尿毒症肌肉减少症与线粒体拷贝数的关联及其临床相关性

研究设计和方法 受试者 在这项研究中，我们将招募 200 名维持性血液透析患者。 此外，还有 50 名年龄和性别匹配的受试者作为对照。 HD 患者已进行至少 3 个月的稳定透析 HD 患者每周接受 3 次标准碳酸氢盐透析（Na 138 mmol/L，HCO3 35 mmol/L，K 1.5 mmol/L，Ca 1.25 mmol/L， Mg 0.75 mmol/L) 和使用合成膜的高通量 HD（透析过滤器表面积：1.7 至 2.1 m2）。 所有参加我们研究的 HD 患者都将接受 DEXA 和握力测试。 将收集人口统计数据并进行实验室检查，如下所列。

生化测定 在血液透析开始时，从血管通路的静脉端抽取用于实验室检测的血样，然后在-80°C 下储存直至分析。 使用 Hitachi 自动分析仪（型号 7170）通过商业免疫比浊法测定高敏 C 反应蛋白 (hsCRP) 水平。 CRP的检出限和区间分别为0.1 mg/L和0.1-500.0 毫克/升，分别。 在 Hitachi 自动分析仪（型号 7170）上通过溴甲酚绿法测量基线血清白蛋白。 胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的血清水平通过标准实验室方法测定。

相对白细胞mtDNA 拷贝数的确定每个反应一式三份进行实时PCR 反应。 10ul PCR反应包含1X TaqMan Universal PCR Master Mix buffer、500nM的每种引物、200nM的TaqMan探针和0.2-2ng的总基因组DNA提取物，PCR条件为50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃变性15 s，60℃退火/延伸60 s，40个循环。 在 StepOne 实时 PCR 系统 (ABI) 上进行实时定量分析。 用于实时荧光定量 PCR 的引物和探针列于表 1。 涉及线粒体DNA(MtDNA)和核DNA的PCR产物。

标准曲线：

线粒体基因组和核 18S rRNA dene (nDNA) 的标准 DNA 溶液由克隆在 pCR2.1-TOPO 载体中的 PCR 产物生成。 进行连续稀释并进行 RT-QPCR 反应以根据 Ct 值和标准质粒 DNA 的拷贝数构建标准曲线。

确定 mtDNA/nDNA 比率作为 mtDNA 含量的量度：

mtDNA 和 nDNA 的拷贝数是使用阈值循环数 (Ct) 和从标准曲线内插计算的。 mtDNA拷贝数与nDNA拷贝数的比值是mtDNA含量的度量[30]。 白蛋白氧化还原态的测量 白蛋白氧化还原态的测量是使用先前报道的高效液相色谱 (HPLC) 方法进行的 [31]。 HPLC-荧光检测 (HPLC-FD) 系统由 AS-8010 自动进样器（注射体积，每个样品 2 mL；Tosoh，东京，日本）和 FS-8000 型荧光检测器（激发波长，280 nm；发射波长）组成, 340 nm) 与 CCPM 双柱塞泵 (Tosoh) 结合 SC-8020 系统控制器 (Tosoh)。 Shodex-Asahipak ES-502N 7C 色谱柱 [Showa Denko，东京，日本； 10×0.76 cm（内径），离子交换HPLC用二甲基氨基乙基型，柱温，35℃±0.5℃] 或者在某些情况下使用两根 Asahipak GS-520H 色谱柱 [Asahi Chemical Industry；日本川崎；使用保持在 32°C 的 25×0.75 厘米（内径）]。 在 0.05 M 乙酸钠和 0.40 M 硫酸钠缓冲液（pH 4.85；乙酸盐-硫酸盐缓冲液）中，乙醇水平从 0% 增加到 5%，流速为 1.0 mL/min，进行线性梯度洗脱。 缓冲溶液的脱气通过氦气鼓泡进行。 基于从这些程序中获得的 HSA 的 HPLC 图谱，对每个分数的值进行数值曲线拟合，并计算 HMA、HNA-1 和 HNA-2 占总 HSA 的分数。

脂糖结合蛋白 (LBP) 的测量 使用标准化酶联免疫吸附测定 (ELISA) 方法从血清样本和对照中测定 LBP，并将来自正常对照受试者的血清用于测定间变异。

总 8-iso-PGF2-alpha 分析 血浆中总的 8-iso-PGF2-alpha 浓度通过特异性酶免疫测定 (EIA) 试剂盒（Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich）测量。 离心样品并收集上清液，如前所述纯化并储存在-80°C直至测定。 样品在 1:10 或 1:20 稀释后以 50 μl 测定，并在 96 孔酶标仪中在 420 nm 处读数。 经验证，该测定可在添加的已知量的 8-异前列烷与 EIA 测量的浓度之间获得高度相关性 (0.95)，并已通过气相色谱/质谱法直接验证。 该测定中使用的抗血清与 8-iso-PGF2-alpha 具有 100% 的交叉反应性，与 PGF2-alpha、PGF3、PGE1、PGE2 各有 0.2%，与 6-keto-PGF1-alpha 各有 0.1%。 检测限为4 pg/ml，标准曲线范围为3.9-500 pg/ml。

血清总对甲酚和硫酸吲哚酚的测定 用高效液相色谱法 (HPLC) 分析总对甲酚硫酸盐 (PCS) 和硫酸吲哚酚 (IS) 的血浆浓度。 简而言之，为了进行结合竞争，将我们添加了 20μl 0.50mM 1-萘磺酸（内标）的 200μl 血清与 250μl 0.24M 辛酸钠（结合竞争剂）涡旋混合。在室温下孵育 5 分钟后，我们加入 2ml 冷丙酮沉淀蛋白质。 涡旋混合并在 4°C 下以 1860×g 离心 20 分钟后，将上清液转移到 12mm×100mm 的 GL 14 玻璃试管中，加入 2ml 二氯甲烷。 涡旋混合并在 4°C 下以 1860×g 离心 10 分钟后，将 200μl 上层转移到玻璃自动进样器小瓶中，然后加入 20μl 1M HCl，并将 15μl 注入 HPLC。 HPLC 分析在 Agilent 1100 系列 LC（Santa Clara，CA）上进行，Agilent ChemStations 软件用于色谱分析。 分离在 ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC 柱（5 μm，3.0 mm×150 mm）上以 0.6 ml/min 的流速进行。 流动相 A 是含 0.2% 三氟乙酸的 Milli-Q 水，流动相 B 是含 0.2% 三氟乙酸的乙腈。 该分析方法包括使用 92% 流动相 A 进行 23 分钟的等度运行。 每次分析运行之后是 1.3 分钟的洗脱梯度至 100% B。柱温为 25 °C，自动进样器托盘温度为 6 °C。 我们通过在 Agilent 1100 高性能荧光检测器 G1321A 上使用分析物与标准峰面积比对分析物进行量化。 对甲酚硫酸盐的检测器设置为 λex 260 nm/λem288nm，硫酸吲哚酚和内标的检测器设置为 λex 280 nm/λem 390nm。 根据它们的浓度 (mg/L) 获得并计算定量结果。

握力强度 使用 Jamar 手测力计（美国 Lafayette Instrument Company）评估惯用手的肌肉力量。 患者首先熟悉该装置，然后双臂从身体两侧伸展站立接受检查，测力计背对身体。 指示患者响应语音命令以最大力量握住测力计，并且研究考虑三个测量值中的最高值。 根据年龄和性别调整的特定人群参考值的第 30 个百分位数（表 2）下的握力 (HGS) 值被认为是降低的 [32]。

双能 X 射线吸收测定法 (DEXA) DEXA 是一种广泛用于人体 FFM 和 FM 测量的参考方法。 10 DEXA 使用 Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI) 进行。 根据制造商的说明进行全身扫描，并使用制造商的软件分析身体 FM (FMDEXA)、LTM (LTMDEXA) 和骨矿物质含量。 DEXA 方法使用带有过滤器的 X 射线管产生低能量 (40 kV)。 和高能（70 或 100 kV）光子。 当不同能量水平的光子通过组织时，它们的吸收可以表示为在较低或较高能量水平下的衰减比。 FFM 的 DEXA 估计值计算为 LTM 和骨矿物质含量估计值的总和。

所有患者将由同一观察者进行检查。 总的来说，AWGS 建议使用低于年轻参考组平均肌肉质量或较低五分位数的 2 个标准差作为临界值确定。 此外，AWGS 建议使用身高调整后的骨骼肌质量而不是体重调整后的骨骼肌质量，使用 DEXA 时建议的截断值男性为 7.0 kg/m2，女性为 5.4 kg/m2。