Ureemisen sarkopenian ja mitokondrioiden kopiomäärän yhdistys ja sen kliiniset korrelaatiot

Tutkimuksen suunnittelu ja menetelmät Aiheet Tässä tutkimuksessa rekrytoimme 200 ylläpito hemodialyysipotilasta. Lisäksi kontrollina toimii 50 ikään ja sukupuoleen sopivaa henkilöä. HD-potilaat ovat olleet vakaassa dialyysissä vähintään 3 kuukautta HD-potilaita hoidetaan kolme kertaa viikossa tavallisella bikarbonaattidialyysillä (Na 138 mmol/L, HCO3 35 mmol/L, K 1,5 mmol/L, Ca 1,25 mmol/L, Mg 0,75 mmol/L) ja korkeavirtaus HD:llä synteettisillä kalvoilla (dialyysisuodattimien pinta-ala: 1,7-2,1 m2). Kaikki tutkimukseemme ilmoittautuvat HD-potilaat testataan DEXA:lla ja kädensijan vahvuudella. Väestötiedot kerätään ja laboratoriotutkimukset suoritetaan alla lueteltujen mukaisesti.

Biokemialliset määritykset Verinäytteet laboratoriotestausta varten otettiin verisuonipään laskimopäästä hemodialyysijakson alussa ja säilytettiin sitten -80 °C:ssa analyysiin asti. Erittäin herkät C-reaktiivisen proteiinin (hsCRP) tasot määritettiin kaupallisella immunoturbidimetrisellä määrityksellä käyttämällä Hitachi-autoanalyzeriä (malli 7170). CRP:n havaitsemisraja ja -väli olivat 0,1 mg/l ja 0,1-500,0 mg/l, vastaavasti. Perustason seerumin albumiini mitattiin bromikresolivihreällä menetelmällä Hitachi-autoanalysaattorilla (malli 7170). Seerumin kolesteroli-, triglyseridi- ja matala- ja korkeatiheyksisen lipoproteiinikolesterolin tasot määritettiin tavanomaisilla laboratoriomenetelmillä.

Suhteellisen leukosyyttien mtDNA-kopioluvun määritys Reaaliaikainen PCR-reaktio suoritettiin kolmena kappaleena kullekin reaktiolle. 10 ul:n PCR-reaktio sisältää 1X TaqMan Universal PCR Master Mix -puskuria, 500 nM kutakin aluketta, 200 nM TaqMan-koetinta ja 0,2-2 ng kokonaisgenomista DNA-uutetta, PCR-olosuhteet ovat 2 minuuttia 50 ℃:ssa, 10 min 95 ℃:ssa, minkä jälkeen 40 sykliä 15 s denaturointia 95 ℃:ssa ja 60 s lämpökäsittelyä/pidennystä 60 ℃:ssa. Reaaliaikainen kvantitatiivinen analyysi suoritettiin StepOne Real-Time PCR -järjestelmällä (ABI). Reaaliaikaisen PCR:n alukkeet ja koettimet on lueteltu taulukossa 1. PCR-tuotteet, jotka sisältävät mitokondrioiden DNA:ta (MtDNA) ja tuman DNA:ta.

Vakiokäyrä:

Standardi-DNA-liuokset mitokondriogenomille ja tuman 18S-rRNA-deenille (nDNA) luotiin pCR2.1-TOPO-vektoriin kloonatuista PCR-tuotteista. Sarjalaimennoksia tehtiin ja RT-QPCR-reaktiot suoritettiin standardikäyrän muodostamiseksi Ct-arvoista ja standardiplasmidi-DNA:n kopioiden lukumäärästä.

mtDNA/nDNA-suhteen määrittäminen mtDNA-sisällön mittana:

MtDNA:n ja nDNA:n kopioluku lasketaan käyttämällä kynnyssyklin numeroa (Ct) ja intrapoloimalla standardikäyrästä. MtDNA:n kopiomäärän suhde nDNA:n kopiomäärään on mtDNA-sisällön mittaus.[30] Albumiinin redox-tilan mittaus Albumiinin redox-tilan mittaus suoritettiin käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) -menetelmää, joka on raportoitu aiemmin [31]. HPLC-fluoresenssin havaitsemisjärjestelmä (HPLC-FD) koostui AS-8010 automaattisesta näytteenottimesta (injektiotilavuus, 2 ml näytettä kohti; Tosoh, Tokio, Japani) ja mallin FS-8000 fluoresenssidetektorista (virityksen aallonpituus, 280 nm; emission aallonpituus , 340 nm) CCPM-kaksoismäntäpumpulla (Tosoh) yhdessä SC-8020-järjestelmäohjaimen (Tosoh) kanssa. Shodex-Asahipak ES-502N 7C -kolonni [Showa Denko, Tokio, Japani; 10 × 0,76 cm (sisähalkaisija), dimetyyliaminoetyylimuoto ioninvaihto-HPLC:lle, kolonnin lämpötila, 35 °C ± 0,5 °C] tai joissakin tapauksissa kaksi Asahipak GS-520H -kolonnia [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Japani; 25 x 0,75 cm (sisähalkaisija) pidettiin 32 °C:ssa]. Lineaarinen gradienttieluointi suoritettiin etanolipitoisuuden noustessa 0 %:sta 5 %:iin 0,05 M natriumasetaatissa ja 0,40 M natriumsulfaattipuskurissa (pH 4,85; asetaattisulfaattipuskuri) virtausnopeudella 1,0 ml/min. Puskuriliuoksen ilmanpoisto suoritettiin heliumilla kuplittamalla. Näistä menetelmistä saatujen HSA:n HPLC-profiilien perusteella kunkin fraktion arvoille suoritettiin numeerinen käyräsovitus, ja HMA:n, HNA-1:n ja HNA-2:n fraktiot kokonais-HSA:han laskettiin.

Liposakkaridia sitovan proteiinin (LBP) mittaukset LBP määritettiin seeruminäytteistä ja kontrolleista käyttämällä standardoituja entsyymikytkentäisiä immunosorbenttimääritysmenetelmiä (ELISA) ja normaalien kontrollihenkilöiden seerumia käytettiin määritysten väliseen vaihteluun.

8-iso-PGF2-alfan kokonaisanalyysi Plasman 8-iso-PGF2-alfan kokonaispitoisuudet mitattiin spesifisellä entsyymi-immunomäärityspakkauksella (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich). Näytteet sentrifugoitiin ja supernatantit kerättiin, puhdistettiin, kuten aiemmin mainittiin, ja säilytettiin -80 °C:ssa määritykseen asti. Näytteet määritettiin 50 μl:ssa 1:10- tai 1:20-laimennoksen jälkeen ja luettiin 420 nm:ssä 96-kuoppaisella mikrolevylukijalla. Määritys on validoitu korkean korrelaation (0,95) saamiseksi lisättyjen tunnettujen 8-isoprostaanin määrien ja EIA:lla mitatun pitoisuuden välillä, ja se on validoitu suoraan kaasukromatografialla/massaspektrometrialla. Tässä määrityksessä käytetyllä antiseerumilla on 100 %:n ristireaktiivisuus 8-iso-PGF2-alfan kanssa, 0,2 % kutakin PGF2-alfan, PGF3:n, PGE1:n, PGE2:n, 0,1 % kunkin 6-keto-PGF1-alfan kanssa. Määrityksen havaitsemisraja on 4 pg/ml ja standardikäyrän alue oli 3,9 - 500 pg/ml.

Seerumin kokonais-p-kresolin ja indoksyylisulfaatin mittaukset Kokonais-p-kresolisulfaatin (PCS) ja indoksyylisulfaatin (IS) pitoisuudet plasmassa analysoidaan korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC). Lyhyesti, sitomiskilpailun vuoksi 200 µl seerumia, johon lisäsimme 20 µl 0,50 mM 1-naftaleenisulfonihappoa (sisäinen standardi), vortex-sekoitettiin 250 µl:aan 0,24 M natriumoktanoaattia (sitoutuva kilpailija). Inkubaation jälkeen huoneenlämmössä lisäsimme 2 ml kylmää asetonia proteiinien saostamiseen. Vortex-sekoituksen ja sentrifugoinnin jälkeen 4 °C:ssa, 1860 x g 20 minuuttia, supernatantti siirrettiin 12 mm x 100 mm:n lasiin, GL 14 -lasisiin koeputkiin ja 2 ml dikloorimetaania lisättiin. Vortex-sekoituksen ja sentrifugoinnin 4 °C:ssa, 1860 x g 10 minuutin ajan, 200 µl ylemmästä kerroksesta siirrettiin lasisiin automaattisiin näytteenottopulloihin, minkä jälkeen lisättiin 20 µl 1 M HCl:a ja 15 µl injektoitiin HPLC:hen. HPLC-analyysi suoritettiin Agilent 1100 -sarjan LC:llä (Santa Clara, CA), ja kromatografiseen analyysiin käytettiin Agilent ChemStations -ohjelmistoa. Erotus suoritettiin ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC-kolonnilla (5 µm, 3,0 mm x 150 mm) virtausnopeudella 0,6 ml/min. Liikkuva faasi A on 0,2-prosenttinen trifluorietikkahappo Milli-Q-vedessä ja liikkuva faasi B on 0,2-prosenttinen trifluorietikkahappo asetonitriilissä. Analyyttinen menetelmä koostuu isokraattisesta ajosta, jossa on 92 % liikkuvaa faasia A 23 minuutin ajan. Jokaista analyyttistä ajoa seurasi 1,3 minuutin pesugradientti 100 %:iin B. Kolonnin lämpötila oli 25 ◦C ja automaattisen näytteenottimen alustan lämpötila oli 6 ◦C. Kvantifioimme analyytit käyttämällä analyytin ja standardin piikkien pinta-alan suhdetta Agilent 1100 High Performance Fluorescence -detektorilla G1321A. Ilmaisimen asetukset olivat λex 260 nm/λem288nm p-kresyylisulfaatille ja λex 280 nm/λem 390 nm indoksyylisulfaatille ja sisäiselle standardille. Kvantitatiiviset tulokset saadaan ja lasketaan niiden pitoisuuksina (mg/l).

Kädensijan vahvuus Lihasvoimaa mitataan hallitsevassa kädessä Jamar-käsidynamometrillä (Lafayette Instrument Company, USA). Potilaat tutustutaan ensin laitteeseen, minkä jälkeen heidät tutkittiin seisoen, molemmat kädet ojennettuna sivuttain kehosta dynamometrin ollessa kehosta poispäin. Potilaita kehotettiin tarttumaan dynamometriin suurimmalla voimalla vastauksena äänikomennolle, ja tutkimuksessa otettiin huomioon kolmen mittauksen korkein arvo. Kädensijan lujuuden (HGS) arvot alle 30. persentiilin (taulukko 2) iän ja sukupuolen mukaan mukautetusta populaatiokohtaisesta viitearvosta katsottiin alentuneiksi [32].

Dual-Energy X-ray Absorptiometry (DEXA) DEXA on laajalti käytetty vertailumenetelmä kehon FFM- ja FM-mittauksiin.10 DEXA suoritettiin käyttämällä Lunar Prodigya (GE Medical Systems, Madison, WI). Koko kehon skannaukset tehtiin valmistajan ohjeiden mukaisesti ja kehon FM (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) ja luun mineraalipitoisuus analysoidaan valmistajan ohjelmistolla. DEXA-menetelmässä käytetään suodattimella varustettua röntgenputkea tuottamaan matalaenergiaa (40 kV). ja korkeaenergiset (70 tai 100 kV) fotonit. Kun fotonsaatin eri energiatasot kulkevat kudoksen läpi, niiden absorptiot voidaan ilmaista vaimennussuhteena pienemmällä tai korkeammalla energiatasolla. DEXA-arvio FFM:stä laskettiin LTM- ja luun mineraalipitoisuuden arvioiden summana.

Sama tarkkailija tutkii kaikki potilaat. Kaiken kaikkiaan AWGS suosittelee käyttämään 2 keskihajonnan alapuolella nuoren vertailuryhmän tai alemman kvintiilin keskimääräistä lihasmassaa raja-arvon määrittämiseen. Lisäksi AWGS suosittelee korkeussäädetyn luustolihasmassan käyttöä painosovitetun lihasmassan sijaan, ja ehdotetut raja-arvot olivat 7,0 kg/m2 miehillä ja 5,4 kg/m2 naisilla DEXAa käytettäessä.