Stowarzyszenie mocznicowej sarkopenii i mitochondrialnej liczby kopii i jej korelatów klinicznych

Projekt i metody badań Osoby badane W tym badaniu zrekrutujemy 200 pacjentów poddawanych hemodializie podtrzymującej. Ponadto 50 osób dobranych pod względem wieku i płci działa jako kontrole. Pacjenci z HD są stabilnie dializowani przez co najmniej 3 miesiące Pacjenci z HD są leczeni trzy razy w tygodniu standardową dializą wodorowęglanową (Na 138 mmol/l, HCO3 35 mmol/l, K 1,5 mmol/l, Ca 1,25 mmol/l, Mg 0,75 mmol/L) oraz wysokoprzepływową HD z membranami syntetycznymi (powierzchnia filtrów dializacyjnych: 1,7 do 2,1 m2). Wszyscy pacjenci HD włączeni do naszego badania zostaną poddani testowi DEXA i siły uścisku dłoni. Zostaną zebrane dane demograficzne i przeprowadzone zostaną badania laboratoryjne, jak podano poniżej.

Oznaczenia biochemiczne Próbki krwi do badań laboratoryjnych pobierano z żylnego końca dostępu naczyniowego na początku sesji hemodializy, a następnie przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy. Wysokoczułe poziomy białka C-reaktywnego (hsCRP) określono za pomocą dostępnego w handlu testu immunoturbidymetrycznego przy użyciu automatycznego analizatora Hitachi (model 7170). Granica wykrywalności i przedział dla CRP wynosiły 0,1 mg/l i 0,1-500,0 odpowiednio mg/l. Wyjściową albuminę w surowicy mierzono metodą zieleni bromokrezolowej na autoanalizatorze Hitachi (model 7170). Poziomy cholesterolu, trójglicerydów oraz cholesterolu lipoprotein o małej i dużej gęstości w surowicy określono standardowymi metodami laboratoryjnymi.

Określenie względnej liczby kopii mtDNA leukocytów Reakcję PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono w trzech powtórzeniach dla każdej reakcji. 10 ul reakcji PCR zawiera 1 X bufor TaqMan Universal PCR Master Mix, 500 nM każdego startera, 200 nM sondy TaqMan i 0,2-2 ng całkowitego ekstraktu genomowego DNA, warunki PCR to 2 min w 50 ℃, 10 min w 95 ℃, a następnie 40 cykli po 15 s denaturacji w 95 ℃ i 60 s wyżarzania/wydłużania w 60 ℃. Analizę ilościową w czasie rzeczywistym przeprowadzono w systemie StepOne Real-Time PCR (ABI). Startery i sondy do PCR w czasie rzeczywistym wymieniono w Tabeli 1. Produkty PCR, które obejmują DNA mitochondrialne (MtDNA) i DNA jądrowe.

Krzywa standardowa:

Standardowe roztwory DNA dla genomu mitochondrialnego i jądrowego denu 18S rRNA (nDNA) wytworzono z produktów PCR sklonowanych w wektorze pCR2.1-TOPO. Wykonano seryjne rozcieńczenia i przeprowadzono reakcje RT-QPCR w celu skonstruowania krzywej standardowej z wartości Ct i liczby kopii standardowego plazmidowego DNA.

Wyznaczenie stosunku mtDNA/nDNA jako miary zawartości mtDNA:

Liczbę kopii mtDNA i nDNA oblicza się stosując progową liczbę cykli (Ct) i intrapolując z krzywej wzorcowej. Stosunek liczby kopii mtDNA do liczby kopii nDNA jest miarą zawartości mtDNA.[30] Pomiar stanu redoks albuminy Pomiar stanu redoks albuminy przeprowadzono stosując opisaną wcześniej metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) [31]. System detekcji fluorescencji HPLC (HPLC-FD) składał się z automatycznego podajnika próbek AS-8010 (objętość wstrzyknięcia, 2 ml na próbkę; Tosoh, Tokio, Japonia) i detektora fluorescencji Model FS-8000 (długość fali wzbudzenia, 280 nm; długość fali emisji , 340 nm) z pompą dwutłokową CCPM (Tosoh) w połączeniu ze sterownikiem systemu SC-8020 (Tosoh). Kolumna Shodex-Asahipak ES-502N 7C [Showa Denko, Tokio, Japonia; 10 x 0,76 cm (średnica wewnętrzna), forma dimetyloaminoetylowa do jonowymiennej HPLC, temperatura kolumny 35°C ± 0,5°C] lub w niektórych przypadkach dwie kolumny Asahipak GS-520H [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Japonia; 25 x 0,75 cm (średnica wewnętrzna) utrzymywana w 32°C]. Elucję z liniowym gradientem prowadzono ze wzrostem poziomu etanolu od 0% do 5% w 0,05 M octanie sodu i 0,40 M buforze siarczanu sodu (pH 4,85; bufor octanowo-siarczanowy) przy szybkości przepływu 1,0 ml/min. Odpowietrzenie roztworu buforowego przeprowadzono przez barbotaż helu. W oparciu o profile HPLC HSA otrzymane z tych procedur, wartości dla każdej frakcji poddano numerycznemu dopasowaniu krzywej i obliczono frakcje HMA, HNA-1 i HNA-2 do całkowitej HSA.

Pomiary białka wiążącego liposacharydy (LBP) LBP określono z próbek surowicy i kontroli, stosując standardowe metody testu immunoenzymatycznego (ELISA), a surowicę od normalnych osobników kontrolnych wykorzystano do zróżnicowania między testami.

Analiza sumy 8-izo-PGF2-alfa Całkowite stężenia 8-izo-PGF2-alfa w osoczu zmierzono za pomocą zestawu do swoistego testu immunologicznego (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan). Próbki odwirowano i supernatanty zebrano, oczyszczono jak podano wcześniej i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu oznaczenia. Próbki oznaczano w 50 μl po rozcieńczeniu 1:10 lub 1:20 i odczytywano przy 420 nm w 96-studzienkowym czytniku mikropłytek. Test został zwalidowany w celu uzyskania wysokiej korelacji (0,95) między dodanymi znanymi ilościami 8-izoprostanu a stężeniem zmierzonym metodą EIA i został bezpośrednio zwalidowany za pomocą chromatografii gazowej/spektrometrii mas. Surowica odpornościowa zastosowana w tym teście ma 100% reaktywności krzyżowej z 8-izo-PGF2-alfa, po 0,2% z PGF2-alfa, PGF3, PGE1, PGE2, po 0,1% z 6-keto-PGF1-alfa. Granica wykrywalności testu wynosiła 4 pg/ml, a zakres krzywej standardowej wynosił od 3,9 do 500 pg/ml.

Pomiary całkowitego p-krezolu i siarczanu indoksylu w surowicy Stężenia całkowitego p-krezolu (PCS) i siarczanu indoksylu (IS) w osoczu są analizowane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Pokrótce, w celu współzawodnictwa wiążącego, 200 μl surowicy, do której dodaliśmy 20 μl 0,50 mM kwasu 1-naftalenosulfonowego (wzorzec wewnętrzny) zmieszano na worteksie z 250 μl 0,24 M oktanianu sodu (konkurent wiążący). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut dodaliśmy 2 ml zimnej aceton w celu wytrącenia białek. Po wymieszaniu na worteksie i odwirowaniu w 4°C, 1860 x g przez 20 min, supernatant przeniesiono do 12mm x 100mm, szklanych probówek testowych GL 14 i dodano 2ml dichlorometanu. Po wymieszaniu z worteksem i wirowaniu w 4°C, 1860 xg przez 10 min, 200 μl górnej warstwy przeniesiono do szklanych fiolek autosamplera, następnie dodano 20 μl 1M HCl i 15 μl wstrzyknięto na HPLC. Analizę HPLC przeprowadzono na Agilent 1100 series LC (Santa Clara, CA), a do analizy chromatograficznej zastosowano oprogramowanie Agilent ChemStation. Rozdział prowadzono na kolumnie ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC (5 μm, 3,0 mm x 150 mm) przy szybkości przepływu 0,6 ml/min. Faza ruchoma A to 0,2% kwas trifluorooctowy w wodzie Milli-Q, a faza ruchoma B to 0,2% kwas trifluorooctowy w acetonitrylu. Metoda analityczna obejmuje przebieg izokratyczny z 92% fazą ruchomą A przez 23 min. Po każdym przebiegu analitycznym następował gradient wymywania przez 1,3 min do 100% B. Temperatura kolumny wynosiła 25 ◦C, a temperatura tacy autosamplera 6 ◦C. Oceniliśmy ilościowo anality, stosując stosunek powierzchni analitu do standardowego piku na detektorze fluorescencyjnym o wysokiej wydajności Agilent 1100 G1321A. Ustawienia detektora były następujące: λex 260 nm/λem288nm dla siarczanu p-krezylu i λex 280 nm/λem 390 nm dla siarczanu indoksylu i wzorca wewnętrznego. Wyniki ilościowe są uzyskiwane i obliczane w odniesieniu do ich stężeń (mg/L).

Siła uścisku dłoni Siłę mięśni ręki dominującej ocenia się za pomocą dynamometru ręcznego Jamar (Lafayette Instrument Company, USA). Pacjenci są najpierw zapoznawani z urządzeniem, a następnie badani w pozycji stojącej z obiema rękami wyciągniętymi na boki od ciała, z dynamometrem odwróconym od ciała. Pacjentów poinstruowano, aby chwycili dynamometr z maksymalną siłą w odpowiedzi na polecenie głosowe, a do badania wzięto pod uwagę najwyższą wartość z trzech pomiarów. Za zmniejszone uznano wartości siły uścisku dłoni (HGS) poniżej 30 percentyla (tab. 2) z wartości referencyjnej dla określonej populacji skorygowanej o wiek i płeć [32].

Dwuenergetyczna absorpcjometria rentgenowska (DEXA) DEXA jest szeroko stosowaną metodą referencyjną do pomiarów FFM i FM ciała.10 DEXA przeprowadzono przy użyciu Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI). Skany całego ciała przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, a FM ciała (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) i zawartość mineralną kości analizowano za pomocą oprogramowania producenta. Metoda DEXA wykorzystuje lampę rentgenowską z filtrem do generowania energii o niskiej energii (40 kV). i wysokoenergetyczne (70 lub 100 kV) fotony. Kiedy fotony o różnych poziomach energii przechodzą przez tkankę, ich absorpcję można wyrazić jako stosunek tłumienia przy niższych lub wyższych poziomach energii. Oszacowanie DEXA FFM obliczono jako sumę LTM i oszacowań zawartości mineralnej kości.

Wszyscy pacjenci będą badani przez tego samego obserwatora. Ogólnie rzecz biorąc, AWGS zaleca stosowanie 2 odchyleń standardowych poniżej średniej masy mięśniowej młodej grupy referencyjnej lub dolnego kwintyla jako wartości granicznej. Ponadto AWGS zaleca stosowanie masy mięśni szkieletowych dostosowanej do wzrostu zamiast masy mięśni szkieletowych dostosowanej do wagi, a sugerowane wartości odcięcia wynosiły 7,0 kg/m2 u mężczyzn i 5,4 kg/m2 u kobiet przy użyciu DEXA.