Симптомы верхних отделов желудочно-кишечного тракта у японцев по сравнению с иранскими и канадскими пациентами

Цель Целью исследования является сравнение симптомов верхних отделов желудочно-кишечного тракта и результатов эндоскопии в Канаде с Японией и Ираном и сопоставление их с микробиомом верхних отделов желудочно-кишечного тракта.

Первичным исходом является бактериальный микробиом у пациентов с БФ по сравнению с контрольными пациентами без симптомов со стороны верхних отделов ЖКТ и нормальной эндоскопией. Исследователи проведут запланированный анализ подгрупп в зависимости от страны найма, а также подгрупп по полу и возрасту (< или = 50 лет против > 50 лет).

Вторичные результаты

1. Микробиом у пациентов с эзофагитом по сравнению с пациентами без эзофагита. Оценить оральные нитратредуцирующие бактерии на спинке языка у пациентов с эрозивной ГЭРБ, у пациентов с неэрозивной ГЭРБ и сравнить их с таковыми у здоровых людей, включенных в исследование JUICE.
2. Микробиом у пациентов с H. pylori-негативной язвенной болезнью (ЯБ) по сравнению с H. pylori-положительными пациентами с ЯБ и бессимптомным контролем при эндоскопии.
3. Микробиом у пациентов с тревогой по сравнению с контрольной группой без тревоги в группе БФ.
4. Микробиом у людей с депрессией по сравнению с контрольной группой без депрессии в группе БФ.
5. Микробиом у пациентов с тревогой по сравнению с контрольной группой без тревоги у пациентов без симптомов верхних отделов желудочно-кишечного тракта и нормальной эндоскопии.
6. Микробиом у пациентов с депрессией по сравнению с контрольной группой без депрессии у пациентов без симптомов верхних отделов желудочно-кишечного тракта и нормальной эндоскопии
7. Сравнение патологии верхних отделов желудочно-кишечного тракта (воспаление, дисплазия, злокачественное новообразование) и микробиома у канадцев и японцев.

Методология Исследуемая популяция, критерии включения и исключения Это проспективное международное когортное исследование в Канаде, Японии и Иране. Исследователи будут набирать взрослых пациентов (в возрасте ≥18 лет), которым по какой-либо причине проводится эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС) и которые дали согласие на включение в исследование в течение периода исследования. Контрольная группа будет состоять из пациентов с минимальными или отсутствующими симптомами верхних отделов желудочно-кишечного тракта, направленных на ФГДС. Критериями исключения будут пациенты, которые не говорят по-английски в Канаде, не говорят по-японски в Японии и не говорят по-персидски в Иране.

Методы Письменное согласие будет получено от всех участников. Согласие врача по медицинским показаниям включает стандартную эндоскопию и биопсию желудка для оценки статуса H.pylori. Согласие на исследование включает сбор слюны с помощью специального устройства под названием «Oracol plus®» и чистку тканей пищевода, желудка (тела и антрального отдела) и дистального отдела двенадцатиперстной кишки. Если пациент подходит для этого исследования, исследователи записывают демографические данные (возраст, пол, образование, раса, история болезни, прием лекарств, особенно ИПП и антибиотиков), а также основную причину проведения эндоскопии. Пациенты будут заполнять анкеты; симптомы верхних отделов желудочно-кишечного тракта, измеренные с помощью краткого опросника диспепсии Лидса (SFLDQ), качество жизни, измеренное с помощью EQ-5D, и тревога и депрессия, измеренные с помощью госпитальной шкалы тревоги и депрессии (HADS). Затем устройство для сбора слюны; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Ворчестер, Великобритания) будет применяться для сбора слюны. Устройство предназначено для использования аналогично зубной щетке. Слюну собирают, плотно протирая губкой десну (у основания зубов, если они есть), а также спинку языка, пока губка не станет влажной, это занимает около 1 минуты. После взятия слюны она надежно помещается в контейнер, в устройство встраивается микропробирка, так что слюна центрифугируется непосредственно в предоставленной микропробирке. Это снижает риск аэрозольного загрязнения. Этот процесс направлен на документирование микробиомов в полости рта, чтобы подтвердить резидентные микробиомы в верхних отделах желудочно-кишечного тракта.

Измерение пероральной активности нитратредуктазы (NRA)

Учитывая, что эрозивная ГЭРБ встречается в Японии довольно редко, эта часть исследования будет проводиться в Гамильтоне и Тегеране следующим образом:

Двадцать пациентов с эрозивной ГЭРБ, двадцать пациентов с неэрозивной ГЭРБ, зарегистрированных в JUICE из Канады, и двадцать контрольных пациентов без симптомов со стороны верхних отделов ЖКТ были включены после получения информированного согласия. В дополнение к процедурам, описанным в JUICE, для этих групп делается следующее:

1. Тампоном Oracol plus® чистят десны и спинку языка в течение 60 секунд, как описано в основном протоколе. Он обрабатывается таким же образом, и исследование микробиома выполняется так же, как описано для собственно протокола JUICE.
2. NRA измеряется с помощью последовательных проб из полости рта с интервалом в одну минуту в течение трех минут следующим образом: пациентов и контрольную группу просят голодать в течение ночи и избегать продуктов с высоким содержанием нитратов (включая салат, капусту, сельдерей, репу, свеклу, редьку и ревень) в течение не менее 8 ч. Анализ полости рта NRA проводится между 7:30 и 10:00. Утром перед тестом человека сначала просят прополоскать рот 22 мл деионизированной стерильной воды. Затем его просят подержать во рту 22 мл 10 мг нитратно-н/л раствора в течение 3 мин. Испытуемому предлагается смешивать раствор во рту в начале и каждую 1 мин в течение 3 мин, а 1,5 мл раствора, инкубированного во рту, отбирают стерильным шприцем после каждого смешивания (т. е. в начале и в 1-минутные интервалы). Остаток раствора отбрасывается. Каждый образец немедленно переносится в пробирку Эппендорфа, содержащую 56,25 мкл 0,8 М NaOH (для разрушения витамина С и ограничения дальнейшего образования нитритов). Затем в каждую пробирку добавляют по 18,0 мкл 1,4 М ZnSO4, встряхивают 2 с и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Затем образцы центрифугируют при 13000g при 25℃ в течение 7 минут. Эта обработка удаляет белки, которые могут мешать реакции Грисса, используемой для измерения нитритов. Нитриты измеряют путем добавления 250 мкл реагента Грисса А [0,2% (масса/объем) сульфаниламида в 5% (объем/объем) концентрированной H3PO4] к 500 мкл супернатанта центрифугированного образца в кювете на 1000 мкл и измерении оптической плотности. при 540 нм с использованием спектрофотометра (WPA BiowaveII, Великобритания). Это чтение называется «А1». Затем в кювету добавляют 250 микролитров реактива Грисса B [0,02% (мас./об.) раствора N-(1-нафтил)-этилендиамин-дигидрохлорида]. Затем кювету выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут и снова измеряют оптическую плотность при 540 нм, а показание называют «А2». Значение (A2-A1) считывается по стандартной кривой, построенной путем тестирования известных концентраций NaNO2 и определения конечной концентрации нитрита. Образец деионизированной стерильной воды объемом 500 мкл обрабатывается точно так же, как образец слюны в каждом случае, и служит в качестве контрольного образца для контроля качества. Значения нитритов на 0, 1, 2 и 3 мин нанесены на график в зависимости от времени и рассчитан наклон линии тренда. Этот наклон представляет собой количество нитритов, образующихся на человека в минуту. Наклон умножается на 22 (объем нитратного раствора) для расчета «активности нитратредуктазы» и выражается в микрограммах нитрита-N, образующегося на человека в минуту.

Определения:

Для практических целей ГЭРБ определяется клинически в соответствии с Монреальским саммитом как неприятная регургитация или изжога, возникающие не реже одного раза в неделю. Это определение будет использоваться для регистрации неэрозивных пациентов, а также для исключения ГЭРБ из контрольной группы. Он также будет использоваться для клинической оценки пациентов с эрозиями. Контрольная группа должна быть не только бессимптомной (в соответствии с приведенным выше определением), но и не иметь грубых эндоскопических признаков рефлюкса.

Будут выполнены эзофагогастродуоденоскопия и забор проб для ЭГДС микробиома, а для сбора микробиоты кишечника будет использована стерильная щетка с чехлом. Каждому пациенту проводят чистку тканей сначала от среднего и нижнего отделов пищевода одной щеткой, затем желудка (большой и малой кривизны тела и антрального отдела) второй щеткой, дуоденального колпачка и дистального отдела двенадцатиперстной кишки третьей щеткой. Это будет проводиться при введении эндоскопа, и в каждом случае коллекция будет получена путем осторожной чистки соответствующей области. Материал, собранный на поверхности щетки, позже будет ресуспендирован в РНК в стерильной пробирке. Образцы инкубировали при комнатной температуре до 2 часов, затем замораживали и хранили при -80°С. Образцы японского замороженного микробиома будут отправлены или доставлены в Центр генома Макмастера одним из исследователей. Иранские образцы будут обработаны в Тегеране, а извлеченные образцы ДНК будут переданы Макмастеру для секвенирования. Последняя часть, то есть анализ секвенированных образцов ДНК, может быть проведена либо в Тегеране, либо в McMaster. Будет получено две биопсии из антрального отдела и тела желудка для оценки статуса H. pylori в качестве стандарта лечения обеих когорт.

Анализ микробиома Извлечение ДНК и молекулярное профилирование будут проводиться с использованием стандартных протоколов. Профилирование бактериального сообщества гена 16S рРНК будет проводиться с использованием парных концевых прочтений области V3. Тройные амплификации будут объединены для секвенирования парных концов Illumina длиной 150 или 250 нуклеотидов в Центре генома Макмастера. Этот подход обеспечивает считывание перекрывающихся последовательностей области V3, которые можно использовать для исправления базовых вызовов низкого качества и повышения точности секвенирования. Мультиплексирование прогона с праймерами со штрих-кодом обеспечит примерно 25 000 считываний последовательностей на образец. Данные о последовательности будут обрабатываться собственным конвейером биоинформатики, который включает качественную фильтрацию с помощью cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur и QIIME. Выходные данные будут включать сгруппированные последовательности в операционных таксономических единицах (OTU) с использованием AbundantOTU+ и таксономические назначения с использованием классификатора-классификатора RDP с использованием обучающего набора Greengenes. Анализ микробиома будет включать показатели α-разнообразия для каждого образца и меры β-разнообразия (взвешенная и невзвешенная unifrac, Брея-Кертиса, неметрическое многомерное масштабирование) и другой статистический анализ с использованием QIIME25 и PhyloSeq. Функциональные свойства микробиоты будут выводиться с использованием Филогенетического исследования сообществ путем реконструкции ненаблюдаемых состояний (PICRUSt) и далее сравниваться с использованием Статистического анализа.

Размер выборки Исследователи планируют набрать 500 новых пациентов, направленных на эндоскопию верхних отделов желудочно-кишечного тракта в Канаде (Университет Макмастера), 500 в Японии (отделение гастроэнтерологии, университетская больница Тохоку) и 500 из Ирана (Тегеранский университет). Это основано на предварительных данных от 20 пациентов, у которых была оценка микробиома в пищеводе, желудке и двенадцатиперстной кишке, и предполагает, что отношение шансов для операционной таксономической единицы будет двукратным между органическим заболеванием и здоровым контролем (ЭГДС без симптомов ЖКТ). например, для оценки анемии при отсутствии отклонений) и предполагает, что будет по крайней мере 50 здоровых контролей и 50 пациентов с данным заболеванием. Потребуется 500 пациентов, так как исследователи будут оценивать язву желудка, ФД и эзофагит по отдельности и должны будут скорректировать результаты множественных тестов.

Для измерения NRA исследователям требуется 18 пациентов с ГЭРБ, НЭРБ и контрольной группой. Это предполагает Z-альфа 1,96 (двусторонний), 1-бета = 0,8416, Сигма 0,99 и средняя разница 0,9310.

Статистический анализ Исходные описательные данные будут проанализированы и представлены в виде средних значений и стандартных отклонений для непрерывных переменных, а также в процентах и ​​частоте для категориальных переменных. Дихотомические переменные будут анализироваться с использованием критерия Хи-квадрат (х2) и непрерывного использования критерия Стьюдента (для двух групп) и дисперсионного анализа (для более чем двух групп), кроме случаев, когда числа в группе < 50, когда исследователи будут использовать U-критерий Манна-Уитни для две группы и Крускал-Уоллис для более чем двух групп. SPSS версии 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Токио, Япония) для систем Windows будет использоваться с различиями, которые считаются значимыми на уровне <0,05 для первичных результатов и <0,01 для вторичных исходов для корректировки множественного тестирования.