Japanske øvre GI-symptomer sammenlignet med iranske og kanadiske pasienter som presenterer

Mål Formålet med studien er å sammenligne øvre GI-symptomer og endoskopifunn i Canada med Japan og Iran, og korrelere dette med øvre GI-mikrobiomet.

De primære resultatene er det bakterielle mikrobiomet hos pasienter med FD sammenlignet med kontrollpasienter uten øvre GI-symptomer og en normal endoskopi. Etterforskerne vil gjøre en planlagt undergruppeanalyse i henhold til rekrutteringsland samt kjønns- og aldersbaserte undergrupper (<eller =50 år versus >50 år)

Sekundære utfall er

1. Mikrobiomet hos øsofagittpasienter sammenlignet med pasienter uten øsofagitt. For å vurdere de orale nitratreduserende bakteriene på rygg av tungen til pasienter med erosiv GERD, pasienter med ikke-erosiv GERD og sammenligne dem med de vanlige kontrollene som er registrert i JUICE-studien.
2. Mikrobiomet hos H. pylori-negativ peptisk sårsykdom (PUD)-pasienter sammenlignet med H. pylori-positive PUD-pasienter og asymptomatiske normale endoskopikontroller.
3. Mikrobiomet hos de med angstpasienter versus kontroller uten angst i FD-gruppen.
4. Mikrobiomet hos de med depresjon versus kontroller uten depresjon i FD-gruppen.
5. Mikrobiomet hos de med angstpasienter versus kontroller uten angst hos pasientene uten øvre GI-symptomer og en normal endoskopi.
6. Mikrobiomet hos de med depresjon versus kontroller uten depresjon hos pasienter uten øvre GI-symptomer og en normal endoskopi
7. Sammenligning av øvre GI-patologi (betennelse, dysplasi, malignitet) og mikrobiomet i den kanadiske versus den japanske befolkningen.

Metodikk Studiepopulasjon, inkluderings- og eksklusjonskriterier Dette er en prospektiv internasjonal kohortstudie i Canada, Japan og Iran. Undersøkerne vil rekruttere voksne pasienter (≥18 år) som gjennomgår esophagogastro-duodenoskopi (EGD) uansett årsak og samtykker i å bli registrert i studien i løpet av studieperioden. Kontrollgruppen vil være pasienter med ingen eller minimale øvre GI-symptomer som henvises for EGD. Ekskluderingskriterier vil være pasienter som ikke kan engelsk i Canada, som ikke kan japansk i Japan, og ikke kan snakke persisk i Iran.

Metoder Skriftlig samtykke vil bli innhentet fra alle deltakere. Samtykke fra kliniker av medisinske årsaker inkluderer standard endoskopi og gastriske biopsier for vurdering av H.pylori-status. Forskningssamtykket inneholder spyttinnsamling med spesifikk enhet kalt "Oracol plus®" og vevsbørsting i spiserøret, magesekken (kropp og antrum) og distal tolvfingertarm. Hvis pasienten er kvalifisert for denne studien, vil etterforskerne registrere demografi (alder, kjønn, utdanning, rase, tidligere medisinsk historie, medisinering - spesielt PPI og antibiotika), og hovedårsaken til endoskopi. Pasienter vil fylle ut spørreskjemaer; øvre GI-symptomer målt ved Short Form Leeds Dyspepsia Questionnaire (SFLDQ), livskvalitet målt ved EQ-5D, og ​​angst og depresjon målt ved The Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Deretter spyttoppsamlingsanordning; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, Storbritannia) vil bli brukt for å samle spytt. Enheten er designet for å brukes på samme måte som en tannbørste. Spytt samles opp ved å gni svampen godt langs tannkjøttet (ved bunnen av tennene hvis det finnes) samt rygg på tungen til svampen er våt, dette tar ca. 1 minutt. Når spyttet er tatt, er det sikkert inne i beholderen, et mikrorør er innlemmet i enheten slik at spyttet sentrifugeres direkte inn i mikrorøret som følger med. Dette reduserer risikoen for aerosolforurensning. Denne prosessen har som mål å dokumentere mikrobiomene i munnhulen for å bekrefte de fastboende mikrobiomene i øvre GI-kanal.

Målingen av oral nitratreduktaseaktivitet (NRA).

Tatt i betraktning at erosiv GERD er ganske sjelden i Japan, vil denne delen av studien bli utført i Hamilton og Teheran som følger:

Tjue erosive GERD-pasienter, tjue ikke-erosive GERD-pasienter registrert i JUICE fra Canada og tjue kontroller uten øvre GI-symptomer blir registrert etter informert samtykke er innhentet. I tillegg til prosedyrene beskrevet i JUICE, gjøres følgende for disse gruppene:

1. En Oracol plus® vattpinne børstes over tannkjøttet og tungeryggen i 60 sekunder som beskrevet i hovedprotokollen. Den behandles på samme måte og mikrobiomstudien gjøres på samme måte som beskrevet for JUICE-protokollen.
2. NRA måles med påfølgende munnhuleprøver med ett minutts intervaller i tre minutter som følger: tilfeller og kontrollpersoner blir bedt om å faste over natten og unngå mat med høyt nitratinnhold (inkludert salat, kål, selleri, kålrot, rødbeter, reddik og rabarbra) for minst 8 timer. Munn NRA-analyse utføres mellom 7:30 og 10:00. På morgenen for testen blir personen først bedt om å skylle munnen med 22 ml avionisert, sterilt vann. Deretter blir han/hun bedt om å holde 22 ml av en 10 mg nitrat-N/L-løsning i munnen i 3 min. Pasienten instrueres om å blande oppløsningen i munnen i begynnelsen og hvert 1. minutt i løpet av de 3 minuttene, og 1,5 ml av oppløsningen inkubert i munnen tas prøve med en steril sprøyte etter hver blanding (dvs. i begynnelsen og kl. 1 min intervaller). Resten av løsningen kastes. Hver prøve overføres umiddelbart til et Eppendorf-rør som inneholder 56,25 mikroliter 0,8 M NaOH (for å ødelegge vitamin C og toppe ytterligere nitrittproduksjon). Deretter tilsettes 18,0 mikroliter 1,4 M ZnSO4 til hvert rør, ristes i 2 s og får stå i romtemperatur i 30 minutter. Prøvene sentrifugeres deretter ved 13 000 g ved 25 ℃ i 7 minutter. Denne behandlingen fjerner proteinene som muligens kan forstyrre Griess-reaksjonen som brukes til nitrittmåling. Nitritt måles ved å tilsette 250 mikroliter Griess-reagens A [0,2 % (w/v) sulfanilamid i 5 % (v/v) konsentrert H3PO4] til 500 mikroliter av supernatanten av den sentrifugerte prøven i en 1000 mikroliter kyvette og lese absorbans ved 540 nm ved bruk av et spektrofotometer (WPA BiowaveII, UK). Denne avlesningen heter ''A1.'' Deretter tilsettes 250 mikroliter Griess-reagens B [0,02 % (vekt/volum) N-(1-naftyl)-etylendiamin-dihydrokloridløsning] til kyvetten. Kyvetten holdes deretter i mørket ved romtemperatur i 10 minutter, og absorbansen ble igjen avlest ved 540 nm og avlesningen kalt ''A2''. Verdien (A2-A1) avleses mot en standardkurve utviklet ved å teste kjente konsentrasjoner av NaNO2 og den endelige nitrittkonsentrasjonen bestemt. En prøve på 500 mikroliter av det avioniserte sterile vannet behandles nøyaktig som spyttprøven i hvert tilfelle og fungerer som blank for kvalitetskontroll. Nitrittverdier ved 0, 1, 2 og 3 min plottes mot tid og stigningen til trendlinjen beregnes. Denne skråningen representerer nitrittet som dannes per person per minutt. Helningen multipliseres med 22 (volumet av nitratløsning) for å beregne ''nitratreduktaseaktiviteten'' og rapporteres som mikrogram nitritt-N dannet per person per minutt.

Definisjoner:

For praktiske formål er GERD definert klinisk i henhold til Montreal-toppmøtet som plagsomme oppstøt eller halsbrann som forekommer minst en gang i uken. Denne definisjonen vil bli brukt til å registrere de ikke-erosive pasientene i tillegg til å ekskludere GERD i kontrollene. Den skal også brukes til å vurdere de erosive pasientene klinisk. Kontrollene trenger ikke bare å være asymptomatiske (i henhold til ovennevnte definisjon), men også å ikke ha noen grove endoskopiske tegn på refluks.

Esophagogastroduodenoskopi og prøvetaking for mikrobiomet EGD vil bli utført og en steril omhyllet børste vil bli brukt til å samle tarmmikrobiota. For hver pasient vil vevspuss først utføres fra den midtre og nedre spiserøret med en børste, deretter magen (større og mindre krumning av kropp og antrum) med en andre børste, tolvfingertarmhetten og distuell tolvfingertarm med en tredje børste. Dette vil bli utført etter hvert som endoskopet introduseres, og i hvert tilfelle vil samlingen bli oppnådd ved å forsiktig børste det aktuelle området. Materialet som samles på børsteoverflaten vil bli resuspendert til RNA senere i et sterilt rør. Prøver ble tillatt å inkubere ved romtemperatur i opptil 2 timer, deretter frosset og lagret ved -80 °C. Japanske frosne mikrobiomprøver vil sendes eller bringes til McMaster Genome Center av en av etterforskerne. De iranske prøvene vil bli behandlet i Teheran og de ekstraherte DNA-prøvene vil bli overført til McMaster for sekvensering. Den siste delen, dvs. analysen av de sekvenserte DNA-prøvene kan enten gjøres i Teheran eller på McMaster. To biopsier hver fra antrum og magekropp vil bli tatt for å vurdere H. pylori-status som standard for omsorg for begge kohorter.

Mikrobiomanalyse DNA-ekstraksjon og molekylær profilering vil bli utført ved bruk av standardprotokoller. Bakteriell fellesskapsprofilering av 16S rRNA-genet vil bli utført ved bruk av parede endeavlesninger av V3-regionen. Trippelamplifikasjoner vil bli slått sammen for 150 eller 250 nt paired-end Illumina-sekvensering i McMaster Genome Center. Denne tilnærmingen gir overlappende sekvensavlesninger av V3-regionen, som kan brukes til å korrigere baseanrop av dårlig kvalitet og øke sekvenseringsnøyaktigheten. Multipleksing av kjøringen med strekkodede primere vil gi omtrent 25 000 sekvensavlesninger per prøve. Sekvensdataene vil bli behandlet av en intern bioinformatikk-pipeline som inkluderer kvalitetsfiltrering med cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur og QIIME. Utdata vil inkludere grupperte sekvenser i operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) ved bruk av AbundantOTU+ og taksonomiske tildelinger ved bruk av RDP-klassifisereren ved bruk av Greengenes treningssett. Mikrobiomanalyse vil inkludere α-diversitetsmålinger for hver prøve og β-diversitetsmål (vektet og uvektet unifrac, Bray-Curtis, ikkemetrisk flerdimensjonal skalering) og annen statistisk analyse ved bruk av QIIME25 og PhyloSeq. Funksjonelle egenskaper til mikrobiotaen vil bli utledet ved bruk av fylogenetisk undersøkelse av samfunn ved rekonstruksjon av uobserverte stater (PICRUSt) og sammenlignes videre ved hjelp av statistisk

Prøvestørrelse Etterforskerne planlegger å rekruttere 500 nye pasienter henvist til øvre GI-endoskopi i Canada (McMaster University) og 500 i Japan (Division of Gastroenterology, Tohoku University Hospital) og 500 fra Iran (Teheran University). Dette er basert på foreløpige data fra 20 pasienter som har hatt vurdering av mikrobiomet i spiserør, magesekk og tolvfingertarmen og antar at oddsratioen for den operasjonelle taksonomiske enheten vil være 2 ganger mellom organisk sykdom og frisk kontroll (EGD uten GI-symptomer for evaluering av anemi der ingen abnormitet er funnet) og antar at det vil være minst 50 friske kontroller og 50 pasienter med en gitt sykdom. 500 pasienter vil være nødvendig ettersom etterforskerne vil evaluere magesår, FD, øsofagitt separat og vil måtte justere for flere tester.

For NRA-måling trenger etterforskerne 18 pasienter blant GERD, NERD og kontrollarm. Dette forutsetter en Z-alfa på 1,96 (tosidig), 1-beta=0,8416, Sigma på 0,99, og gjennomsnittlig forskjell på 0,9310.

Statistisk analyse Baseline beskrivende data vil bli analysert og rapportert som gjennomsnitt og standardavvik for kontinuerlige variabler, og prosent og frekvens for kategoriske variabler. Dikotome variabler vil bli analysert etter Chi squared (x2) test og kontinuerlig ved å bruke Students t test (for to grupper) og ANOVA (for mer enn to grupper) med mindre tallene er < 50 i en gruppe når etterforskerne vil bruke Mann Whitney U test for to grupper og Kruskal-Wallis for mer enn to grupper. SPSS versjon 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokyo, Japan) for Windows-systemer vil bli brukt med forskjeller som anses som signifikante på <0,05-nivået for de primære resultatene og <0,01 for de sekundære for å justere for flere tester.