日本上消化道症状与伊朗和加拿大患者的比较

目的 该试验的目的是比较加拿大与日本和伊朗的上消化道症状和内窥镜检查结果，并将其与上消化道微生物群相关联。

主要结果是 FD 患者的细菌微生物组与没有上消化道症状且内镜检查正常的对照组患者相比。 研究人员将根据招募国家以及基于性别和年龄的亚组（<或=50 岁与 >50 岁）进行计划的亚组分析

次要结果是

1. 与没有食管炎的患者相比，食管炎患者的微生物组。 评估侵蚀性 GERD 患者、非侵蚀性 GERD 患者舌背上的口腔硝酸盐还原菌，并将其与参加 JUICE 研究的正常对照组进行比较。
2. 幽门螺杆菌阴性消化性溃疡病 (PUD) 患者与幽门螺杆菌阳性 PUD 患者和无症状的正常内窥镜检查对照组相比的微生物组。
3. FD 组焦虑症患者与无焦虑症对照组的微生物组。
4. FD 组抑郁症患者与无抑郁症对照组的微生物组。
5. 焦虑症患者的微生物组与无上消化道症状且内窥镜检查正常的无焦虑症患者的微生物组对比。
6. 抑郁症患者与无上消化道症状且内窥镜检查正常的无抑郁症患者的微生物组对比
7. 比较加拿大人和日本人的上消化道病理学（炎症、发育不良、恶性肿瘤）和微生物组。

方法学研究人口、纳入和排除标准这是一项在加拿大、日本和伊朗进行的前瞻性国际队列研究。 研究者将招募因任何原因接受食管胃十二指肠镜检查 (EGD) 并同意在研究期间参加研究的成年患者（≥18 岁）。 对照组将是没有或只有轻微上消化道症状的患者，他们被转诊接受 EGD。 排除标准是在加拿大不会说英语，在日本不会说日语，在伊朗不会说波斯语的患者。

方法 将从所有参与者处获得书面同意。 临床医生出于医学原因的同意包括用于评估幽门螺杆菌状态的标准内窥镜检查和胃活检。 研究同意书包括使用名为“Oracol plus®”的特定设备收集唾液，以及在食道、胃（胃体和胃窦）和十二指肠远端进行组织刷洗。 如果患者符合这项研究的条件，研究人员将记录人口统计数据（年龄、性别、教育程度、种族、既往病史、服用药物——尤其是 PPI 和抗生素），以及进行内窥镜检查的主要原因。 患者将完成问卷；通过简式利兹消化不良问卷 (SFLDQ) 测量的上消化道症状、通过 EQ-5D 测量的生活质量以及通过医院焦虑和抑郁量表 (HADS) 测量的焦虑和抑郁。 然后是唾液收集器； Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, UK) 将用于收集唾液。 该设备旨在以类似于牙刷的方式使用。 收集唾液的方法是用海绵拭子沿着牙龈（如果有的话，在牙齿的根部）和舌背用力擦拭，直到海绵变湿，这大约需要 1 分钟。 一旦唾液被取出，它就被固定在容器中，一个微管被整合到设备中，这样唾液就被直接离心到提供的微管中。 这降低了气溶胶污染的风险。 该过程旨在记录口腔中的微生物群，以确认上消化道中的常驻微生物群。

口服硝酸盐还原酶活性（NRA）测定

考虑到侵蚀性 GERD 在日本相当罕见，这部分研究将在汉密尔顿和德黑兰进行，具体如下：

在获得知情同意后，20 名侵蚀性 GERD 患者、20 名非侵蚀性 GERD 患者参加了来自加拿大的 JUICE 和 20 名没有上消化道症状的对照。 除了 JUICE 中描述的程序之外，还为这些组执行了以下操作：

1. 如主要方案中所述，将 Oracol plus® 拭子刷过牙龈和舌背 60 秒。 它以相同的方式处理，微生物组研究以与 JUICE 协议正确描述的相同方式完成。
2. NRA 是通过连续三分钟间隔一分钟的口腔采样来测量的，如下所示：要求病例和对照禁食过夜并避免高硝酸盐食物（包括生菜、卷心菜、芹菜、芜菁、甜菜根、萝卜和大黄）至少 8 小时。 口腔 NRA 检测在早上 7:30 到 10:00 之间进行。 在测试的早晨，首先要求个体用 22 毫升去离子无菌水漱口。 然后要求他/她将 22 毫升 10 毫克硝酸盐-N/L 溶液含在口中 3 分钟。 指示受试者在开始时和 3 分钟内每 1 分钟在口中混合溶液，并且在每次混合后（即在开始时和在1 分钟间隔）。 丢弃剩余的溶液。 立即将每个样品转移到装有 56.25 微升 0.8 M NaOH（以破坏维生素 C 并进一步抑制亚硝酸盐的产生）的 Eppendorf 管中。 然后向每个管中加入 18.0 微升 1.4 M ZnSO4，振摇 2 秒并在室温下放置 30 分钟。 然后将样品在 25℃ 下以 13,000g 离心 7 分钟。 这种处理去除了可能干扰用于亚硝酸盐测量的 Griess 反应的蛋白质。 通过将 250 微升 Griess 试剂 A [0.2% (w/v) 磺胺溶于 5% (v/v) 浓 H3PO4] 添加到 1,000 微升比色皿中离心样品的 500 微升上清液中并读取吸光度来测量亚硝酸盐使用分光光度计（WPA BiowaveII，英国）在 540 nm 处测量。 这个读数被命名为“A1”。 然后，将 250 微升格里斯试剂 B [0.02% (w/v) N-(1-萘基)-乙二胺-二盐酸盐溶液] 添加到比色皿中。 然后将比色杯在室温下避光放置 10 分钟，再次在 540 nm 处读取吸光度，读数命名为“A2”。 根据通过测试已知浓度的 NaNO2 和确定的最终亚硝酸盐浓度而制定的标准曲线读取值 (A2-A1)。 500 微升去离子无菌水样本在每种情况下都像唾液样本一样进行处理，并作为质量控制的空白。 绘制 0、1、2 和 3 分钟时的亚硝酸盐值随时间变化的曲线，并计算趋势线的斜率。 该斜率表示每人每分钟形成的亚硝酸盐。 斜率乘以 22（硝酸盐溶液的体积）以计算“硝酸盐还原酶活性”，并报告为每人每分钟形成的微克亚硝酸盐-N。

释义：

出于实际目的，根据蒙特利尔峰会，GERD 在临床上被定义为每周至少发生一次麻烦的反流或胃灼热。 该定义将用于招募非糜烂性患者并在对照中排除 GERD。 它还将用于临床评估糜烂患者。 对照不仅需要无症状（根据上述定义），而且还没有明显的内镜反流迹象。

将进行食管胃十二指肠镜检查和微生物组 EGD 取样，并使用无菌护套刷收集肠道微生物群。 对于每位患者，将首先用一把刷子从中食道和下食道进行组织刷洗，然后用第二把刷子从胃（胃体和胃窦的大小曲率），用第三把刷子刷十二指肠帽和十二指肠远端。 这将在引入内窥镜时进行，并且在每种情况下，将通过轻轻刷洗适当的区域来获得收集。 刷子表面收集的材料稍后将在无菌管中重新悬浮到 RNA 中。 允许样品在室温下孵育最多 2 小时，然后冷冻并储存在 -80 °C。 日本冷冻微生物组样本将由一名研究人员运送或带到麦克马斯特基因组中心。 伊朗样本将在德黑兰进行处理，提取的 DNA 样本将转移到 McMaster 进行测序。 最后一部分，即测序 DNA 样本的分析可以在德黑兰或麦克马斯特完成。 将分别从胃窦和胃体获得两次活检，以评估幽门螺杆菌状态作为两个队列的护理标准。

微生物组分析 DNA 提取和分子谱分析将使用标准方案进行。 将使用 V3 区域的配对末端读数对 16S rRNA 基因进行细菌群落分析。 一式三份的扩增将在麦克马斯特基因组中心汇集，用于 150 或 250 nt 配对末端 Illumina 测序。 这种方法提供了 V3 区域的重叠序列读取，可用于纠正质量差的碱基调用并提高测序准确性。 使用条形码引物进行多路复用运行将为每个样本提供大约 25,000 个序列读数。 序列数据将由内部生物信息学管道处理，该管道结合了 cutadap PandaSeq、AbundantOTU+、mothur 和 QIIME 的质量过滤。 输出将包括使用 AbundantOTU+ 的操作分类单元 (OTU) 中的聚类序列和使用 Greengenes 训练集的 RDP 分类器分类器的分类分配。 微生物组分析将包括每个样本的 α 多样性指标和 β 多样性指标（加权和未加权 unifrac、Bray-Curtis、非度量多维尺度）以及使用 QIIME25 和 PhyloSeq 的其他统计分析。 微生物群的功能特性将使用未观察状态重建的群落系统发育调查 (PICRUSt) 进行推断，并使用统计方法进一步比较

样本量 研究人员计划在加拿大（麦克马斯特大学）招募 500 名新患者进行上消化道内窥镜检查，在日本（东北大学医院胃肠科）招募 500 名患者，在伊朗（德黑兰大学）招募 500 名患者。 这是基于对食道、胃和十二指肠微生物组进行评估的 20 名患者的初步数据，并假设操作分类单元的比值比为器质性疾病和健康对照（无 GI 症状的 EGD）之间的 2 倍例如，用于评估未发现异常的贫血）并假设至少有 50 名健康对照者和 50 名患有特定疾病的患者。 将需要 500 名患者，因为研究人员将分别评估胃溃疡、FD、食管炎，并且需要针对多项测试进行调整。

对于 NRA 测量，研究人员需要 GERD、NERD 和对照组中的 18 名患者。 这假设 Z-alpha 为 1.96（双侧），1-beta=0.8416， Sigma 为 0.99，平均差为 0.9310。

统计分析 基线描述性数据将被分析并报告为连续变量的平均值和标准偏差，以及分类变量的百分比和频率。 二分变量将使用卡方 (x2) 检验进行分析，并连续使用学生 t 检验（对于两组）和方差分析（对于两个以上的组），除非当研究人员将使用 Mann Whitney U 检验时，一组中的数字 < 50两个组和 Kruskal-Wallis 两个以上的组。 将使用适用于 Windows 系统的 SPSS 21.0 版（SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokyo, Japan），主要结果的差异在 <0.05 水平和次要结果的 <0.01 水平下被认为是显着的，以针对多重测试进行调整。