Japanske øvre GI-symptomer sammenlignet med iranske og canadiske patienter, der præsenterer

Formål Formålet med forsøget er at sammenligne øvre GI-symptomer og endoskopi-fund i Canada med Japan og Iran og korrelere dette med det øvre GI-mikrobiom.

De primære resultater er det bakterielle mikrobiom hos patienter med FD sammenlignet med kontrolpatienter uden øvre GI-symptomer og en normal endoskopi. Efterforskerne vil lave en planlagt undergruppeanalyse i henhold til rekrutteringsland samt køns- og aldersbaserede undergrupper (<eller =50 år versus >50 år)

Sekundære resultater er

1. Mikrobiomet hos øsofagitispatienter sammenlignet med patienter uden øsofagitis. At vurdere de orale nitratreducerende bakterier på rygsiden af ​​tungen hos erosive GERD-patienter, patienter med ikke-erosiv GERD og sammenligne dem med de normale kontroller, der er inkluderet i JUICE-undersøgelsen.
2. Mikrobiomet hos H. pylori-patienter med negativ mavesår (PUD) sammenlignet med H. pylori-positive PUD-patienter og asymptomatiske normale endoskopikontroller.
3. Mikrobiomet hos dem med angstpatienter versus kontroller uden angst i FD-gruppen.
4. Mikrobiomet hos dem med depression versus kontroller uden depression i FD-gruppen.
5. Mikrobiomet hos dem med angstpatienter versus kontroller uden angst hos patienter uden øvre GI-symptomer og en normal endoskopi.
6. Mikrobiomet hos dem med depression versus kontroller uden depression hos patienter uden øvre GI-symptomer og en normal endoskopi
7. Sammenligning af øvre GI-patologi (inflammation, dysplasi, malignitet) og mikrobiomet i den canadiske versus den japanske befolkning.

Metode Studiepopulation, inklusions- og eksklusionskriterier Dette er et prospektivt internationalt kohortestudie i Canada, Japan og Iran. Undersøgerne vil rekruttere voksne patienter (≥18 år), som gennemgår esophagogastro-duodenoskopi (EGD) af en hvilken som helst grund og giver samtykke til at blive optaget i undersøgelsen i løbet af undersøgelsesperioden. Kontrolgruppen vil være patienter med ingen eller minimale øvre GI-symptomer, som henvises til EGD. Udelukkelseskriterier vil være de patienter, der ikke kan tale engelsk i Canada, som ikke kan tale japansk i Japan og ikke kan tale persisk i Iran.

Metoder Der vil blive indhentet skriftligt samtykke fra alle deltagere. Lægens samtykke af medicinske årsager omfatter standardendoskopi og gastriske biopsier til vurdering af H.pylori-status. Forskningstilladelsen indeholder spytopsamling med en specifik enhed kaldet "Oracol plus®" og vævsbørstning ved spiserøret, maven (krop og antrum) og distal tolvfingertarm. Hvis patienten er kvalificeret til denne undersøgelse, vil efterforskerne registrere demografi (alder, køn, uddannelse, race, tidligere sygehistorie, medicinindtagelse - især PPI'er og antibiotika) og hovedårsagen til endoskopi. Patienterne vil udfylde spørgeskemaer; øvre GI-symptomer målt ved Short Form Leeds Dyspepsia Questionnaire (SFLDQ), livskvalitet målt ved EQ-5D, og ​​angst og depression målt ved Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Derefter spytopsamlingsanordning; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, Storbritannien) vil blive anvendt til at opsamle spyt. Enheden er designet til at blive brugt på samme måde som en tandbørste. Spyt opsamles ved at gnide svampens vatpind fast langs tandkødet (ved bunden af ​​tænderne, hvis det er til stede) samt rygsiden af ​​tungen, indtil svampen er våd, dette tager ca. 1 minut. Når spyttet er blevet taget, er det sikkert i beholderen, et mikrorør er inkorporeret i enheden, så spyttet centrifugeres direkte ind i det medfølgende mikrorør. Dette reducerer risikoen for aerosolforurening. Denne proces har til formål at dokumentere mikrobiomer i mundhulen for at bekræfte de residente mikrobiomer i den øvre GI-kanal.

Målingen af ​​oral nitratreduktaseaktivitet (NRA).

I betragtning af at erosiv GERD er ret sjælden i Japan, vil denne del af undersøgelsen blive udført i Hamilton og Teheran som følger:

Tyve erosive GERD-patienter, tyve ikke-erosive GERD-patienter tilmeldt JUICE fra Canada og tyve kontroller uden øvre GI-symptomer tilmeldes efter informeret samtykke er opnået. Ud over de procedurer, der er beskrevet i JUICE, udføres følgende for disse grupper:

1. En Oracol plus® vatpind børstes over tandkødet og tungeryggen i 60 sekunder som beskrevet i hovedprotokollen. Det behandles på samme måde, og mikrobiomundersøgelsen udføres på samme måde, som beskrevet for JUICE-protokollen.
2. NRA måles med på hinanden følgende mundhuleprøver med ét minuts intervaller i tre minutter som følger: Tilfælde og kontroller bedes faste natten over og undgå fødevarer med højt nitratindhold (inklusive salat, kål, selleri, majroer, rødbeder, radise og rabarber) for mindst 8 timer. Mund NRA-assay udføres mellem 7:30 og 10:00. Om morgenen for testen bliver individet først bedt om at skylle sin mund med 22 ml deioniseret, sterilt vand. Derefter bliver han/hun bedt om at holde 22 ml af en 10 mg nitrat-N/L opløsning i munden i 3 min. Individet instrueres i at blande opløsningen i munden i begyndelsen og hvert 1. minut i løbet af de 3 minutter, og 1,5 ml af opløsningen inkuberet i munden udtages med en steril sprøjte efter hver blanding (dvs. i begyndelsen og kl. 1 min intervaller). Resten af ​​opløsningen kasseres. Hver prøve overføres straks til et Eppendorf-rør indeholdende 56,25 mikroliter 0,8 M NaOH (for at ødelægge C-vitamin og øge yderligere nitritproduktion). Derefter tilsættes 18,0 mikroliter 1,4 M ZnSO4 til hvert rør, rystes i 2 s og efterlades ved stuetemperatur i 30 min. Prøverne centrifugeres derefter ved 13.000 g ved 25 ℃ i 7 min. Denne behandling fjerner de proteiner, som muligvis kunne forstyrre Griess-reaktionen, der bruges til nitritmåling. Nitrit måles ved at tilsætte 250 mikroliter Griess-reagens A [0,2% (vægt/volumen) sulfanilamid i 5% (v/v) koncentreret H3PO4] til 500 mikroliter af supernatanten af ​​den centrifugerede prøve i en 1.000 mikroliter kuvette og aflæse absorbans ved 540 nm under anvendelse af et spektrofotometer (WPA BiowaveII, UK). Denne læsning er navngivet ''A1.'' Derefter tilsættes 250 mikroliter Griess-reagens B [0,02 % (vægt/volumen) N-(1-naphtyl)-ethylendiamin-dihydrochloridopløsning] til kuvetten. Kuvetten holdes derefter i mørke ved stuetemperatur i 10 minutter, og absorbansen blev igen aflæst ved 540 nm og aflæsningen benævnt ''A2''. Værdien (A2-A1) aflæses mod en standardkurve udviklet ved at teste kendte koncentrationer af NaNO2 og den endelige nitritkoncentration bestemt. En prøve på 500 mikroliter af det deioniserede sterile vand behandles nøjagtigt som spytprøven i hvert tilfælde og tjener som blindprøve til kvalitetskontrol. Nitritværdier ved 0, 1, 2 og 3 min. plottes mod tid, og hældningen af ​​trendlinjen beregnes. Denne hældning repræsenterer nitrit dannet per person per minut. Hældningen ganges med 22 (volumenet af nitratopløsning) for at beregne ''nitratreduktaseaktiviteten'' og rapporteres som mikrogram nitrit-N dannet pr. person pr. minut.

Definitioner:

Til praktiske formål defineres GERD klinisk ifølge Montreal-topmødet som generende opstød eller halsbrand, der forekommer mindst en gang om ugen. Denne definition vil blive brugt til at indskrive de ikke-erosive patienter samt udelukke GERD i kontroller. Det vil også blive brugt til at vurdere de erosive patienter klinisk. Kontrollerne skal ikke kun være asymptomatiske (i henhold til ovennævnte definition), men også at have ingen grove endoskopiske tegn på refluks.

Esophagogastroduodenoskopi og prøveudtagning for mikrobiomet EGD vil blive udført, og en steril beklædt børste vil blive brugt til at indsamle tarmmikrobiota. For hver patient udføres vævsbørstning først fra den midterste og nedre spiserør med én børste, derefter maven (større og mindre krumning af krop og antrum) med en anden børste, tolvfingertarmens hætte og distual duodenum med en tredje børste. Dette vil blive udført, efterhånden som endoskopet introduceres, og i hvert tilfælde vil samlingen blive opnået ved forsigtigt at børste det passende område. Materialet opsamlet på børstens overflade vil blive resuspenderet til RNA senere i et sterilt rør. Prøver fik lov til at inkubere ved stuetemperatur i op til 2 timer, derefter frosset og opbevaret ved -80 °C. Japanske frosne mikrobiomprøver sendes eller bringes til McMaster Genome Center af en af ​​efterforskerne. De iranske prøver vil blive behandlet i Teheran, og de ekstraherede DNA-prøver vil blive overført til McMaster til sekventering. Den sidste del, dvs. analysen af ​​de sekventerede DNA-prøver, kan enten udføres i Teheran eller hos McMaster. To biopsier hver fra antrum og krop af mave vil blive opnået for at vurdere H. pylori-status som standard for pleje af begge kohorter.

Mikrobiomanalyse DNA-ekstraktion og molekylær profilering vil blive udført ved hjælp af standardprotokoller. Bakteriesamfundsprofilering af 16S rRNA-genet vil blive udført ved hjælp af parrede endelæsninger af V3-regionen. Tredobbelte amplifikationer vil blive samlet til 150 eller 250 nt parret Illumina-sekventering i McMaster Genome Center. Denne tilgang giver overlappende sekvenslæsninger af V3-regionen, som kan bruges til at korrigere baseopkald af dårlig kvalitet og øge sekventeringsnøjagtigheden. Multipleksning af kørslen med stregkodede primere vil give ca. 25.000 sekvensaflæsninger pr. prøve. Sekvensdataene vil blive behandlet af en intern bioinformatikpipeline, der inkorporerer kvalitetsfiltrering med cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur og QIIME. Output vil inkludere klyngede sekvenser i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) ved brug af AbundantOTU+ og taksonomiske tildelinger ved hjælp af RDP-klassifikatorklassificeringen ved brug af Greengenes træningssæt. Mikrobiomanalyse vil omfatte α-diversitetsmålinger for hver prøve og β-diversitetsmål (vægtet og uvægtet unifrac, Bray-Curtis, ikkemetrisk multidimensionel skalering) og anden statistisk analyse ved hjælp af QIIME25 og PhyloSeq. Mikrobiotaens funktionelle egenskaber vil blive udledt ved hjælp af fylogenetisk undersøgelse af samfund ved rekonstruktion af uobserverede stater (PICRUSt) og sammenlignet yderligere ved hjælp af statistisk

Prøvestørrelse Efterforskerne planlægger at rekruttere 500 nye patienter henvist til øvre GI-endoskopi i Canada (McMaster University) og 500 i Japan (Division of Gastroenterology, Tohoku University Hospital) og 500 fra Iran (Teheran University). Dette er baseret på foreløbige data fra 20 patienter, der har fået vurdering af mikrobiomet i spiserør, mave og tolvfingertarmen og antager, at oddsratioen for den operationelle taksonomiske enhed vil være 2 gange mellem organisk sygdom og sund kontrol (EGD uden GI-symptomer). fx til evaluering af anæmi, hvor der ikke findes nogen abnormitet) og antager, at der vil være mindst 50 raske kontroller og 50 patienter med en given sygdom. Der vil være behov for 500 patienter, da efterforskerne vil evaluere mavesår, FD, esophagitis separat og skal justere for flere tests.

Til NRA-måling har efterforskerne brug for 18 patienter blandt GERD, NERD og kontrolarm. Dette forudsætter en Z-alfa på 1,96 (tosidet), 1-beta=0,8416, Sigma på 0,99 og middelforskel på 0,9310.

Statistisk analyse Baseline beskrivende data vil blive analyseret og rapporteret som gennemsnit og standardafvigelser for kontinuerte variable, og procent og frekvens for kategoriske variable. Dikotome variable vil blive analyseret ved at sagsøge Chi kvadrat (x2) test og kontinuerlig ved hjælp af Students t test (for to grupper) og ANOVA (for mere end to grupper), medmindre tallene er < 50 i en gruppe, når efterforskerne vil bruge Mann Whitney U test for to grupper og Kruskal-Wallis for mere end to grupper. SPSS version 21.0 (SPSS (Japan) Co., Ltd., Tokyo, Japan) til Windows-systemer vil blive brugt med forskelle, der anses for signifikante på <0,05-niveauet for de primære resultater og <0,01 for det sekundære for at justere for multiple tests.