Associação de sarcopenia urêmica e número de cópias mitocondriais e seus correlatos clínicos

Desenho da pesquisa e métodos Sujeitos Neste estudo, recrutaremos 200 pacientes em hemodiálise de manutenção. Além disso, 50 indivíduos pareados por idade e sexo atuam como controles. Os pacientes em HD estão em diálise estável há pelo menos 3 meses. Os pacientes em HD estão sendo tratados três vezes por semana com diálise padrão com bicarbonato (Na 138 mmol/L, HCO3 35 mmol/L, K 1,5 mmol/L, Ca 1,25 mmol/L, Mg 0,75 mmol/L) e por HD de alto fluxo com membranas sintéticas (área de superfície dos filtros de diálise: 1,7 a 2,1 m2). Todos os pacientes em HD inscritos em nosso estudo serão testados com DEXA e força de preensão manual. Os dados demográficos serão coletados e os exames laboratoriais serão realizados conforme listado abaixo.

Determinações bioquímicas As amostras de sangue para testes laboratoriais foram coletadas da extremidade venosa de um acesso vascular no início da sessão de hemodiálise e então armazenadas a -80°C até o momento da análise. Os níveis de proteína C reativa de alta sensibilidade (hsCRP) foram determinados por um ensaio imunoturbidimétrico comercial usando um autoanalisador Hitachi (modelo 7170). O limite de detecção e intervalo para PCR foi de 0,1 mg/L e 0,1-500,0 mg/L, respectivamente. A albumina sérica basal foi medida pelo método verde de bromocresol em um analisador automático Hitachi (modelo 7170). Os níveis séricos de colesterol, triglicerídeos e colesterol de lipoproteína de baixa e alta densidade foram determinados por métodos laboratoriais padrão.

Determinação do número relativo de cópias de mtDNA de leucócitos A reação de PCR em tempo real foi realizada em triplicado para cada reação. A reação de PCR de 10ul contém 1X TaqMan Universal PCR Master Mix buffer, 500nM de cada iniciador, 200nM de sonda TaqMan e 0,2-2ng de extrato de DNA genômico total, as condições de PCR são 2 min a 50 ℃, 10 min a 95 ℃, seguido de 40 ciclos de 15 s de desnaturação a 95 ℃ e 60 s de recozimento/extensão a 60 ℃. A análise quantitativa em tempo real foi realizada no sistema StepOne Real-Time PCR (ABI). Os primers e sondas para PCR em tempo real estão listados na Tabela 1. Os produtos de PCR que envolvem DNA mitocondrial (MtDNA) e DNA nuclear.

Curva padrão:

Soluções padrão de DNA para o genoma mitocondrial e o dene nuclear 18S rRNA (nDNA) foram geradas a partir de produtos de PCR clonados em um vetor de pCR2.1-TOPO. Diluições seriadas foram feitas e reações de RT-QPCR foram realizadas para construir a curva padrão a partir dos valores de Ct e do número de cópias do DNA plasmidial padrão.

Determinação da relação mtDNA/nDNA como uma medida do conteúdo de mtDNA:

O número de cópias do mtDNA e do nDNA é calculado usando o número de ciclo de limiar (Ct) e intrapolando a partir da curva padrão. A proporção do número de cópias do mtDNA para o número de cópias do nDNA é a medida do conteúdo do mtDNA.[30] Medição do estado redox da albumina A medição do estado redox da albumina foi realizada usando o método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) relatado anteriormente [31]. O sistema de detecção de fluorescência HPLC (HPLC-FD) consistia em um amostrador automático AS-8010 (volume de injeção, 2 mL por amostra; Tosoh, Tóquio, Japão) e um detector de fluorescência Modelo FS-8000 (comprimento de onda de excitação, 280 nm; comprimento de onda de emissão , 340 nm) com uma bomba CCPM de duplo êmbolo (Tosoh) em conjunto com um controlador de sistema SC-8020 (Tosoh). Uma coluna Shodex-Asahipak ES-502N 7C [Showa Denko, Tóquio, Japão; 10×0,76 cm (diâmetro interno), forma de dimetilaminoetil para HPLC de troca iônica, temperatura da coluna, 35°C±0,5°C] ou, em alguns casos, duas colunas Asahipak GS-520H [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Japão; 25×0,75 cm (diâmetro interno) mantido a 32°C]. A eluição gradiente linear foi realizada com um nível de etanol aumentando de 0% a 5% em acetato de sódio 0,05 M e tampão sulfato de sódio 0,40 M (pH 4,85; tampão acetato-sulfato) a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. A desaeração da solução tampão foi realizada por borbulhamento de hélio. Com base nos perfis de HPLC de HSA obtidos a partir desses procedimentos, os valores para cada fração foram submetidos a ajuste de curva numérica e as frações de HMA, HNA-1 e HNA-2 para HSA total foram calculadas.

Medições da proteína de ligação a lipossacarídeos (LBP) A LBP foi determinada a partir de amostras de soro e controles usando métodos padronizados de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), e soro de indivíduos de controle normais foi usado para variação interensaio.

Total de 8-iso-PGF2-alfa Análise As concentrações totais de 8-iso-PGF2-alfa no plasma foram medidas por um kit específico de imunoensaio enzimático (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich). As amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes foram coletados, purificados conforme indicado anteriormente e armazenados a -80°C até serem testados. As amostras foram analisadas em 50 μl após uma diluição de 1:10 ou 1:20 e lidas a 420 nm em um leitor de microplacas de 96 poços. O ensaio foi validado para obter uma alta correlação (0,95) entre quantidades conhecidas adicionadas de 8-isoprostano e a concentração medida por EIA e foi validado diretamente por cromatografia gasosa/espectrometria de massa. O anti-soro usado neste ensaio tem 100% de reatividade cruzada com 8-iso-PGF2-alfa 0,2% cada com PGF2-alfa, PGF3, PGE1, PGE2, 0,1% cada com 6-ceto-PGF1-alfa. O limite de detecção do ensaio é de 4 pg/ml e o intervalo da curva padrão foi de 3,9 a 500 pg/ml.

Medições de p-cresol total sérico e indoxil sulfato As concentrações plasmáticas de p-cresol sulfato total (PCS) e indoxil sulfato (IS) são analisadas com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Resumidamente, para competição de ligação, 200μl de soro ao qual adicionamos 20μl de ácido 1-naftalenosulfônico 0,50mM (padrão interno) foi misturado em vórtex com 250μl de octanoato de sódio 0,24M (competidor de ligação). Após incubação em temperatura ambiente por 5min, adicionamos 2ml frio acetona para precipitar proteínas. Após agitação no vórtice e centrifugação a 4 ◦C, 1860 × g por 20 min, o sobrenadante foi transferido para tubos de ensaio de vidro GL 14 de 12 mm × 100 mm e 2 ml de diclorometano foram adicionados. Após mistura em vórtice e centrifugação a 4 ◦C, 1860 × g por 10 min, 200μl da camada superior foi transferido para frascos de amostrador automático de vidro, seguido pela adição de 20μl de HCl 1M e 15μl foram injetados no HPLC. A análise HPLC foi realizada em um Agilent 1100 series LC (Santa Clara, CA), e o software Agilent ChemStations foi usado para a análise cromatográfica. A separação foi realizada em uma coluna ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC (5 μm, 3,0 mm × 150 mm) a uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min. A fase móvel A é 0,2% de ácido trifluoroacético em água Milli-Q e a fase móvel B é 0,2% de ácido trifluoroacético em acetonitrila. O método analítico consiste em uma corrida isocrática com 92% da fase móvel A por 23 min. Cada execução analítica foi seguida por um gradiente de washout de 1,3 min até 100% B. A temperatura da coluna era de 25 ◦C e a temperatura da bandeja do amostrador automático era de 6 ◦C. Quantificamos os analitos usando a proporção de analito para área de pico padrão em um detector de fluorescência de alto desempenho Agilent 1100 G1321A. As configurações do detector foram λex 260 nm/λem288nm para p-cresil sulfato e λex 280 nm/λem 390nm para indoxil sulfato e padrão interno. Os resultados quantitativos são obtidos e calculados em termos de suas concentrações (mg/L).

Força de preensão manual A força muscular é avaliada na mão dominante por meio do dinamômetro de mão Jamar (Lafayette Instrument Company, EUA). Os pacientes são primeiramente familiarizados com o aparelho e então examinados em pé com ambos os braços estendidos lateralmente ao corpo com o dinamômetro voltado para fora do corpo. Os pacientes foram instruídos a segurar o dinamômetro com a força máxima em resposta a um comando de voz, sendo considerado para o estudo o maior valor de três medidas. Valores de força de preensão manual (FPM) abaixo do percentil 30 (Tabela 2) de um valor de referência para uma população específica ajustado para idade e sexo foram considerados reduzidos [32].

Absorciometria de raios-X de dupla energia (DEXA) DEXA é um método de referência amplamente utilizado para medições corporais de MLG e FM.10 A DEXA foi realizada usando um Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI). Varreduras de corpo inteiro foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante, e corpo FM (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) e conteúdo mineral ósseo são analisados ​​usando o software do fabricante. O método DEXA utiliza um tubo de raios X com um filtro para gerar baixa energia (40 kV). e fótons de alta energia (70 ou 100 kV). Quando os fótons em diferentes níveis de energia passam pelo tecido, suas absorções podem ser expressas como uma razão de atenuação em níveis de energia mais baixos ou mais altos. A estimativa DEXA de FFM foi calculada como uma soma de LTM e estimativas de conteúdo mineral ósseo.

Todos os pacientes serão examinados pelo mesmo observador. No geral, a AWGS recomenda o uso de 2 desvios padrão abaixo da massa muscular média do grupo de referência jovem ou do quintil inferior como determinação do valor de corte. Além disso, a AWGS recomenda o uso de massa muscular esquelética ajustada à altura em vez de massa muscular esquelética ajustada ao peso, e os valores de corte sugeridos foram 7,0 kg/m2 em homens e 5,4 kg/m2 em mulheres usando DEXA.