Asociación de sarcopenia urémica y número de copias mitocondriales y sus correlatos clínicos

Diseño y métodos de investigación Sujetos En este estudio reclutaremos a 200 pacientes en hemodiálisis de mantenimiento. Además, 50 sujetos emparejados por edad y sexo actúan como controles. Los pacientes en HD han estado en diálisis estable durante al menos 3 meses Los pacientes en HD están siendo tratados tres veces por semana con diálisis de bicarbonato estándar (Na 138 mmol/L, HCO3 35 mmol/L, K 1,5 mmol/L, Ca 1,25 mmol/L, Mg 0,75 mmol/L) y HD de alto flujo con membranas sintéticas (superficie de filtros de diálisis: 1,7 a 2,1 m2). Todos los pacientes con EH que se inscriban en nuestro estudio serán evaluados con DEXA y fuerza de prensión manual. Se recopilarán datos demográficos y se llevarán a cabo exámenes de laboratorio como se indica a continuación.

Determinaciones bioquímicas Se extrajeron muestras de sangre para pruebas de laboratorio del extremo venoso de un acceso vascular al comienzo de la sesión de hemodiálisis y luego se almacenaron a -80°C hasta el momento del análisis. Los niveles de proteína C reactiva de alta sensibilidad (hsCRP) se determinaron mediante un ensayo inmunoturbidimétrico comercial utilizando un autoanalizador Hitachi (modelo 7170). El límite de detección y el intervalo para PCR fue 0,1 mg/L y 0,1-500,0 mg/l, respectivamente. La albúmina sérica basal se midió mediante el método del verde de bromocresol en un autoanalizador Hitachi (modelo 7170). Los niveles séricos de colesterol, triglicéridos y colesterol de lipoproteínas de alta y baja densidad se determinaron mediante métodos estándar de laboratorio.

Determinación del número relativo de copias de ADNmt de leucocitos La reacción de PCR en tiempo real se realizó por triplicado para cada reacción. La reacción de PCR de 10 ul contiene 1 tampón TaqMan Universal PCR Master Mix, 500 nM de cada cebador, 200 nM de sonda TaqMan y 0,2-2 ng de extracto de ADN genómico total, las condiciones de PCR son 2 min a 50 ℃, 10 min a 95 ℃, seguido de 40 ciclos de 15 s de desnaturalización a 95℃ y 60 s de recocido/extensión a 60℃. El análisis cuantitativo en tiempo real se realizó en el sistema StepOne Real-Time PCR (ABI). Los cebadores y sondas para PCR en tiempo real se enumeran en la Tabla 1. Los productos de PCR que involucran ADN mitocondrial (ADNmt) y ADN nuclear.

Curva estándar:

Se generaron soluciones de ADN estándar para el genoma mitocondrial y el deno de ARNr 18S nuclear (ADNn) a partir de productos de PCR clonados en un vector de pCR2.1-TOPO. Se realizaron diluciones en serie y se realizaron reacciones de RT-QPCR para construir la curva estándar a partir de los valores de Ct y el número de copias del ADN plasmídico estándar.

Determinación de la relación mtDNA/nDNA como medida del contenido de mtDNA:

El número de copias del mtDNA y el nDNA se calcula utilizando el número de ciclo de umbral (Ct) e intrapolando a partir de la curva estándar. La relación entre el número de copias de mtDNA y el número de copias de nDNA es la medida del contenido de mtDNA.[30] Medición del estado redox de la albúmina La medición del estado redox de la albúmina se realizó utilizando el método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) informado anteriormente [31]. El sistema de detección de fluorescencia por HPLC (HPLC-FD) constaba de un muestreador automático AS-8010 (volumen de inyección, 2 ml por muestra; Tosoh, Tokio, Japón) y un detector de fluorescencia modelo FS-8000 (longitud de onda de excitación, 280 nm; longitud de onda de emisión , 340 nm) con una bomba de doble émbolo CCPM (Tosoh) junto con un controlador de sistema SC-8020 (Tosoh). Una columna Shodex-Asahipak ES-502N 7C [Showa Denko, Tokio, Japón; 10 × 0,76 cm (diámetro interior), forma de dimetilaminoetilo para HPLC de intercambio iónico, temperatura de la columna, 35 °C±0,5 °C] o en algunos casos dos columnas Asahipak GS-520H [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Japón; 25 x 0,75 cm (diámetro interior) mantenido a 32°C]. La elución en gradiente lineal se llevó a cabo aumentando el nivel de etanol de 0 % a 5 % en tampón de acetato de sodio 0,05 M y sulfato de sodio 0,40 M (pH 4,85; tampón de acetato-sulfato) a un caudal de 1,0 ml/min. La desaireación de la solución tampón se realizó mediante burbujeo de helio. Sobre la base de los perfiles de HPLC de HSA obtenidos a partir de estos procedimientos, los valores de cada fracción se sometieron a un ajuste numérico de la curva y se calcularon las fracciones de HMA, HNA-1 y HNA-2 con respecto al HSA total.

Mediciones de la proteína de unión a liposacáridos (LBP) La LBP se determinó a partir de muestras de suero y controles utilizando métodos estandarizados de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), y se utilizó suero de sujetos de control normales para la variación entre ensayos.

Total de 8-iso-PGF2-alfa Análisis Las concentraciones totales de 8-iso-PGF2-alfa en plasma se midieron mediante un kit de inmunoensayo enzimático específico (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan). Las muestras se centrifugaron y se recogieron los sobrenadantes, se purificaron como se indicó anteriormente y se almacenaron a -80 °C hasta que se analizaron. Las muestras se analizaron a 50 μl después de una dilución 1:10 o 1:20 y se leyeron a 420 nm en un lector de microplacas de 96 pocillos. El ensayo ha sido validado para obtener una alta correlación (0,95) entre las cantidades conocidas añadidas de 8-isoprostano y la concentración medida por EIA y ha sido validado directamente por cromatografía de gases/espectrometría de masas. El antisuero utilizado en este ensayo tiene una reactividad cruzada del 100 % con 8-iso-PGF2-alfa, 0,2 % cada uno con PGF2-alfa, PGF3, PGE1, PGE2, 0,1 % cada uno con 6-ceto-PGF1-alfa. El límite de detección del ensayo es de 4 pg/ml y el rango de la curva estándar fue de 3,9 a 500 pg/ml.

Mediciones de p-cresol total en suero y sulfato de indoxil Las concentraciones plasmáticas de sulfato de p-cresol total (PCS) y sulfato de indoxil (IS) se analizan con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Brevemente, para la competencia de unión, 200 μl de suero al que agregamos 20 μl de ácido 1-naftalenosulfónico 0,50 mM (estándar interno) se mezcló en vórtex con 250 μl de octanoato de sodio 0,24 M (competidor de unión). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos, agregamos 2 ml de ácido acetona para precipitar proteínas. Después de mezclar en vórtex y centrifugar a 4 ◦C, 1860 × g durante 20 min, el sobrenadante se transfirió a tubos de ensayo de vidrio GL 14 de 12 mm × 100 mm y se agregaron 2 ml de diclorometano. Después de mezclar en vórtex y centrifugar a 4 ◦C, 1860 × g durante 10 minutos, se transfirieron 200 μl de la capa superior a viales de vidrio para automuestreador, seguido de la adición de 20 μl de HCl 1 M y se inyectaron 15 μl en la HPLC. El análisis de HPLC se realizó en un LC de la serie Agilent 1100 (Santa Clara, CA) y se utilizó el software Agilent ChemStations para el análisis cromatográfico. La separación se llevó a cabo en una columna de HPLC ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus (5 µm, 3,0 mm x 150 mm) a un caudal de 0,6 ml/min. La fase móvil A es ácido trifluoroacético al 0,2 % en agua Milli-Q y la fase móvil B es ácido trifluoroacético al 0,2 % en acetonitrilo. El método analítico consiste en una corrida isocrática con 92% de fase móvil A durante 23 min. Cada análisis fue seguido por un gradiente de lavado de 1,3 min hasta 100 % B. La temperatura de la columna fue de 25 ◦C y la temperatura de la bandeja del automuestreador fue de 6 ◦C. Cuantificamos los analitos utilizando la relación entre analito y área de pico estándar en un detector de fluorescencia de alto rendimiento Agilent 1100 G1321A. Los ajustes del detector fueron λex 260 nm/λem288nm para sulfato de p-cresilo y λex 280 nm/λem 390nm para sulfato de indoxilo y patrón interno. Los resultados cuantitativos se obtienen y calculan en términos de sus concentraciones (mg/L).

Fuerza de prensión La fuerza muscular se evalúa en la mano dominante utilizando un dinamómetro manual Jamar (Lafayette Instrument Company, EE. UU.). Los pacientes primero se familiarizan con el dispositivo y luego se examinan de pie con ambos brazos extendidos hacia los lados del cuerpo con el dinamómetro mirando hacia el lado opuesto del cuerpo. Se instruyó a los pacientes para que agarraran el dinamómetro con la fuerza máxima en respuesta a un comando de voz, y se consideró para el estudio el valor más alto de tres mediciones. Los valores de fuerza de prensión manual (HGS) por debajo del percentil 30 (Tabla 2) de un valor de referencia de población específica ajustado por edad y sexo se consideraron reducidos [32].

Absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA) DEXA es un método de referencia ampliamente utilizado para mediciones corporales de FFM y FM.10 La DEXA se realizó con un Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI). Se realizaron escaneos de todo el cuerpo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el FM corporal (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) y el contenido mineral óseo se analizan utilizando el software del fabricante. El método DEXA utiliza un tubo de rayos X con un filtro para generar baja energía (40 kV). y fotones de alta energía (70 o 100 kV). Cuando los fotones de diferentes niveles de energía pasan a través del tejido, sus absorciones se pueden expresar como una relación de atenuación a niveles de energía más bajos o más altos. La estimación DEXA de FFM se calculó como la suma de las estimaciones de LTM y contenido mineral óseo.

Todos los pacientes serán examinados por el mismo observador. En general, AWGS recomienda utilizar 2 desviaciones estándar por debajo de la masa muscular media del grupo de referencia joven o el quintil inferior como determinación del valor de corte. Además, AWGS recomienda usar masa muscular esquelética ajustada por altura en lugar de masa muscular esquelética ajustada por peso, y los valores de corte sugeridos fueron 7,0 kg/m2 en hombres y 5,4 kg/m2 en mujeres usando DEXA.