Japońskie objawy górnego odcinka przewodu pokarmowego w porównaniu z pacjentami z Iranu i Kanady

Cel Celem badania jest porównanie objawów górnego odcinka przewodu pokarmowego i wyników endoskopii w Kanadzie, Japonii i Iranie oraz skorelowanie tego z mikrobiomem górnego odcinka przewodu pokarmowego.

Głównymi wynikami jest mikrobiom bakteryjny u pacjentów z FD w porównaniu z pacjentami kontrolnymi bez objawów z górnego odcinka przewodu pokarmowego i normalną endoskopią. Badacze przeprowadzą zaplanowaną analizę podgrup zgodnie z krajem rekrutacji, a także podgrupami opartymi na płci i wieku (<lub =50 lat w porównaniu z >50 lat)

Wyniki drugorzędne są

1. Mikrobiom pacjentów z zapaleniem przełyku w porównaniu z pacjentami bez zapalenia przełyku. Ocena bakterii redukujących azotany w jamie ustnej na grzbiecie języka pacjentów z nadżerkowym GERD, pacjentów z nienadżerkowym GERD i porównanie ich z tymi z normalnej grupy kontrolnej włączonej do badania JUICE.
2. Mikrobiom u pacjentów z chorobą wrzodową (PUD) z ujemnym wynikiem H. pylori w porównaniu z pacjentami z PUD z dodatnim wynikiem H. pylori i bezobjawowymi normalnymi kontrolami endoskopowymi.
3. Mikrobiom u pacjentów z lękiem w porównaniu z grupą kontrolną bez lęku w grupie FD.
4. Mikrobiom osób z depresją w porównaniu z grupą kontrolną bez depresji w grupie FD.
5. Mikrobiom u pacjentów z lękiem w porównaniu z grupą kontrolną bez lęku u pacjentów bez objawów z górnego odcinka przewodu pokarmowego i normalnej endoskopii.
6. Mikrobiom u osób z depresją w porównaniu z grupą kontrolną bez depresji u pacjentów bez objawów z górnego odcinka przewodu pokarmowego i z prawidłową endoskopią
7. Porównanie patologii górnego odcinka przewodu pokarmowego (zapalenie, dysplazja, nowotwór złośliwy) i mikrobiomu w populacjach kanadyjskich i japońskich.

Metodologia Badanie populacji, kryteria włączenia i wyłączenia Jest to prospektywne międzynarodowe badanie kohortowe w Kanadzie, Japonii i Iranie. Badacze będą rekrutować dorosłych pacjentów (w wieku ≥18 lat), którzy z dowolnego powodu przechodzą duodenoskopię przełykowo-żołądkową (EGD) i wyrażają zgodę na włączenie do badania w okresie badania. Grupą kontrolną będą pacjenci bez objawów lub z minimalnymi objawami z górnego odcinka przewodu pokarmowego, którzy zostaną skierowani na EGD. Kryteriami wykluczającymi będą pacjenci, którzy nie mówią po angielsku w Kanadzie, którzy nie mówią po japońsku w Japonii i nie mówią po persku w Iranie.

Metody Pisemna zgoda zostanie uzyskana od wszystkich uczestników. Zgoda lekarza ze względów medycznych obejmuje standardową endoskopię i biopsję żołądka w celu oceny statusu H. pylori. Zgoda na badanie obejmuje pobieranie śliny specjalnym aparatem „Oracol plus®” oraz szczotkowanie tkanek przełyku, żołądka (trzon i antrum) oraz dystalnej części dwunastnicy. Jeśli pacjent kwalifikuje się do tego badania, badacze rejestrują dane demograficzne (wiek, płeć, wykształcenie, rasę, historię medyczną, przyjmowane leki – zwłaszcza PPI i antybiotyki) oraz główny powód endoskopii. Pacjenci będą wypełniać kwestionariusze; objawy górnego odcinka przewodu pokarmowego mierzone za pomocą kwestionariusza Short Form Leeds Dyspepsia Questionnaire (SFLDQ), jakość życia mierzona za pomocą EQ-5D oraz niepokój i depresja mierzone za pomocą The Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Następnie urządzenie do pobierania śliny; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, Wielka Brytania) zostanie zastosowany do pobrania śliny. Urządzenie jest przeznaczone do używania w sposób podobny do szczoteczki do zębów. Ślina jest pobierana poprzez mocne pocieranie gąbki wacikiem wzdłuż dziąsła (u nasady zębów, jeśli występuje) oraz grzbietu języka, aż gąbka będzie mokra, co zajmuje około 1 minuty. Po pobraniu śliny jest ona zabezpieczona w pojemniku, mikroprobówka jest wbudowana w urządzenie, dzięki czemu ślina jest odwirowywana bezpośrednio do dostarczonej mikroprobówki. Zmniejsza to ryzyko zanieczyszczenia aerozolem. Proces ten ma na celu udokumentowanie mikrobiomu w jamie ustnej w celu potwierdzenia mikrobiomu rezydującego w górnym odcinku przewodu pokarmowego.

Doustny pomiar aktywności reduktazy azotanowej (NRA).

Biorąc pod uwagę, że erozyjny GERD występuje raczej rzadko w Japonii, ta część badania zostanie przeprowadzona w Hamilton i Teheranie w następujący sposób:

Dwudziestu pacjentów z GERD z erozją, dwudziestu pacjentów z GERD bez nadżerek włączonych do JUICE z Kanady i dwudziestu osób z grupy kontrolnej bez objawów górnego odcinka przewodu pokarmowego zostało włączonych po uzyskaniu świadomej zgody. Oprócz procedur opisanych w JUICE, dla tych grup wykonywane są następujące czynności:

1. Wacikiem Oracol plus® szczotkuje się dziąsła i grzbiet języka przez 60 sekund, jak opisano w głównym protokole. Jest przetwarzany w ten sam sposób, a badanie mikrobiomu odbywa się w ten sam sposób, jak opisano dla właściwego protokołu JUICE.
2. NRA mierzy się za pomocą kolejnych próbek jamy ustnej w odstępach jednominutowych przez trzy minuty w następujący sposób: przypadki i kontrole proszone są o poszczenie przez noc i unikanie pokarmów o wysokiej zawartości azotanów (w tym sałaty, kapusty, selera, rzepy, buraków, rzodkiewki i rabarbaru) przez co najmniej 8 godz. Badanie jamy ustnej NRA przeprowadza się między 7:30 a 10:00. Rano w dniu testu pacjent jest proszony o wypłukanie ust 22 ml dejonizowanej, sterylnej wody. Następnie proszony jest o trzymanie w ustach 22 ml 10 mg azotanu-N/L przez 3 min. Pacjent jest instruowany, aby mieszać roztwór w ustach na początku i co 1 minutę przez 3 minuty, a po każdym mieszaniu (tj. interwały 1-minutowe). Resztę roztworu odrzuca się. Każdą próbkę natychmiast przenosi się do probówki Eppendorfa zawierającej 56,25 mikrolitrów 0,8 M NaOH (w celu zniszczenia witaminy C i powstrzymania dalszej produkcji azotynów). Następnie do każdej probówki dodaje się 18,0 mikrolitrów 1,4 M ZnSO4, wytrząsa przez 2 s i pozostawia w temperaturze pokojowej na 30 min. Próbki są następnie wirowane przy 13 000 g w 25 ℃ przez 7 min. Ta obróbka usuwa białka, które mogłyby zakłócać reakcję Griessa stosowaną do pomiaru azotynów. Azotyn mierzy się dodając 250 mikrolitrów odczynnika Griessa A [0,2% (wag./obj.) sulfanilamidu w 5% (obj./obj.) stężonego H3PO4] do 500 mikrolitrów supernatantu odwirowanej próbki w kuwecie o pojemności 1000 mikrolitrów i odczyt absorbancji przy 540 nm przy użyciu spektrofotometru (WPA BiowaveII, Wielka Brytania). Odczyt ten nosi nazwę „A1”. Następnie do kuwety dodaje się 250 mikrolitrów odczynnika Griessa B [0,02% (wag./obj.) roztworu dichlorowodorku N-(1-naftylo)etylenodiaminy]. Kuwetę następnie trzyma się w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut i ponownie odczytuje absorbancję przy 540 nm, a odczyt określa się jako „A2”. Wartość (A2-A1) odczytuje się na podstawie krzywej wzorcowej opracowanej przez testowanie znanych stężeń NaNO2 i określa się końcowe stężenie azotynów. 500-mikrolitrową próbkę dejonizowanej sterylnej wody traktuje się dokładnie tak samo jak próbkę śliny w każdym przypadku i służy jako ślepa próba do kontroli jakości. Wartości azotynów w 0, 1, 2 i 3 min są wykreślane w funkcji czasu i obliczane jest nachylenie linii trendu. To nachylenie przedstawia azotyny utworzone na osobę na minutę. Nachylenie mnoży się przez 22 (objętość roztworu azotanów) w celu obliczenia „aktywności reduktazy azotanowej” i podaje jako mikrogram azotynu-N utworzonego na osobę na minutę.

definicje:

Ze względów praktycznych GERD definiuje się klinicznie zgodnie ze szczytem w Montrealu jako uciążliwą regurgitację lub zgagę występującą co najmniej raz w tygodniu. Ta definicja będzie używana do włączania pacjentów bez nadżerek, jak również do wykluczania GERD z grupy kontrolnej. Zostanie również wykorzystany do oceny klinicznej pacjentów z erozją. Kontrole muszą być nie tylko bezobjawowe (zgodnie z powyższą definicją), ale także nie mogą wykazywać dużych endoskopowych objawów refluksu.

Przeprowadzona zostanie ezofagogastroduodenoskopia i pobranie próbek do badania EGD mikrobiomu, a do zebrania mikroflory jelitowej zostanie użyta sterylna szczoteczka w osłonie. U każdego pacjenta zostanie wykonane szczotkowanie tkanek w pierwszej kolejności jedną szczoteczką od środkowego i dolnego przełyku, następnie drugą szczoteczką żołądek (krzywizna większa i mniejsza ciała oraz antrum), trzecią szczoteczką czapeczka dwunastnicy i dalszy odcinek dwunastnicy. Zostanie to przeprowadzone podczas wprowadzania endoskopu iw każdym przypadku pobranie zostanie uzyskane poprzez delikatne wyszczotkowanie odpowiedniego obszaru. Materiał zebrany na powierzchni szczoteczki zostanie później ponownie zawieszony w RNA w sterylnej probówce. Próbki pozostawiono do inkubacji w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 2 godziny, następnie zamrożono i przechowywano w temperaturze -80°C. Japońskie zamrożone próbki mikrobiomu zostaną wysłane lub przywiezione do McMaster Genome Center przez jednego z badaczy. Irańskie próbki zostaną przetworzone w Teheranie, a wyekstrahowane próbki DNA zostaną przesłane do McMaster w celu sekwencjonowania. Ostatnia część, tj. analiza zsekwencjonowanych próbek DNA, może zostać przeprowadzona w Teheranie lub w McMaster. Pobrane zostaną dwie biopsje z antrum i trzonu żołądka w celu oceny statusu H. pylori jako standardu opieki dla obu kohort.

Analiza mikrobiomu Ekstrakcja DNA i profilowanie molekularne zostaną przeprowadzone przy użyciu standardowych protokołów. Profilowanie społeczności bakteryjnej genu 16S rRNA zostanie przeprowadzone przy użyciu sparowanych odczytów końcowych regionu V3. Potrójne amplifikacje zostaną połączone w celu sekwencjonowania Illumina ze sparowanymi końcami 150 lub 250 nt w McMaster Genome Center. To podejście zapewnia nakładające się odczyty sekwencji regionu V3, które można wykorzystać do korygowania wywołań bazowych niskiej jakości i zwiększania dokładności sekwencjonowania. Multipleksowanie serii ze starterami z kodem kreskowym zapewni około 25 000 odczytów sekwencji na próbkę. Dane sekwencyjne będą przetwarzane przez wewnętrzny rurociąg bioinformatyczny, który obejmuje filtrowanie jakości za pomocą cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur i QIIME. Dane wyjściowe będą obejmować zgrupowane sekwencje w operacyjnych jednostkach taksonomicznych (OTU) przy użyciu AbundantOTU+ i przypisań taksonomicznych przy użyciu klasyfikatora klasyfikatora RDP przy użyciu zestawu szkoleniowego Greengenes. Analiza mikrobiomu będzie obejmować metryki różnorodności α dla każdej próbki i miary różnorodności β (ważone i nieważone unifrac, Bray-Curtis, niemetryczne skalowanie wielowymiarowe) oraz inne analizy statystyczne z wykorzystaniem QIIME25 i PhyloSeq. Funkcjonalne właściwości mikrobiomu zostaną wywnioskowane za pomocą badania filogenetycznego społeczności przez rekonstrukcję nieobserwowanych stanów (PICRUSt), a następnie porównane za pomocą analizy statystycznej

Wielkość próby Badacze planują rekrutację 500 nowych pacjentów skierowanych na endoskopię górnego odcinka przewodu pokarmowego w Kanadzie (McMaster University) i 500 w Japonii (Oddział Gastroenterologii Szpitala Uniwersyteckiego Tohoku) i 500 z Iranu (Uniwersytet w Teheranie). Opiera się to na wstępnych danych od 20 pacjentów, u których oceniono mikrobiom przełyku, żołądka i dwunastnicy i zakłada się, że iloraz szans dla operacyjnej jednostki taksonomicznej będzie 2-krotnie między chorobą organiczną a zdrową grupą kontrolną (EGD bez objawów żołądkowo-jelitowych) np. do oceny niedokrwistości, w której nie stwierdzono nieprawidłowości) i zakłada, że ​​będzie co najmniej 50 zdrowych osób kontrolnych i 50 pacjentów z daną chorobą. Potrzebnych będzie 500 pacjentów, ponieważ badacze będą osobno oceniać wrzód żołądka, FD, zapalenie przełyku i będą musieli dostosować się do wielu testów.

Do pomiaru NRA badacze potrzebują 18 pacjentów z grupy GERD, NERD i grupy kontrolnej. Zakłada to Z-alfa 1,96 (dwustronne), 1-beta=0,8416, Sigma 0,99, a średnia różnica 0,9310.

Analiza statystyczna Podstawowe dane opisowe zostaną przeanalizowane i przedstawione jako średnie i odchylenia standardowe dla zmiennych ciągłych oraz procent i częstość dla zmiennych kategorycznych. Zmienne dychotomiczne będą analizowane za pomocą testu chi-kwadrat (x2) i ciągłego za pomocą testu t-Studenta (dla dwóch grup) i ANOVA (dla więcej niż dwóch grup), chyba że liczby są < 50 w grupie, kiedy badacze użyją testu U Manna Whitneya dla dwie grupy i Kruskala-Wallisa dla więcej niż dwóch grup. SPSS w wersji 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokio, Japonia) dla systemów Windows będzie używany z różnicami uznanymi za istotne na poziomie <0,05 dla głównych wyników i <0,01 dla drugorzędnych w celu dostosowania do wielu testów.