän lukeman nimi on "A1". Sitten kyvettiin lisätään 250 mikrolitraa Griess-reagenssia B [0,02 % (w/v) N-(1-naftyyli)etyleenidiamiinidihydrokloridiliuos]. Sitten kyvettiä pidetään pimeässä huoneenlämpötilassa 10 minuuttia ja absorbanssi luettiin uudelleen aallonpituudella 540 nm ja lukema nimettiin "A2". Arvo (A2-A1) luetaan standardikäyrää vastaan, joka on kehitetty testaamalla tunnettuja NaNO2-pitoisuuksia, ja lopullinen nitriittipitoisuus määritetään. 500 mikrolitran näyte deionisoidusta steriilistä vedestä käsitellään täsmälleen samalla tavalla kuin sylkinäyte jokaisessa tapauksessa ja toimii nollanäytteenä laadunvalvonnassa. Nitriittiarvot 0, 1, 2 ja 3 minuutin kohdalla piirretään ajan funktiona ja lasketaan trendiviivan kaltevuus. Tämä kaltevuus edustaa nitriittiä, joka muodostuu henkilöä kohti minuutissa. Kaltevuus kerrotaan 22:lla (nitraattiliuoksen tilavuus) 'nitraattireduktaasiaktiivisuuden' laskemiseksi ja ilmoitetaan mikrogrammina nitriitti-N muodostuneena henkilöä kohti minuutissa.

Määritelmät:

Käytännön syistä GERD määritellään kliinisesti Montrealin huippukokouksen mukaan ongelmalliseksi regurgitaatioksi tai närästykseksi, joka esiintyy vähintään kerran viikossa. Tätä määritelmää käytetään ei-eroosiota aiheuttavien potilaiden rekisteröintiin sekä GERD:n poissulkemiseen kontrolleista. Sitä käytetään myös eroosiopotilaiden kliiniseen arviointiin. Kontrollien ei tarvitse olla ainoastaan ​​oireettomia (yllä mainitun määritelmän mukaan), vaan niissä ei myöskään saa olla karkeaa endoskooppista refluksimerkkiä.

Esophagogastroduodenoscopy ja näytteenotto mikrobiomin EGD:tä varten tehdään ja suoliston mikrobiot kerätään steriilillä tupakkaalla harjalla. Kullekin potilaalle suoritetaan kudosharjaus ensin ruokatorven keski- ja alaosasta yhdellä harjalla, sitten mahalaukusta (vartalon ja antrumin suurempi ja pienempi kaarevuus) toisella harjalla, pohjukaissuolen hattu ja distuaalinen pohjukaissuoli kolmannella harjalla. Tämä tehdään, kun endoskooppi viedään sisään, ja jokaisessa tapauksessa keräys saadaan harjaamalla varovasti sopivaa aluetta. Harjan pinnalle kerätty materiaali suspendoidaan uudelleen RNA:han myöhemmin steriilissä putkessa. Näytteiden annettiin inkuboitua huoneenlämmössä enintään 2 tuntia, sitten ne jäädytettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa. Japanilaiset jäädytetyt mikrobiominäytteet lähettää tai tuoda McMaster Genome Centeriin yksi tutkijoista. Iranilaiset näytteet käsitellään Teheranissa ja uutetut DNA-näytteet siirretään McMasterille sekvensointia varten. Viimeinen osa eli sekvensoitujen DNA-näytteiden analyysi voidaan tehdä joko Teheranissa tai McMasterissa. Kaksi biopsiaa otetaan kumpikin antrumista ja mahalaukusta H. pylori -statuksen arvioimiseksi molempien kohortien hoidon standardina.

Mikrobiomianalyysi DNA-uutto ja molekyyliprofilointi suoritetaan standardiprotokollia käyttäen. 16S-rRNA-geenin bakteeriyhteisön profilointi suoritetaan käyttämällä V3-alueen paripään lukuja. Kolminkertaiset amplifikaatiot yhdistetään 150 tai 250 nt:n parillisen pään Illumina-sekvensointia varten McMaster Genome Centerissä. Tämä lähestymistapa tarjoaa päällekkäiset sekvenssilukemat V3-alueelta, joita voidaan käyttää huonolaatuisten peruspuheluiden korjaamiseen ja sekvensoinnin tarkkuuden lisäämiseen. Ajon multipleksointi viivakoodialukkeilla tuottaa noin 25 000 sekvenssilukemaa näytettä kohti. Sekvenssitiedot käsitellään talon sisäisessä bioinformatiikkaprosessissa, joka sisältää laatusuodatuksen cutadap PandaSeq:llä, AbundantOTU+:lla, mothurilla ja QIIME:llä. Tulos sisältää klusteroituja sekvenssejä operatiivisissa taksonomisissa yksiköissä (OTU) käyttäen AbundantOTU+:a ja taksonomisia määrityksiä RDP-luokittelijan luokittimella Greengenes-koulutussarjan avulla. Mikrobiomianalyysi sisältää α-diversiteettimittaukset jokaiselle näytteelle ja β-diversiteettimitat (painotettu ja painottamaton unifrac, Bray-Curtis, ei-metrinen moniulotteinen skaalaus) ja muu tilastollinen analyysi käyttämällä QIIME25:tä ja PhyloSeqiä. Mikrobiootan toiminnalliset ominaisuudet päätellään käyttämällä Phylogenetic Investigation of Communities of Communed by Unobserved States Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) avulla ja verrataan edelleen käyttämällä Statistical-tutkimusta.

Otoskoko Tutkijat suunnittelevat rekrytoivansa 500 uutta potilasta ylemmän GI-endoskopiaan Kanadassa (McMaster University) ja 500 Japanissa (Division of Gastroenterology, Tohoku University Hospital) ja 500 Iranista (Tehranin yliopisto). Tämä perustuu alustaviin tietoihin 20 potilaalta, jotka ovat arvioineet ruokatorven, mahan ja pohjukaissuolen mikrobiomia, ja oletetaan, että operatiivisen taksonomisen yksikön todennäköisyyssuhde on kaksinkertainen orgaanisen sairauden ja terveen kontrollin (EGD ilman GI-oireita) välillä. esimerkiksi anemian arvioimiseksi, jos poikkeavuutta ei löydy) ja oletetaan, että vähintään 50 tervettä kontrollia ja 50 potilasta, joilla on tietty sairaus. 500 potilasta tarvitaan, koska tutkijat arvioivat mahahaavan, FD:n ja ruokatorven tulehduksen erikseen ja joutuvat mukautumaan useisiin testauksiin.

NRA-mittauksia varten tutkijat tarvitsevat 18 potilasta GERD:stä, NERD:stä ja kontrolliryhmästä. Tämä olettaa, että Z-alfa on 1,96 (kaksipuolinen), 1-beta = 0,8416, Sigma 0,99 ja keskimääräinen ero 0,9310.

Tilastollinen analyysi Perustason kuvaavat tiedot analysoidaan ja raportoidaan jatkuvien muuttujien keskiarvoina ja keskihajonnana sekä kategoristen muuttujien prosenttiosuuksina ja frekvenssinä. Dikotomiset muuttujat analysoidaan käyttämällä Chi-neliötestiä (x2) ja jatkuvasti käyttäen Studentin t-testiä (kahdelle ryhmälle) ja ANOVAa (useammille kuin kahdelle ryhmälle), elleivät luvut ole < 50 ryhmässä, kun tutkijat käyttävät Mann Whitneyn U -testiä kaksi ryhmää ja Kruskal-Wallis useammalle kuin kahdelle ryhmälle. SPSS-versiota 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokio, Japani) Windows-järjestelmille käytetään eroilla, joiden katsotaan olevan merkittäviä <0,05-tasolla ensisijaisten tulosten osalta ja <0,01-tasolla toissijaisten tulosten mukauttamiseksi useisiin testauksiin.