Síntomas GI superiores japoneses en comparación con pacientes iraníes y canadienses que presentan

Objetivo El propósito del ensayo es comparar los síntomas del GI superior y los hallazgos de la endoscopia en Canadá con Japón e Irán, y correlacionar esto con el microbioma del GI superior.

Los resultados primarios son el microbioma bacteriano en pacientes con DF en comparación con pacientes de control sin síntomas gastrointestinales superiores y una endoscopia normal. Los investigadores realizarán un análisis de subgrupos planificado según el país de reclutamiento, así como los subgrupos basados ​​en el sexo y la edad (<o =50 años versus >50 años)

Los resultados secundarios son

1. El microbioma en pacientes con esofagitis en comparación con pacientes sin esofagitis. Evaluar las bacterias reductoras de nitrato oral en el dorso de la lengua de pacientes con ERGE erosiva, pacientes con ERGE no erosiva y compararlos con los de los controles normales inscritos en el estudio JUICE.
2. El microbioma en pacientes con enfermedad de úlcera péptica (PUD) H. pylori negativos en comparación con pacientes con H. pylori PUD positivos y controles endoscópicos normales asintomáticos.
3. El microbioma en pacientes con ansiedad versus controles sin ansiedad en el grupo DF.
4. El microbioma en aquellos con depresión versus controles sin depresión en el grupo FD.
5. El microbioma en pacientes con ansiedad versus controles sin ansiedad en pacientes sin síntomas gastrointestinales superiores y una endoscopia normal.
6. El microbioma en aquellos con depresión versus controles sin depresión en pacientes sin síntomas gastrointestinales superiores y una endoscopia normal
7. Comparación de la patología GI superior (inflamación, displasia, malignidad) y el microbioma en las poblaciones canadienses versus japonesas.

Metodología Población del estudio, criterios de inclusión y exclusión Este es un estudio de cohorte internacional prospectivo en Canadá, Japón e Irán. Los investigadores reclutarán pacientes adultos (≥18 años de edad) que se sometan a duodenoscopia esófago-gastro (EGD) por cualquier motivo y que den su consentimiento para participar en el estudio durante el período del estudio. El grupo de control estará formado por pacientes sin síntomas o con síntomas mínimos del tracto gastrointestinal superior que son remitidos para EGD. Los criterios de exclusión serán los pacientes que no puedan hablar inglés en Canadá, que no puedan hablar japonés en Japón y que no puedan hablar persa en Irán.

Métodos Se obtendrá el consentimiento por escrito de todos los participantes. El consentimiento del médico por razones médicas incluye endoscopia estándar y biopsias gástricas para evaluar el estado de H. pylori. El consentimiento de investigación contiene recolección de saliva con dispositivo específico llamado "Oracol plus®" y cepillado de tejidos en el esófago, estómago (cuerpo y antro) y duodeno distal. Si el paciente es elegible para este estudio, los investigadores registrarán los datos demográficos (edad, sexo, educación, raza, antecedentes médicos, toma de medicamentos, especialmente IBP y antibióticos) y el motivo principal de la endoscopia. Los pacientes completarán cuestionarios; síntomas gastrointestinales superiores medidos por el Cuestionario de dispepsia de Leeds de formato corto (SFLDQ), calidad de vida medida por EQ-5D y ansiedad y depresión medidas por la Escala de ansiedad y depresión del hospital (HADS). Luego dispositivo de recolección de saliva; Se aplicará Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, Reino Unido) para recolectar saliva. El dispositivo está diseñado para ser utilizado de forma similar a un cepillo de dientes. La saliva se recolecta frotando el hisopo de esponja firmemente a lo largo de la encía (en la base de los dientes, si está presente), así como el dorso de la lengua hasta que la esponja esté húmeda, esto toma alrededor de 1 minuto. Una vez que se ha tomado la saliva, se asegura dentro del recipiente, se incorpora un microtubo dentro del dispositivo para que la saliva se centrifugue directamente en el microtubo proporcionado. Esto reduce el riesgo de contaminación por aerosoles. Este proceso tiene como objetivo documentar los microbiomas en la cavidad oral para confirmar los microbiomas residentes en el tracto GI superior.

Medición de la actividad de la nitrato reductasa oral (NRA)

Teniendo en cuenta que la ERGE erosiva es poco frecuente en Japón, esta parte del estudio se realizará en Hamilton y Teherán de la siguiente manera:

Veinte pacientes con ERGE erosiva, veinte pacientes con ERGE no erosiva inscritos en JUICE de Canadá y veinte controles sin síntomas gastrointestinales superiores se inscriben después de obtener el consentimiento informado. Además de los procedimientos descritos en JUGO, se hace lo siguiente para estos grupos:

1. Se pasa un hisopo de Oracol plus® sobre las encías y el dorso de la lengua durante 60 segundos como se describe en el protocolo principal. Se procesa de la misma manera y el estudio del microbioma se realiza de la misma manera descrita para el protocolo JUICE propiamente dicho.
2. La NRA se mide con muestras consecutivas de la cavidad oral en intervalos de un minuto durante tres minutos de la siguiente manera: se pide a los casos y controles que ayunen durante la noche y eviten los alimentos con alto contenido de nitratos (como lechuga, repollo, apio, nabo, remolacha, rábano y ruibarbo) para al menos 8 h. El ensayo NRA bucal se realiza entre las 7:30 y las 10:00 a. m. En la mañana de la prueba, se le pide inicialmente al individuo que se enjuague la boca con 22 ml de agua estéril desionizada. Luego se le pide que mantenga en la boca 22 ml de una solución de nitrato-N/L de 10 mg durante 3 min. Se instruye al sujeto para que mezcle la solución en la boca al principio y cada 1 min durante los 3 min, y se toma una muestra de 1,5 ml de la solución incubada en la boca con una jeringa estéril después de cada mezcla (es decir, al principio y al final). intervalos de 1 minuto). El resto de la solución se descarta. Cada muestra se transfiere inmediatamente a un tubo Eppendorf que contiene 56,25 microlitros de NaOH 0,8 M (para destruir la vitamina C y aumentar la producción de nitrito). Luego se agregan 18,0 microlitros de ZnSO4 1,4 M a cada tubo, se agitan durante 2 s y se dejan a temperatura ambiente durante 30 min. Luego, las muestras se centrifugan a 13 000 g a 25 ℃ durante 7 min. Este tratamiento elimina las proteínas que podrían interferir con la reacción de Griess utilizada para la medición de nitritos. El nitrito se mide añadiendo 250 microlitros del reactivo A de Griess [sulfanilamida al 0,2 % (p/v) en H3PO4 concentrado al 5 % (v/v)] a 500 microlitros del sobrenadante de la muestra centrifugada en una cubeta de 1000 microlitros y leyendo la absorbancia. a 540 nm utilizando un espectrofotómetro (WPA BiowaveII, Reino Unido). Esta lectura se denomina ''A1''. A continuación, se añaden a la cubeta 250 microlitros de reactivo B de Griess [solución de diclorhidrato de N-(1-naftil)-etilendiamina al 0,02% (p/v)]. A continuación, la cubeta se mantiene en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min y se vuelve a leer la absorbancia a 540 nm y la lectura se denomina "A2". El valor (A2-A1) se lee contra una curva estándar desarrollada al probar concentraciones conocidas de NaNO2 y se determina la concentración final de nitrito. Una muestra de 500 microlitros de agua estéril desionizada se trata exactamente igual que la muestra de saliva en cada caso y sirve como blanco para el control de calidad. Los valores de nitrito a los 0, 1, 2 y 3 minutos se representan frente al tiempo y se calcula la pendiente de la línea de tendencia. Esta pendiente representa el nitrito formado por persona por minuto. La pendiente se multiplica por 22 (el volumen de la solución de nitrato) para calcular la "actividad de la nitrato reductasa" y se informa como microgramos de nitrito-N formado por persona por minuto.

Definiciones:

A efectos prácticos, la ERGE se define clínicamente según la cumbre de Montreal como una regurgitación o acidez estomacal molesta que se produce al menos una vez por semana. Esta definición se utilizará para inscribir a los pacientes no erosivos, así como para excluir la ERGE en los controles. También se utilizará para evaluar clínicamente a los pacientes erosivos. Los controles no solo deben ser asintomáticos (según la definición mencionada anteriormente), sino también que no presenten signos endoscópicos macroscópicos de reflujo.

Se realizará una esofagogastroduodenoscopia y toma de muestras para el microbioma EGD y se utilizará un cepillo con funda estéril para recoger la microbiota intestinal. Para cada paciente, el cepillado de tejido se realizará primero desde el esófago medio e inferior con un cepillo, luego el estómago (curvatura mayor y menor del cuerpo y el antro) con un segundo cepillo, la tapa duodenal y el duodeno distal con un tercer cepillo. Esto se realizará a medida que se introduce el endoscopio y en cada caso la colección se obtendrá cepillando suavemente la zona adecuada. El material recogido en la superficie del cepillo se volverá a suspender en ARN más tarde en un tubo estéril. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante un máximo de 2 horas, luego se congelaron y almacenaron a -80 °C. Las muestras japonesas de microbiomas congelados serán enviadas o llevadas al McMaster Genome Center por uno de los investigadores. Las muestras iraníes se procesarán en Teherán y las muestras de ADN extraídas se transferirán a McMaster para su secuenciación. La última parte, es decir, el análisis de las muestras de ADN secuenciadas puede realizarse en Teherán o en McMaster. Se obtendrán dos biopsias del antro y del cuerpo del estómago para evaluar el estado de H. pylori como tratamiento estándar de ambas cohortes.

El análisis del microbioma, la extracción de ADN y el perfil molecular se llevarán a cabo utilizando protocolos estándar. El perfil de la comunidad bacteriana del gen 16S rRNA se llevará a cabo utilizando lecturas de extremos emparejados de la región V3. Las amplificaciones por triplicado se agruparán para la secuenciación de Illumina de extremo emparejado de 150 o 250 nt en el McMaster Genome Center. Este enfoque proporciona lecturas de secuencia superpuestas de la región V3, que se pueden usar para corregir llamadas de base de baja calidad y aumentar la precisión de la secuencia. La multiplexación de la serie con cebadores con código de barras proporcionará aproximadamente 25 000 lecturas de secuencia por muestra. Los datos de secuencia serán procesados ​​por una canalización de bioinformática interna que incorpora filtrado de calidad con cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur y QIIME. La salida incluirá secuencias agrupadas en unidades taxonómicas operativas (OTU) usando AbundantOTU+ y asignaciones taxonómicas usando el clasificador clasificador RDP usando el conjunto de entrenamiento Greengenes. El análisis del microbioma incluirá métricas de diversidad α para cada muestra y medidas de diversidad β (unifrac ponderado y no ponderado, Bray-Curtis, escalamiento multidimensional no métrico) y otros análisis estadísticos utilizando QIIME25 y PhyloSeq. Las propiedades funcionales de la microbiota se deducirán mediante la Investigación filogenética de comunidades mediante la reconstrucción de estados no observados (PICRUSt) y se compararán posteriormente mediante Estadísticas.

Tamaño de la muestra Los investigadores planean reclutar 500 nuevos pacientes remitidos para endoscopia digestiva alta en Canadá (Universidad McMaster) y 500 en Japón (División de Gastroenterología, Hospital Universitario de Tohoku) y 500 de Irán (Universidad de Teherán). Esto se basa en datos preliminares de 20 pacientes a los que se les evaluó el microbioma en el esófago, el estómago y el duodeno y supone que la razón de posibilidades para la unidad taxonómica operativa será de 2 veces entre la enfermedad orgánica y el control sano (EGD sin síntomas gastrointestinales). por ejemplo, para la evaluación de la anemia donde no se encuentra ninguna anomalía) y supone que habrá al menos 50 controles sanos y 50 pacientes con una determinada enfermedad. Se necesitarán 500 pacientes ya que los investigadores evaluarán la úlcera gástrica, la DF y la esofagitis por separado y deberán ajustarse para múltiples pruebas.

Para la medición de NRA, los investigadores necesitan 18 pacientes entre GERD, NERD y el brazo de control. Esto supone un Z-alfa de 1,96 (bilateral), 1-beta=0,8416, Sigma de 0,99 y diferencia de medias de 0,9310.

Análisis estadístico Los datos descriptivos de línea de base se analizarán y reportarán como medias y desviaciones estándar para las variables continuas, y porcentaje y frecuencia para las variables categóricas. Las variables dicotómicas se analizarán mediante la prueba Chi cuadrado (x2) y continuas mediante la prueba t de Student (para dos grupos) y ANOVA (para más de dos grupos) a menos que los números sean < 50 en un grupo cuando los investigadores utilizarán la prueba U de Mann Whitney para dos grupos y Kruskal-Wallis para más de dos grupos. Se utilizará SPSS versión 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokio, Japón) para sistemas Windows con diferencias consideradas significativas en el nivel <0,05 para los resultados primarios y <0,01 para el secundario para ajustar las pruebas múltiples.