尿毒症性サルコペニアとミトコンドリアコピー数の関連性とその臨床的相関

研究のデザインと方法 被験者 この研究では、維持血液透析を受けている 200 人の患者を募集します。 さらに、年齢と性別を一致させた 50 人の被験者がコントロールとして機能します。 HD 患者は、少なくとも 3 か月間安定した透析を受けています。 HD 患者は、週 3 回、標準的な重炭酸塩透析 (Na 138 mmol/L、HCO3 35 mmol/L、K 1.5 mmol/L、Ca 1.25 mmol/L、 Mg 0.75 mmol/L) および合成膜を使用したハイフラックス HD (透析フィルター表面積: 1.7 ～ 2.1 m2)。 私たちの研究に登録するすべてのHD患者は、DEXAと握力でテストされます。 以下に示すように、人口統計データが収集され、臨床検査が実施されます。

生化学的測定 実験室試験用の血液サンプルは、血液透析セッションの開始時に血管アクセスの静脈末端から採取され、分析時まで-80℃で保存されました。 高感度 C 反応性タンパク質 (hsCRP) レベルは、Hitachi 自動分析装置 (モデル 7170) を使用した市販の免疫比濁法アッセイによって決定されました。 CRPの検出限界と検出間隔は0.1mg/L、0.1～500.0でした mg/L、それぞれ。 ベースラインの血清アルブミンは、Hitachi 自動分析装置 (モデル 7170) でブロモクレゾール グリーン法によって測定されました。 コレステロール、トリグリセリド、および低密度および高密度リポタンパク質コレステロールの血清レベルは、標準的な検査方法によって決定されました。

相対白血球ｍｔＤＮＡコピー数の決定 リアルタイムＰＣＲ反応は、各反応について３回行った。 10ul PCR 反応液には、1X TaqMan Universal PCR Master Mix バッファー、500nM の各プライマー、200nM の TaqMan プローブ、および 0.2 ～ 2ng の全ゲノム DNA 抽出物が含まれます。PCR 条件は、50℃で 2 分、95℃で 10 分、続いて95℃ 15 秒の変性と 60℃ 60 秒のアニーリング/伸長を 40 サイクル。 StepOneリアルタイムPCRシステム(ABI)でリアルタイム定量分析を行った。 リアルタイム PCR 用のプライマーとプローブを表 1 に示します。 ミトコンドリアDNA(MtDNA)と核DNAを含むPCR産物。

標準曲線:

ミトコンドリアゲノムおよび核 18S rRNA 遺伝子 (nDNA) の標準 DNA 溶液は、pCR2.1-TOPO のベクターにクローニングされた PCR 産物から生成されました。 段階希釈を行い、RT-QPCR 反応を行って、Ct 値と標準プラスミド DNA のコピー数から標準曲線を作成しました。

mtDNA コンテンツの尺度としての mtDNA/nDNA 比の決定:

mtDNA および nDNA のコピー数は、しきい値サイクル数 (Ct) を使用して計算され、標準曲線から内挿されます。 nDNA のコピー数に対する mtDNA のコピー数の比率は、mtDNA 含有量の測定値です。 アルブミン酸化還元状態の測定 アルブミン酸化還元状態の測定は、以前に報告された高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 法を使用して実行されました [31]。 HPLC-蛍光検出 (HPLC-FD) システムは、AS-8010 オートサンプラー (注入量、検体あたり 2 mL、Tosoh、東京、日本) とモデル FS-8000 蛍光検出器 (励起波長、280 nm、発光波長) で構成されていました。 、340 nm) SC-8020 システム コントローラー (Tosoh) と組み合わせた CCPM ダブルプランジャー ポンプ (Tosoh) を使用します。 Shodex-Asahipak ES-502N 7C カラム [昭和電工、東京、日本; 10×0.76cm（内径）、イオン交換HPLC用ジメチルアミノエチル体、カラム温度、35℃±0.5℃］ または場合によっては、Asahipak GS-520H カラム [旭化成工業株式会社] を 2 本使用します。川崎、日本; ３２℃で維持された２５×０．７５ｃｍ（内径）］を使用した。 ０．０５Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．４０Ｍ硫酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８５；酢酸−硫酸緩衝液）中、流速１．０ｍＬ／分で、エタノールレベルを０％から５％まで上昇させて直線勾配溶出を行った。 ヘリウムバブリングにより緩衝液の脱気を行った。 これらの手順から得られた HSA の HPLC プロファイルに基づいて、各フラクションの値を数値曲線フィッティングにかけ、総 HSA に対する HMA、HNA-1、および HNA-2 のフラクションを計算しました。

リポ糖結合タンパク質 (LBP) の測定 LBP は、標準化された酵素免疫測定法 (ELISA) 法を使用して血清サンプルとコントロールから決定され、正常なコントロール被験者の血清はアッセイ間変動に使用されました。

８－イソ－ＰＧＦ２－アルファの合計分析 血漿中の合計８－イソ－ＰＧＦ２－アルファ濃度を、特異的酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）キット（ケイマン・ケミカル、ミシガン州アナーバー）によって測定した。 サンプルを遠心分離し、上清を収集し、前述のように精製し、アッセイまで-80°Cで保存しました。 サンプルは、1:10 または 1:20 希釈後 50 μl でアッセイし、96 ウェルマイクロプレートリーダーで 420 nm で読み取った。 アッセイは、追加された既知の量の 8-イソプロスタンと EIA によって測定された濃度との間に高い相関 (0.95) を得ることが検証されており、ガスクロマトグラフィー/質量分析によって直接検証されています。 このアッセイで使用される抗血清は、8-iso-PGF2-alpha と 100%、PGF2-alpha、PGF3、PGE1、PGE2 とそれぞれ 0.2%、6-keto-PGF1-alpha とそれぞれ 0.1% の交差反応性を示します。 アッセイの検出限界は 4 pg/ml で、標準曲線の範囲は 3.9 ～ 500 pg/ml でした。

血清総p-クレゾールおよびインドキシル硫酸塩の測定 全p-クレゾール硫酸塩(PCS)およびインドキシル硫酸塩(IS)の血漿中濃度は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析されます。 簡単に説明すると、結合競合のために、0.50mM 1-ナフタレンスルホン酸 (内部標準) 20μl を添加した血清 200μl を、0.24M オクタン酸ナトリウム (結合競合剤) 250μl とボルテックス混合しました。室温で 5 分間インキュベートした後、2ml の冷タンパク質を沈殿させるためのアセトン。 ボルテックス混合し、4℃、1860×gで20分間遠心分離した後、上清を12mm×100mmのGL 14ガラス試験管に移し、2mlのジクロロメタンを加えました。 ボルテックス混合し、4℃、1860×gで10分間遠心分離した後、200μlの上層をガラス製オートサンプラーバイアルに移し、続いて20μlの1M HClを添加し、15μlをHPLCに注入しました。 ＨＰＬＣ分析はＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＬＣ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で実施し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎｓソフトウェアをクロマトグラフィー分析に使用した。 分離は、ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ－Ｃ１８ Ｓｏｌｖ Ｓａｖｅｒ Ｐｌｕｓ ＨＰＬＣカラム（５μｍ、３．０ｍｍ×１５０ｍｍ）で０．６ｍｌ／分の流速で行った。 移動相 A は Milli-Q 水に溶解した 0.2% トリフルオロ酢酸、移動相 B はアセトニトリルに溶解した 0.2% トリフルオロ酢酸です。 分析メソッドは、23 分間、92% の移動相 A を使用したアイソクラティック分析で構成されています。 各分析ランの後に、100 % B までの 1.3 分のウォッシュアウト グラジエントが続きました。カラム温度は 25 ℃、オートサンプラー トレイ温度は 6 ℃でした。 Agilent 1100 高性能蛍光検出器 G1321A で分析物と標準ピーク面積の比率を使用して、分析物を定量化しました。 検出器の設定は、p-クレシル硫酸についてはλex 260 nm/λem288nm、インドキシル硫酸および内部標準についてはλex 280 nm/λem 390nmであった。 定量結果が得られ、それらの濃度 (mg/L) で計算されます。

握力 筋力は、Jamar ハンドダイナモメーター (Lafayette Instrument Company、米国) を使用して利き手に評価されます。 患者は最初に装置に慣れ、次に両腕を体から横に伸ばした状態で立った状態で検査され、ダイナモメーターが体とは反対側を向いていました。 患者は音声コマンドに応答してダイナモメーターを最大の強さで握るように指示され、3 回の測定値の最高値が研究のために考慮されました。 年齢と性別で調整された特定の母集団の参照値からの 30 パーセンタイル未満のハンドグリップ強度 (HGS) 値 (表 2) は、低下していると見なされました [32]。

Dual-Energy X-ray Absorptiometry (DEXA) DEXA は、体の FFM および FM 測定に広く使用されている参照方法です。 DEXA は、Lunar Prodigy (GE Medical Systems、ウィスコンシン州マディソン) を使用して実行されました。 製造元の指示に従って全身スキャンを実施し、製造元のソフトウェアを使用してボディ FM (FMDEXA)、LTM (LTMDEXA)、および骨ミネラル含有量を分析しました。 DEXA 方式では、フィルター付きの X 線管を使用して低エネルギー (40 kV) を生成します。 高エネルギー (70 または 100 kV) の光子。 異なるエネルギー レベルの光子が組織を通過するとき、それらの吸収は、より低いエネルギー レベルまたはより高いエネルギー レベルでの減衰の比率として表すことができます。 FFMのDEXA推定値は、LTMと骨ミネラル含有量の推定値の合計として計算されました。

すべての患者は、同じ観察者によって検査されます。 全体として、AWGS は、カットオフ値の決定として、若年参照グループの平均筋肉量または下位五分位数より 2 標準偏差を使用することを推奨しています。 さらに、AWGS は、体重調整骨格筋量の代わりに身長調整骨格筋量を使用することを推奨しており、DEXA を使用した場合の推奨カットオフ値は、男性で 7.0 kg/m2、女性で 5.4 kg/m2 でした。