Sintomi giapponesi del tratto gastrointestinale superiore rispetto ai pazienti iraniani e canadesi che si presentano

Obiettivo Lo scopo dello studio è confrontare i sintomi del tratto gastrointestinale superiore e i risultati dell'endoscopia in Canada con Giappone e Iran e correlarli con il microbioma del tratto gastrointestinale superiore.

L'esito primario è il microbioma batterico nei pazienti con FD rispetto ai pazienti di controllo senza sintomi gastrointestinali superiori e un'endoscopia normale. Gli investigatori eseguiranno un'analisi pianificata per sottogruppi in base al paese di reclutamento, nonché sottogruppi basati su sesso ed età (<o = 50 anni contro> 50 anni)

Gli esiti secondari sono

1. Il microbioma nei pazienti con esofagite rispetto ai pazienti senza esofagite. Valutare i batteri che riducono i nitrati orali sul dorso della lingua di pazienti con GERD erosiva, pazienti con GERD non erosiva e confrontarli con quelli dei controlli normali arruolati nello studio JUICE.
2. Il microbioma nei pazienti con ulcera peptica (PUD) negativa per H. pylori rispetto ai pazienti con PUD positivi per H. pylori e controlli endoscopici normali asintomatici.
3. Il microbioma nei pazienti con ansia rispetto ai controlli senza ansia nel gruppo FD.
4. Il microbioma in quelli con depressione rispetto ai controlli senza depressione nel gruppo FD.
5. Il microbioma nei pazienti con ansia rispetto ai controlli senza ansia nei pazienti senza sintomi del tratto gastrointestinale superiore e un'endoscopia normale.
6. Il microbioma in quelli con depressione rispetto ai controlli senza depressione nei pazienti senza sintomi del tratto gastrointestinale superiore e un'endoscopia normale
7. Confronto tra patologia gastrointestinale superiore (infiammazione, displasia, malignità) e microbioma nella popolazione canadese rispetto a quella giapponese.

Metodologia Studio della popolazione, criteri di inclusione ed esclusione Questo è uno studio prospettico internazionale di coorte in Canada, Giappone e Iran. Gli investigatori recluteranno pazienti adulti (≥18 anni di età) sottoposti a esofago-gastro duodenoscopia (EGD) per qualsiasi motivo e che acconsentono a essere arruolati nello studio durante il periodo di studio. Il gruppo di controllo sarà costituito da pazienti con sintomi del tratto gastrointestinale superiore assenti o minimi che vengono indirizzati per EGD. I criteri di esclusione saranno i pazienti che non parlano inglese in Canada, che non parlano giapponese in Giappone e non parlano persiano in Iran.

Metodi Il consenso scritto sarà ottenuto da tutti i partecipanti. Il consenso del medico per motivi medici include l'endoscopia standard e le biopsie gastriche per valutare lo stato di H.pylori. Il consenso alla ricerca contiene il prelievo della saliva con specifico dispositivo denominato "Oracol plus®" e lo spazzolamento dei tessuti a livello dell'esofago, dello stomaco (corpo e antro) e del duodeno distale. Se il paziente è idoneo per questo studio, gli investigatori registreranno i dati demografici (età, sesso, istruzione, razza, storia medica passata, assunzione di farmaci, in particolare PPI e antibiotici) e il motivo principale dell'endoscopia. I pazienti completeranno i questionari; sintomi del tratto gastrointestinale superiore misurati dal questionario sulla dispepsia di Leeds in forma breve (SFLDQ), qualità della vita misurata dall'EQ-5D e ansia e depressione misurate dalla scala dell'ansia e della depressione dell'ospedale (HADS). Quindi dispositivo di raccolta della saliva; Oracol plus® (Malvern Medical Developments, Worchester, Regno Unito) verrà applicato per raccogliere la saliva. Il dispositivo è progettato per essere utilizzato in modo simile a uno spazzolino da denti. La saliva viene raccolta strofinando con forza il tampone di spugna lungo la gengiva (alla base dei denti se presente) e il dorso della lingua fino a quando la spugna è bagnata, questo richiede circa 1 minuto. Una volta che la saliva è stata prelevata è sicura all'interno del contenitore, un microtubo è incorporato all'interno del dispositivo in modo che la saliva venga centrifugata direttamente nel microtubo fornito. Ciò riduce il rischio di contaminazione da aerosol. Questo processo ha lo scopo di documentare i microbiomi nella cavità orale al fine di confermare i microbiomi residenti nel tratto gastrointestinale superiore.

La misurazione dell'attività orale della nitrato reduttasi (NRA).

Considerando che la GERD erosiva è piuttosto rara in Giappone, questa parte dello studio sarà eseguita a Hamilton e Teheran come segue:

Venti pazienti con GERD erosivo, venti pazienti con GERD non erosivo arruolati in JUICE dal Canada e venti controlli senza sintomi del tratto gastrointestinale superiore sono stati arruolati dopo aver ottenuto il consenso informato. Oltre alle procedure descritte in JUICE, per questi gruppi viene eseguito quanto segue:

1. Un tampone Oracol plus® viene passato sulle gengive e sul dorso della lingua per 60 secondi come descritto nel protocollo principale. Viene elaborato nello stesso modo e lo studio del microbioma viene eseguito nello stesso modo descritto per il protocollo JUICE vero e proprio.
2. L'NRA viene misurata con campionamenti consecutivi della cavità orale a intervalli di un minuto per tre minuti come segue: ai casi e ai controlli viene chiesto di digiunare durante la notte ed evitare cibi ad alto contenuto di nitrati (inclusi lattuga, cavolo, sedano, rapa, barbabietola, ravanello e rabarbaro) per almeno 8 h. Il dosaggio dell'NRA in bocca viene eseguito tra le 7:30 e le 10:00. La mattina del test, all'individuo viene inizialmente chiesto di sciacquarsi la bocca con 22 ml di acqua sterile deionizzata. Quindi gli viene chiesto di tenere in bocca 22 ml di una soluzione di nitrato-N/L da 10 mg per 3 minuti. Al soggetto viene chiesto di mescolare la soluzione in bocca all'inizio e ogni 1 minuto nei 3 minuti, e 1,5 ml della soluzione incubata in bocca viene prelevata con una siringa sterile dopo ogni miscelazione (cioè all'inizio e a intervalli di 1 minuto). Il resto della soluzione viene scartato. Ogni campione viene immediatamente trasferito in una provetta Eppendorf contenente 56,25 microlitri di NaOH 0,8 M (per distruggere la vitamina C e aumentare ulteriormente la produzione di nitriti). Quindi si aggiungono 18,0 microlitri di ZnSO4 1,4 M a ciascuna provetta, si agita per 2 se si lascia a temperatura ambiente per 30 min. I campioni vengono quindi centrifugati a 13.000 g a 25 ℃ per 7 min. Questo trattamento rimuove le proteine ​​che potrebbero interferire con la reazione di Griess utilizzata per la misurazione dei nitriti. Il nitrito viene misurato aggiungendo 250 microlitri di reagente Griess A [0,2% (p/v) sulfanilamide in H3PO4 concentrato al 5% (v/v)] a 500 microlitri del sopranatante del campione centrifugato in una cuvetta da 1.000 microlitri e leggendo l'assorbanza a 540 nm utilizzando uno spettrofotometro (WPA BiowaveII, UK). Questa lettura si chiama ''A1.'' Quindi, 250 microlitri di reagente Griess B [soluzione allo 0,02% (p/v) di N-(1-naftil)-etilendiammina-dicloridrato] vengono aggiunti alla cuvetta. La cuvetta viene quindi tenuta al buio a temperatura ambiente per 10 minuti e l'assorbanza è stata nuovamente letta a 540 nm e la lettura denominata ''A2.'' Il valore (A2-A1) viene letto rispetto a una curva standard sviluppata testando concentrazioni note di NaNO2 e viene determinata la concentrazione finale di nitriti. Un campione di 500 microlitri di acqua sterile deionizzata viene trattato in ogni caso esattamente come il campione di saliva e funge da bianco per il controllo di qualità. I valori dei nitriti a 0, 1, 2 e 3 min vengono tracciati rispetto al tempo e viene calcolata la pendenza della linea di tendenza. Questa pendenza rappresenta il nitrito formato per persona al minuto. La pendenza viene moltiplicata per 22 (il volume della soluzione di nitrato) per calcolare l'attività della nitrato reduttasi e riportata come microgrammi di nitrito-N formati per persona al minuto.

Definizioni:

Per scopi pratici, GERD è definito clinicamente secondo il vertice di Montreal come fastidioso rigurgito o bruciore di stomaco che si verificano almeno una volta alla settimana. Questa definizione verrà utilizzata per arruolare i pazienti non erosivi e per escludere la GERD nei controlli. Sarà anche utilizzato per valutare clinicamente i pazienti erosivi. I controlli devono non solo essere asintomatici (secondo la definizione sopra menzionata), ma anche non avere segni endoscopici macroscopici di reflusso.

Verranno eseguiti esofagogastroduodenoscopia e campionamento per il microbioma EGD e verrà utilizzato uno spazzolino con guaina sterile per raccogliere il microbiota intestinale. Per ogni paziente, la spazzolatura dei tessuti verrà eseguita prima dall'esofago medio e inferiore con una spazzola, poi lo stomaco (curvatura maggiore e minore del corpo e dell'antro) con una seconda spazzola, il cappuccio duodenale e il duodeno distale con una terza spazzola. Questo sarà condotto quando l'endoscopio viene introdotto e in ogni caso la raccolta sarà ottenuta spazzolando delicatamente l'area appropriata. Il materiale raccolto sulla superficie del pennello verrà risospeso nell'RNA successivamente in una provetta sterile. I campioni sono stati lasciati incubare a temperatura ambiente per un massimo di 2 ore, quindi congelati e conservati a -80 °C. I campioni di microbioma congelato giapponese verranno spediti o portati al McMaster Genome Center da uno degli investigatori. I campioni iraniani saranno elaborati a Teheran e i campioni di DNA estratti saranno trasferiti a McMaster per il sequenziamento. L'ultima parte, ovvero l'analisi dei campioni di DNA sequenziati, può essere eseguita a Teheran o presso McMaster. Saranno ottenute due biopsie ciascuna dall'antro e dal corpo dello stomaco per valutare lo stato di H. pylori come standard di cura di entrambe le coorti.

Analisi del microbioma L'estrazione del DNA e la profilazione molecolare saranno effettuate utilizzando protocolli standard. Il profilo della comunità batterica del gene 16S rRNA sarà effettuato utilizzando paired end reads della regione V3. Le amplificazioni triplicate saranno raggruppate per il sequenziamento Illumina paired-end da 150 o 250 nt nel McMaster Genome Center. Questo approccio fornisce letture di sequenze sovrapposte della regione V3, che possono essere utilizzate per correggere identificazioni delle basi di scarsa qualità e aumentare la precisione del sequenziamento. Il multiplexing della corsa con primer con codice a barre fornirà circa 25.000 letture di sequenze per campione. I dati della sequenza verranno elaborati da una pipeline bioinformatica interna che incorpora il filtraggio della qualità con cutadap PandaSeq, AbundantOTU+, mothur e QIIME. L'output includerà sequenze raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) utilizzando AbundantOTU+ e assegnazioni tassonomiche utilizzando il classificatore di classificazione RDP utilizzando il set di addestramento Greengenes. L'analisi del microbioma includerà metriche di diversità α per ciascun campione e misure di diversità β (unifrac pesato e non ponderato, Bray-Curtis, ridimensionamento multidimensionale non metrico) e altre analisi statistiche utilizzando QIIME25 e PhyloSeq. Le proprietà funzionali del microbiota saranno dedotte utilizzando l'indagine filogenetica delle comunità mediante la ricostruzione degli stati non osservati (PICRUSt) e ulteriormente confrontate utilizzando la statistica

Dimensione del campione Gli investigatori prevedono di reclutare 500 nuovi pazienti sottoposti a endoscopia gastrointestinale superiore in Canada (McMaster University) e 500 in Giappone (Divisione di Gastroenterologia, Tohoku University Hospital) e 500 dall'Iran (Università di Teheran). Questo si basa sui dati preliminari di 20 pazienti che hanno avuto una valutazione del microbioma nell'esofago, nello stomaco e nel duodeno e presuppone che l'odds ratio per l'unità tassonomica operativa sarà 2 volte tra malattia organica e controllo sano (EGD senza sintomi GI ad esempio per la valutazione dell'anemia in cui non viene rilevata alcuna anomalia) e presuppone che ci saranno almeno 50 controlli sani e 50 pazienti con una data malattia. Saranno necessari 500 pazienti poiché gli investigatori valuteranno separatamente ulcera gastrica, FD, esofagite e dovranno adeguarsi a test multipli.

Per la misurazione dell'NRA, gli investigatori hanno bisogno di 18 pazienti tra GERD, NERD e braccio di controllo. Ciò presuppone uno Z-alfa di 1,96 (a due facce), 1-beta=0,8416, Sigma di 0,99 e differenza media di 0,9310.

Analisi statistica I dati descrittivi di base saranno analizzati e riportati come medie e deviazioni standard per le variabili continue e percentuale e frequenza per le variabili categoriali. Le variabili dicotomiche saranno analizzate utilizzando il test Chi quadrato (x2) e continue utilizzando il test t di Student (per due gruppi) e ANOVA (per più di due gruppi) a meno che i numeri non siano <50 in un gruppo quando i ricercatori utilizzeranno il test U di Mann Whitney per due gruppi e Kruskal-Wallis per più di due gruppi. Verrà utilizzata la versione 21.0 di SPSS (SPSS (Giappone) Co., Ltd., Tokyo, Giappone) per i sistemi Windows con differenze considerate significative al livello <0,05 per gli esiti primari e <0,01 per il secondario per adeguarsi a test multipli.