일본의 상부 위장관 증상을 나타내는 이란 및 캐나다 환자와 비교

목적 시험의 목적은 캐나다의 상부 위장관 증상 및 내시경 소견을 일본 및 이란과 비교하고 이를 상부 위장관 마이크로바이옴과 연관시키는 것입니다.

1차 결과는 상부 GI 증상 및 정상적인 내시경 검사가 없는 대조군 환자와 비교한 FD 환자의 박테리아 미생물입니다. 조사관은 성별 및 연령 기반 하위 그룹(<또는 =50년 대 >50년)뿐만 아니라 모집 국가에 따라 계획된 하위 그룹 분석을 수행합니다.

이차 결과는

1. 식도염이 없는 환자와 비교한 식도염 환자의 마이크로바이옴. 미란성 GERD 환자, 비미란성 GERD 환자의 혀 뒤쪽에 있는 구강 질산염 감소 박테리아를 평가하고 이를 JUICE 연구에 등록한 정상 대조군과 비교합니다.
2. H. pylori 양성 PUD 환자 및 무증상 정상 내시경 대조군과 비교한 H. pylori 음성 소화성 궤양 질환(PUD) 환자의 마이크로바이옴.
3. 불안 환자의 마이크로바이옴 대 불안이 없는 대조군의 FD 그룹.
4. 우울증이 있는 사람과 FD 그룹의 우울증이 없는 대조군의 마이크로바이옴.
5. 불안 환자의 마이크로바이옴 대 상부 위장관 증상이 없고 정상적인 내시경 검사를 받은 환자의 불안이 없는 대조군.
6. 상부 위장관 증상이 없고 정상 내시경 검사를 받은 환자의 우울증이 없는 대조군과 우울증이 있는 사람의 마이크로바이옴
7. 상부 GI 병리학(염증, 형성이상, 악성종양)과 캐나다 대 일본 인구의 마이크로바이옴 비교.

방법 연구 모집단, 포함 및 제외 기준 이것은 캐나다, 일본 및 이란에서 전향적인 국제 코호트 연구입니다. 조사관은 어떤 이유로든 식도-위 십이지장경 검사(EGD)를 받고 연구 기간 동안 연구에 등록하는 데 동의한 성인 환자(18세 이상)를 모집합니다. 대조군은 EGD를 의뢰받은 상부 위장관 증상이 없거나 최소한인 환자입니다. 제외 기준은 캐나다에서 영어를 할 수 없는 환자, 일본에서 일본어를 할 수 없는 환자, 이란에서 페르시아어를 할 수 없는 환자입니다.

방법 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻습니다. 의학적 이유로 임상의의 동의에는 H.pylori 상태를 평가하기 위한 표준 내시경 검사 및 위 생검이 포함됩니다. 연구 동의서에는 "Oracol plus®"라는 특정 장치를 사용한 타액 수집과 식도, 위(체부 및 전정부) 및 원위 십이지장에서의 조직 칫솔질이 포함되어 있습니다. 환자가 이 연구에 적격인 경우 조사관은 인구 통계(연령, 성별, 교육, 인종, 과거 병력, 약물 복용 - 특히 PPI 및 항생제) 및 내시경 검사의 주된 이유를 기록합니다. 환자는 설문지를 작성합니다. SFLDQ(Short Form Leeds Dyspepsia Questionnaire)로 측정한 상부 GI 증상, EQ-5D로 측정한 삶의 질, HADS(The Hospital Anxiety and Depression Scale)로 측정한 불안 및 우울증. 그런 다음 타액 수집 장치; Oracol plus®(Malvern Medical Developments, Worchester, UK)가 타액 수집에 적용될 것입니다. 이 장치는 칫솔과 유사한 방식으로 사용하도록 설계되었습니다. 스펀지가 젖을 때까지 스펀지 면봉으로 잇몸(있는 경우 치아 기저부)과 혀의 배면을 단단히 문질러 침을 채취합니다. 이 작업에는 약 1분이 소요됩니다. 타액을 채취한 후에는 용기 안에 고정하고, 타액이 제공된 마이크로 튜브로 직접 원심분리되도록 마이크로튜브가 장치 내에 통합됩니다. 이것은 에어로졸 오염의 위험을 줄입니다. 이 과정은 상부 위장관에 상주하는 미생물 군집을 확인하기 위해 구강 내 미생물 군집을 문서화하는 것을 목표로 합니다.

구강 질산염 환원 효소 활성(NRA) 측정

미란성 GERD가 일본에서 다소 드물다는 점을 고려하여 연구의 이 부분은 해밀턴과 테헤란에서 다음과 같이 수행됩니다.

20명의 미란성 GERD 환자, 캐나다의 JUICE에 등록된 20명의 비미란성 GERD 환자 및 상위 GI 증상이 없는 20명의 대조군이 정보에 입각한 동의를 얻은 후 등록됩니다. JUICE에 설명된 절차 외에도 이러한 그룹에 대해 다음이 수행됩니다.

1. 주요 프로토콜에 설명된 대로 Oracol plus® 면봉으로 잇몸과 혀의 배면을 60초 동안 닦습니다. 동일한 방식으로 처리되며 마이크로바이옴 연구는 적절한 JUICE 프로토콜에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 수행됩니다.
2. NRA는 다음과 같이 3분 동안 1분 간격으로 연속 구강 샘플링으로 측정됩니다. 환자 및 대조군은 밤새 금식하고 질산염이 높은 음식(상추, 양배추, 셀러리, 순무, 비트, 무 및 대황 포함)을 피하도록 요청받습니다. 최소 8시간 구강 NRA 분석은 오전 7시 30분에서 10시 사이에 수행됩니다. 검사 당일 아침에 개인은 처음에 22ml의 탈이온 멸균수로 입을 헹구도록 요청받습니다. 그런 다음 환자에게 10mg 질산염-N/L 용액 22ml를 3분 동안 입안에 머금도록 요청합니다. 대상자는 용액을 시작할 때와 3분에 걸쳐 1분마다 혼합하도록 지시하고, 입안에서 배양된 용액 1.5ml를 각 혼합 후(즉, 처음과 1분 간격). 나머지 솔루션은 폐기됩니다. 각 샘플을 즉시 56.25마이크로리터 0.8M NaOH(비타민 C를 파괴하고 추가 아질산염 생성을 위해)가 들어 있는 Eppendorf 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 18.0마이크로리터 1.4M ZnSO4를 각 튜브에 첨가하고 2초 동안 흔들고 실온에서 30분 동안 방치합니다. 그런 다음 샘플을 25℃에서 7분 동안 13,000g에서 원심분리합니다. 이 처리는 아질산염 측정에 사용되는 Griess 반응을 방해할 수 있는 단백질을 제거합니다. 아질산염은 Griess 시약 A[5%(v/v) 농축 H3PO4의 0.2%(w/v) 술파닐아미드] 250μL를 1,000μL 큐벳에 있는 원심분리된 샘플의 상층액 500μL에 첨가하고 흡광도를 판독하여 측정됩니다. 분광 광도계(WPA BiowaveII, UK)를 사용하여 540nm에서. 이 판독값의 이름은 ''A1''입니다. 그런 다음 Griess 시약 B[0.02%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌디아민-디하이드로클로라이드 용액] 250마이크로리터를 큐벳에 추가합니다. 그런 다음 큐벳을 실온에서 10분 동안 암실에 보관하고 흡광도를 다시 540nm에서 판독하고 판독값을 ''A2''로 명명했습니다. 값(A2-A1)은 NaNO2의 알려진 농도와 결정된 최종 아질산염 농도를 테스트하여 개발된 표준 곡선에 대해 읽습니다. 500마이크로리터의 탈이온 멸균수 샘플은 각 인스턴스의 타액 샘플과 동일하게 처리되며 품질 관리를 위한 블랭크 역할을 합니다. 0, 1, 2 및 3분의 아질산염 값이 시간에 대해 플롯되고 추세선의 기울기가 계산됩니다. 이 기울기는 1인당 분당 형성되는 아질산염을 나타냅니다. 기울기에 22(질산염 용액의 부피)를 곱하여 "질산염 환원 효소 활성"을 계산하고 분당 1인당 형성된 아질산염-N 마이크로그램으로 보고합니다.

정의:

실질적인 목적을 위해 GERD는 몬트리올 정상회담에 따라 적어도 일주일에 한 번 발생하는 성가신 역류 또는 속 쓰림으로 임상적으로 정의됩니다. 이 정의는 대조군에서 GERD를 제외하고 비미란성 환자를 등록하는 데 사용될 것입니다. 그것은 또한 미란성 환자를 임상적으로 평가하는 데 사용될 것입니다. 대조군은 (위에서 언급한 정의에 따라) 무증상일 뿐만 아니라 역류의 육안적 내시경 징후가 없어야 합니다.

식도위십이지장내시경검사와 마이크로바이옴 EGD에 대한 샘플링이 수행되고 장내 미생물군을 수집하기 위해 멸균 덮개가 있는 브러시가 사용됩니다. 각각의 환자에 대해 조직 칫솔질은 먼저 한 개의 브러시로 중간 및 하부 식도에서 수행한 다음 두 번째 브러시로 위(체부 및 동공의 크고 작은 곡률), 십이지장 캡 및 원위 십이지장 브러시를 세 번째 브러시로 수행합니다. 이것은 내시경이 도입될 때 실시되며 각각의 경우에 해당 부위를 부드럽게 칫솔질하여 수집됩니다. 브러시 표면에 수집된 재료는 나중에 멸균 튜브에서 RNA로 다시 부유됩니다. 샘플을 실온에서 최대 2시간 동안 배양한 다음 냉동하여 -80°C에서 보관했습니다. 일본 냉동 마이크로바이옴 샘플은 조사자 중 한 명이 McMaster Genome Center로 배송하거나 가져올 것입니다. 이란 샘플은 테헤란에서 처리되고 추출된 DNA 샘플은 시퀀싱을 위해 McMaster로 전송됩니다. 마지막 부분, 즉 시퀀싱된 DNA 샘플의 분석은 Tehran 또는 McMaster에서 수행할 수 있습니다. 두 코호트의 치료 표준으로서 헬리코박터 파일로리 상태를 평가하기 위해 전정부와 위체로부터 각각 2개의 생검을 얻을 것입니다.

마이크로바이옴 분석 DNA 추출 및 분자 프로파일링은 표준 프로토콜을 사용하여 수행됩니다. 16S rRNA 유전자의 박테리아 커뮤니티 프로파일링은 V3 영역의 쌍방향 말단 읽기를 사용하여 수행됩니다. 3중 증폭은 McMaster Genome Center에서 150 또는 250nt 페어드 엔드 Illumina 시퀀싱을 위해 풀링됩니다. 이 접근 방식은 V3 영역의 겹치는 시퀀스 읽기를 제공하며, 이는 품질이 좋지 않은 기본 호출을 수정하고 시퀀싱 정확도를 높이는 데 사용할 수 있습니다. 바코드 프라이머로 실행을 다중화하면 샘플당 약 25,000개의 시퀀스 판독이 제공됩니다. 시퀀스 데이터는 cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur 및 QIIME와 함께 품질 필터링을 통합하는 사내 생물정보학 파이프라인에서 처리됩니다. 출력에는 AbundantOTU+를 사용하는 운영 분류 단위(OTU)의 클러스터링된 시퀀스와 Greengenes 교육 세트를 사용하는 RDP 분류기 분류기를 사용하는 분류 할당이 포함됩니다. Microbiome 분석에는 각 샘플에 대한 α-다양성 메트릭과 β-다양성 측정(가중 및 비가중 유니프랙, Bray-Curtis, 비메트릭 다차원 스케일링) 및 QIIME25 및 PhyloSeq를 사용한 기타 통계 분석이 포함됩니다. 미생물군의 기능적 특성은 PICRUSt(관측되지 않은 상태의 재구성에 의한 커뮤니티의 계통발생학적 조사)를 사용하여 추론되고 통계적 방법을 사용하여 추가로 비교됩니다.

샘플 크기 조사관은 캐나다(McMaster University)에서 상부 위장관 내시경 검사를 위해 의뢰된 500명의 신규 환자, 일본(Tohoku University Hospital의 소화기내과 분과)에서 500명, 이란(Tehran University)에서 500명을 모집할 계획입니다. 이것은 식도, 위 및 십이지장의 미생물군을 평가한 20명의 환자의 예비 데이터를 기반으로 하며 운영 분류 단위의 오즈비가 기질적 질병과 건강한 대조군(GI 증상이 없는 EGD) 사이에 2배가 될 것이라고 가정합니다. 예를 들어 이상이 발견되지 않는 빈혈의 평가를 위해) 최소 50명의 건강한 대조군과 50명의 특정 질병 환자가 있다고 가정합니다. 조사관이 위궤양, FD, 식도염을 개별적으로 평가하고 다중 테스트를 위해 조정해야 하므로 500명의 환자가 필요합니다.

NRA 측정을 위해 조사자는 GERD, NERD 및 대조군 중에서 18명의 환자가 필요합니다. 이는 Z-알파가 1.96(양측), 1-베타=0.8416, 시그마는 0.99이고 평균 차이는 0.9310입니다.

통계 분석 기본 설명 데이터는 연속 변수의 평균 및 표준 편차와 범주 변수의 백분율 및 빈도로 분석 및 보고됩니다. 조사관이 Mann Whitney U 테스트를 사용할 때 한 그룹에서 숫자가 < 50이 아닌 한 학생의 t 테스트(2개 그룹에 대해) 및 ANOVA(2개 이상의 그룹에 대해)를 사용하여 이분형 변수를 카이 제곱(x2) 테스트 및 연속으로 분석합니다. 2개 그룹 및 Kruskal-Wallis는 2개 이상의 그룹입니다. Windows 시스템용 SPSS 버전 21.0(SPSS(Japan) Co., Ltd., Tokyo, Japan)은 주요 결과에 대해 0.05 미만 수준, 2차 결과에 대해 0.01 미만으로 유의미한 차이가 있는 것으로 간주되어 다중 테스트를 조정하는 데 사용됩니다.